迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

要約

ここでは、急速にPhenoRipper、最近開発された画像解析プラットフォームを用いた蛍光顕微鏡画像の集合を分析し、探索するためのワークフローを記載している。

要約

ハイスループット顕微鏡法の急速な進歩にもかかわらず、定量的な画像ベースのアッセイは、依然として重大な課題を提起する。専門的な画像解析のさまざまなツールが利用可能であるが、最も伝統的な画像解析ベースのワークフローは、（解析パラメータの微調整のために）急な学習曲線を持っているとイメージングと解析間の長いターンアラウンド時間をもたらす。具体的には、細胞分割は、画像内の個々のセルを識別するプロセスは、この点での主なボトルネックである。

ここでは、代替、PhenoRipper、顕微鏡画像の迅速な分析と探査のために設計されたオープンソースのソフトウェアプラットフォームに基づいて、セルセグメンテーションないワークフローを紹介。ここで紹介するパイプラインは、細胞培養の免疫蛍光顕微鏡画像用に最適化されており、最小限のユーザの介入を必要としている。 30分以内に、PhenoRipperは、典型的な96ウェル実験からのデータを解析し、画像のプロファイルを生成することができる。ユーザーことができます目視、そのデータを調査、その実験に品質管理を行う、摂動に対する応答性を確保し、反復実験の再現性を確認してください。これは、アッセイの最適化の際に非常に重要である、解析と実験の間の迅速なフィードバックサイクルを容易にします。このプロトコルだけでなく、品質管理のための最初のパス解析として有用であるだけでなく、エンドツーエンドのソリューションとして使用することができる、特にスクリーニングのため。ここで説明したワークフローは、例えば、ハイスループットスクリーニングによって生成されるような大規模なデータセットに拡張し、正確に生物系の広範囲の表現型によって基実験条件に示されている。 PhenoBrowserインタフェースは、表現型の空間を探索し、生物学的な注釈に画像のプロパティを関連付けるための直感的なフレームワークを提供します。一緒になって、ここに記載されているプロトコルは、イメージベースのスクリーニングの定量分析を採用への障壁を低くします。

概要

過去10年間で、画像技術の急速な進歩は、多くのラボのハイスループット顕微鏡法を実行する能力を与えている。現在の課題は、分析の1に画像の1から移行している。どのように我々は、特性評価の比較、および、典型的なハイスループット撮像画面で生成された複雑なまだ微妙な表現型の急流を探索することができます？

画像解析と情報プラットフォームの数は、画像の大規模なコレクションからの生物学的情報を抽出するためのユーザー洗練されたツールボックスの^1-3を与えている。しかし、多くの重大な障害は、高スループットの画像ベースの画面からデータを分析するにとどまる。 （興味のあるシステムへの）イメージとアルゴリズムパラメータの微調整の適切な特徴付けを選択することに関わる困難さは、多くの場合、特に画像解析の専門知識を持たないユーザーのための長いセットアップ時間をもたらす。具体的には、細胞分割、内の個々の細胞を同定する工程n個の画像は、この点での主なボトルネックである。セグメンテーションは、細胞型、細胞密度、バイオマーカーなどの実験パラメータに非常に敏感であり、頻繁には大きなデータセットに対して繰り返し調整を必要とすることができる。これらの理由から、画像解析は、多くの場合、専門家ではなく、実験的なワークフローの一部として統合することによって実施した独立端末工程である。これは解析と実験の間の迅速なフィードバックサイクル、アッセイ開発の重要な部分を排除する。

ここでは、ハイスループット蛍光顕微鏡用に最適化され、前述の問題点の多くを回避している別のワークフローを記載している。この目的のために、我々はPhenoRipper ^4、顕微鏡画像の迅速な調査と分析のためのオープンソース·ソフトウェア·プラットフォームを利用しています。重要なことは、PhenoRipperは、単一の細胞を同定しようとしていないことにより、細胞の分割に関わる課題の多くを避けることができます。その代わり、PhenoRipperは画素に画像を分割細胞内のサイズのブロックとそこに含まれるブロック単位で画像を特徴付ける。具体的には、PhenoRipperはマーカーの共局在ベースの機能の面でブロックをプロファイルし、自動的に訓練画像の中で最も代表的なブロックタイプの⁴識別します。 PhenoRipperは、各ブロック最も類似する代表的なブロックタイプに割り当て、最終的にそれらが含むブロックの種類に基づいて画像を特徴付ける。

より伝統的な単一セルベースの​​アプローチと比較すると、このアプローチは、最小限の微調整と専門知識を必要とします。ブロックサイズと閾値強度（画像の非細胞部分を破棄すること）、グラフィカルなフィードバックが設定され、どちらも：そのように、ユーザーは二つのパラメータを設定する必要があります。重要なことに、ここで説明したワークフローは、速度と最小限の微調整が大きく、時間と信頼性の向上を提供する非常に大きなデータセットに容易に拡張する^4が示されている。実際には、我々はこのアプリがわかりローチは、両方の大きさ^は4の倍数桁のセットアップと実行に必要な時間が短縮されます。

PhenoRipperのプライマリ出力は、細胞が同様の表現型を表示させる実験条件のグループを識別することを可能にする、画像類似度を視覚的に表現したものである。一般的に見つけPhenoRipperグループ化は、より多くの時間がかかり、セル·ベースの方法⁴によって生成されたものに匹敵する「生物学的解釈可能」を持っている。実際には、これは、しばしば、典型的な96ウェル蛍光顕微鏡実験を行った30分以内に、前の画像解析経験のない実験者が彼または彼女の実験のパフォーマンスに関する信頼性の高い読み出しを得ることができることを意味する。実験者は次いで、異なる実験条件間の関係を探索を開始し、画像の表現型へのこれらの関係に関連することができる。

私たちは、効果を分析することによって、このワークフローを実証DNAや細胞骨格マーカーについて染色HeLa細胞上の異なるメカニズムのクラスにおける薬物の。薬の同じクラスで処理された細胞の画像がグループ化され、（というように、フォーカス細胞外染色のアーティファクト、）悪い品質の画像を識別し、潜在的に破棄するためにそれらが容易、外れ値として登場した。

このワークフローは、画像ベースの多数のアッセイのために有用であるが、別のアプローチは、潜在的に、より有益である可能性が明らかに多くの状況があります。例えば、PhenoRipperからの出力は、主に実験条件間での蛍光パターンの相対比較である。特定の単一細胞形質の絶対的特徴付けは、（セル内のスペックルの例えば数）の代わりに必要とされた場合、単一細胞ベースの分析が必要とされるであろう。それにもかかわらず、さらにこの種の状況において、PhenoRipperは、これらの単一細胞の表現型の変化を検出し、従って、アッセイの最適ための有用なツールである可能性が高いmization。

プロトコル

1。準備サンプルとイメージング

1. 細胞培養
   1. 日常の文化を分割し、20から70までパーセントコンフルエンスで維持する。実験前に、ある日、（材料の表を参照して、ダルベッコ改変イーグル培地）、DMEMでHeLa細胞を成長させ、10％FBS（ウシ胎児血清）および1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。
   2. 実験の日に、分割細胞は、培養（約50％コンフルエント）に成長している。
   3. 数秒間トリプシン/ EDTA（エチレンジアミン四酢酸）の約2ミリリットルに公開、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄。過剰トリプシン/ EDTAを吸引し、約3分間RTでフード内トリプシン/ EDTAの薄膜を浴びた細胞を維持する。
   4. 機械的に二度振盪フラスコ、血清添加培地で細胞を剥離。細胞を計数し、メディアの5000 cells/50μlに希釈し、すぐにうまく自動液体処理ロボット（唯一の30を使用して384ウェルガラスボトムプレートに50μL/ウェルプレートプレートのS）は、ここで使用されている。
   5. ウェル⁵内のエッジ効果を最小にするために室温で30分間プレートをインキュベートする。一晩37℃/ 5％CO ₂インキュベーター中でRTインキュベーション、場所プレートた。
   6. 各薬剤は、二重にアッセイする。プレートは、既にメディアを含む上の対応するウェルへの薬物の25を添加する。
   7. 24時間後の薬物治療におけるPBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液でプレートを固定する。
2. 染色
   ここで使用された具体的な一次抗体、蛍光標識二次抗体および他の蛍光汚れ、材料の表に示します。
   1. 透過処理3分間TBS中の0.2％トリトンX-100溶液（トリス緩衝食塩水）で細胞を固定し、TBST（トリス緩衝食塩水+ Tween 20）で3回洗浄した。ブロッキングのためTBST中5％BSA（ウシ血清アルブミン）溶液を加える。
   2. 室温で2時間プレートをインキュベートし、その後、TBSTで3回洗浄する。
   3. 一次抗体dilutを作るTBST中の5％BSA中のイオン（材料の表を参照）、/ウェル10μlを加える。室温で2時間プレートをインキュベートした後、TBSTで3回洗う。
   4. TBST中二次抗体dilutionin 5％BSAを作る（材料の表を参照）、/ウェル10μlを加える。
   5. 室温で2時間暗所に静置し、その後、TBSTで二回洗う。
   6. PBSに（材料の表を参照）ヘキストおよびファロイジンのための希釈液を調製し、同様に10μL/を追加します。
   7. RTで30分間、暗所でプレートをインキュベートする。
   8. 後の2 TBST洗浄、4℃のCO / Nの箔とストア内のカバープレート
3. イメージング
   1x1のカメラのビニングで20X対物レンズを用いた落射蛍光顕微鏡を用いて画像を取得する。 480イメージ（X3チャンネル）の合計、各ウェルのための16の画像を取得。

2。画像を分析する

ダウンロードしphenoripper.orgからPhenoRipperをインストールし、IMAの分析を開始しPhenoRipperを起動GES。 PhenoRipperは現在、TIFF、PNG、およびJPEGとMATLABでサポートされているすべての他のフォーマットを（顕微鏡のソフトウェアは、通常のTIFFにエクスポートをサポート）をサポートしています。

2.1データのロード

1. 標準的な名前付け/組織規則は、ローディングイメージと関連付けるメタデータにすることができる顕微鏡画像、存在しない（このような治療のタイプなどすなわち実験注釈を、よく数など）のワークフローの中で最も困難な部分。提示された方法（後述）のいずれかを選択します。
   1. PhenoLoader：必要に応じてファイル名および/ ​​またはディレクトリ構造（ 例えば 、B16 HeLa_Drug5-DAPI.pngイメージがよく、B16からのものであることを示している可能性があり、グループのイメージに十分な情報が含まれている場合に、データをロードし、半自動的に、このオプションを選択し、細胞を処理し、この命名規則と、うまくA1または薬物5で処理されたからすべての画像を簡単にグループ化することができる） - IDが5であり、画像は、核のDAPI染色を捕獲薬剤と。ウィザードの意志画像群とメタデータを関連付けると、次のようにマーカーを定義するためのステップバイUserステップをガイド。
      1. PhenoLoaderウィンドウにアクセスするには、「ファイル構造」をクリックします。
      2. 画像データセットを含むディレクトリを選択して「ルートディレクトリを定義」をクリックします。次に、解析（オプション、空のままにすることができます）のために使用されていないファイル（使用されていないファイル）をフィルタリングします。
      3. 実験に使用したバイオマーカーを指定し、画像とそれらを関連付けるための「マーカーの定義」をクリックします。具体的には、一意のバイオマーカーを特定し、ファイル名の一部を選択して、画像ファイルをクリックしてください。最後に、各バイオマーカーの名前を入力します。
      4. 各画像に情報を関連付けるために「メタデータを定義する」をクリックします。具体的には、画像ファイルをクリックして[画像情報（よく名の例： "B16"）を特定し、ファイル名の一部を選択します。ウィンドウには、グループ名（ 例： "を求め我LL "）の名前を入力し、ポップアップ表示されます。ファイル名から抽出されたグループのメンバーが） 例えばよく名前の完全なリスト（グループテーブルに表示されます。ファイル名に存在しない付加的な情報を追加するには、をクリックして「 （オプション）次の「追加のグループ名（ 例：入力し「メタデータグループの追加」ボタンをクリックして「薬剤」）と、事前に定義されたグループの各値（ 例えば 「ウェル」）、その値を入力します（ 例：「タキソール」） 。加えることができる付加的なグループの数に制限はない。
      5. 最後に、メタデータファイルを生成し、解析を継続して "作成Metadatafile」をクリックしてください。メタデータファイルが以前に生成された場合、上記のステップは、直接オプション（下記3に記載されている）「メタファイル」を使用してファイルをロードすることによって回避することができる。
   2. 正規表現ベースのテンプレート：正規表現は、パターンにマッチするための標準的なアプローチであるテキスト内。ファイル名および/またはディレクトリ構造は、グループのイメージに十分な情報が含まれており、命名規則は、既存のテンプレートのいずれかと一致する場合に、このオプションを選択します。正規表現に基づいたカスタムテンプレートは、手動で定義され、再使用することができる。この高度なオプションは、正規表現に精通してユーザーにお勧めします。
   3. メタデータファイル：究極のカスタマイズ性のため、このオプションを選択します。定義し、カンマ区切り値、各画像に関連付けられたファイル名やメタデータを含む（CSV）ファイルをロードします。ファイル形式の例では、Webサイト（phenoripper.org）のダウンロード部分で提供されています。単純にそれに含まれる情報を表示するインタフェースを介してファイルをロードします。
2. 冗長なサンプリングを避けるために、実験での反復を定義するメタデータフィールドを選択します。 IMPRでき（良くするなど ）、それらを一緒にグループ化し、複製物を（ウエル内などの全ての画像のようになります）が含まれているデータ·セットの場合オベパフォーマンス。ほとんどの場合、ランダムなサブセットを選択し、デフォルトのオプション「ランダム（知らない）」を選択することが合理的である。

2.2解析パラメータの設定

データセットを処理するのに必要なパラメータを定義する」に設定パラメータ」をクリックします。定義するパラメータは、左側のパネルにあります。右側のパネルには、データセットのマージされたサンプルが表示されます。異なる画像を切り替えるために、左/右の矢印をクリックしてください。

1. 閾値強度：大体のイメージの細胞部分（というよりも、バックグラウンド、非細胞領域）を識別するために、適切なしきい値を選択します。閾値はPhenoRipperによって事前に計算されるが、画像の上に利用可能なスクロールバーを使用して、細胞領域の強調表示を改善するように調整されてもよい。選択された閾値は、すべての画像にまたがって機能しない場合は、むしろ細胞領域を落とすよりも非細胞領域を含むように、しきい値を下げる。
2. ブロックSIZE：グリッドに画像をピクセル単位で適切なブロックサイズを選択してください。指定されたサイズのブロックが画像に重畳される。 20から30ブロック/セルの平均値を得るために、ブロックサイズを調整します。 「ブロックサイズ」フィールドの前にあるチェックボックスに画像クリック上にグリッドを重ね合わせる。
3. オプションのパラメータ：自動スケーリング画像は希望の相対強度を有するマーカーが表示されていない場合（ 例えば 1色が飽和している）、またはマーカーが分析からドロップする必要がある場合は、「チャネルの強さを調整」オプションを使用します。マーカーのサブセットに細胞領域を識別するために、オプションの「しきい値のために使用されるチャネル」を使用しています。他のパラメータのデフォルトの選択は、通常は十分ですが、必要であれば、「高度な解析オプション」を使用してそれらを調整します。
4. メインアプリケーションパネルの「PhenoRip」を押して、分析を実行します。 PhenoRipperは、自動的に画像内の再発のブロックタイプを識別します。表現型のプロファイルが生成されます各画像は、その中に様々なブロックタイプの分画に基づく。

3。探検結果

1. PhenoBrowser（ 図1）を使用して画像の表現型のプロファイル間の関係を探る。 PhenoBrowserインタフェースは、4つのパネルで構成されています。左上のパネルには、異なる画像/条件との間の相対的な類似性のグラフィカルな表現（散布図）、選択された条件の右側の表示のサンプル画像上の2パネル、および最後のパネル（棒グラフである）は、その表現型のプロファイルを比較します。
2. 「データ処理」メニューを使用して "空のフレームを廃棄する」。
3. 低品質の画像を削除する：第一に、個々の画像は、「データ処理」メニューからグループ化をオフに勉強する。次に、散布図における外れ値の点をクリックすると（ 例えば 、焦点のうち、染色アーティファクト）低品質の画像を破棄します。
4. データを調べる：フィールド定義のメタデータを決定し比較の基本単位（ 例えば 、薬剤を比較し、メタデータ·フィールドの値が同じ「薬物」の画像がグループ化される必要がある）。 「グループ化」を持つ単一のデータポイントにこのメタデータ·フィールドの同じ値を持つすべてのイメージを折りたたむ。例えば、薬物によるグループ化は、薬剤ごとに1ポイントを得るために、各薬剤の中に画像を平均化する。散布図に近い（または遠隔）の点は、同様の（または異なる）細胞の表現型を引き出す条件を反映している。解釈可能を支援するために利用可能なメタデータに基づいて、色やラベルの点（データ表示]メニュー）。 3Dプロットは、「回転可能」チェック·ボックスをクリックして、左ボタンをクリックして、その上でマウスをドラッグして回転可能である。
5. これらを直接比較するために2つの異なる点を選択します。画像パネルは、各ポイントのサンプル画像が表示され、バーグラフパネルは、その出現頻度が2点間の最も異なるブロックタイプが表示されます。
6. Cを起動しますブロックの種類や実験条件との関係をよりグローバルな視点を提供するために、「クラスタグラムメニュー」からlustergram。ブロックの種類と状態の両方をグループ化することによって、この表現は、最良の条件のグループ（ 図5）を区別する細胞の表現型を強調しています。

結果

ここでは、それらの作用機序に基づいてグループの薬剤に対してこのワークフローの能力を試験した。 HeLa細胞を384ウェルプレートの30ウェルに播種し、DNA /アクチン/α-チューブリンについて染色した。使用された具体的な一次抗体、蛍光標識二次抗体、および他の蛍光汚れ、材料の表に示します。ウェルを三機構的クラス（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、微小管を標的化およびDNA損傷）24?...

ディスカッション

ここで説明するワークフローは、迅速かつ簡単に特性評価と顕微鏡画像の比較を可能にする。まず、このワークフローを迅速顕微鏡画像上の品質管理を行うことで、例えば、実験の最適化を助けることができる方法を説明しました。次に、我々は、ハイスループットスクリーニングデータを解析するための可能性を実証：我々は、それらの作用機序に基づいてグループ薬物することができた?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, High Glucose	Invitrogen	11965	High Glucose, L-Glutamine
Marker Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock
Marker phalloidin-Alexa488	Invitrogen	A12379	Conjugated phallotoxin, dilution 1:200
Primary Antibody α-tubulin	Sigma	T9026	Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200
Secondary Antivody anti-Mouse TRITC	Jackson	115-025-166	Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol
Aldosterone			concentration used :0.2 μM
Apicidin			concentration used :20 μM
Colchicine			concentration used :0.16 μM
Cortisol			concentration used :0.2 μM
Dexamethasone			concentration used :0.2 μM
Docetaxel			concentration used :0.2 μM
M344			concentration used :20 μM
MS-275			concentration used :5 μM
Nocodazole			concentration used :0.3 μM
Prednisolone			concentration used :0.2 μM
RU486			concentration used :0.2 μM
Scriptaid			concentration used :70 μM
Taxol			concentration used :0.3 μM
Trichostatin A			concentration used :0.2 μM
Vinorelbine			concentration used :0.3 μM