Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Riepilogo

Qui si descrive un flusso di lavoro per la rapida analizzare ed esplorare le collezioni di immagini di microscopia a fluorescenza utilizzando PhenoRipper, una piattaforma di analisi delle immagini sviluppato di recente.

Abstract

Nonostante i rapidi progressi nella microscopia a high-throughput, saggi basati su immagini quantitativi pongono ancora sfide significative. Mentre una varietà di strumenti di analisi di immagine specializzati sono disponibili, la maggior parte dei flussi di lavoro basati-image-analisi tradizionali hanno curve di apprendimento ripide (per la messa a punto dei parametri di analisi) e determinano tempi lunghi di consegna tra imaging e di analisi. In particolare, la segmentazione delle cellule, il processo di identificazione di cellule individuali in un'immagine, è un serio ostacolo al riguardo.

Qui vi presentiamo un supplente, workflow cellulare privo di segmentazione basata su PhenoRipper, una piattaforma software open-source progettato per l'analisi rapida ed esplorazione di immagini di microscopia. Il gasdotto qui presentato è ottimizzato per le immagini di microscopia di immunofluorescenza su colture cellulari e richiede un intervento minimo da parte dell'utente. Dopo mezz'ora, PhenoRipper può analizzare i dati da un tipico esperimento 96 pozzetti e generare profili immagine. Gli utenti possonopoi esplorare visivamente i dati, effettuare il controllo di qualità sul loro esperimento, garantire una risposta alle perturbazioni e verificare la riproducibilità dei replicati. Questo facilita un ciclo di feedback rapido tra analisi e sperimentazione, che è fondamentale durante l'ottimizzazione del dosaggio. Questo protocollo è utile non solo come una prima analisi pass per il controllo di qualità, ma anche può essere usato come una soluzione end-to-end, in particolare per lo screening. Il flusso di lavoro qui descritto scalabile per grandi insiemi di dati come quelli generati da schermi high-throughput, e ha dimostrato di condizioni sperimentali raggruppare fenotipo con precisione su una vasta gamma di sistemi biologici. L'interfaccia PhenoBrowser fornisce un quadro intuitivo per esplorare lo spazio fenotipica e si riferiscono immagine proprietà alle annotazioni biologiche. Nel loro insieme, il protocollo qui descritto abbasserà le barriere per l'adozione di analisi quantitativa di schermi immagini based.

Introduzione

Negli ultimi dieci anni, i rapidi progressi nella tecnologia di imaging hanno dato molti laboratori la capacità di effettuare la microscopia high-throughput. La sfida è ora spostato da una delle immagini di una delle analisi. Come possiamo caratterizzare, confrontare ed esplorare il torrente di complessi fenotipi ancora sottili generati da uno schermo di immagini high-throughput tipico?

Un certo numero di piattaforme di image-analisi e informatici hanno dato degli utenti toolbox sofisticati ^1-3 per l'estrazione di informazioni biologiche da grandi raccolte di immagini. Eppure molti ostacoli significativi rimangono in analisi dei dati da schermi basati su immagine high-throughput. Difficoltà coinvolti con la scelta di opportune caratterizzazioni delle immagini e messa a punto dei parametri algoritmici (il sistema di interessi) spesso sfociano in lunghi tempi di installazione, in particolare per l'utente meno esperto l'analisi delle immagini. In particolare, la segmentazione delle cellule, il processo di identificazione di cellule individuali in unimmagine n, è un serio ostacolo al riguardo. La segmentazione può essere molto sensibili a parametri sperimentali, quali tipo di cellula, densità cellulare e bio-marcatori, e richiede frequentemente regolazione ripetuta per un grande insieme di dati. Per queste ragioni, analisi di immagine è spesso un passo terminale indipendente eseguita da specialisti piuttosto che una parte integrata del flusso di lavoro sperimentale. Questo preclude il ciclo di feedback rapido tra analisi e sperimentazione, una parte cruciale di sviluppo di analisi.

Qui si descrive un flusso di lavoro alternativo che è ottimizzato per high-throughput microscopia a fluorescenza ed evita molte delle difficoltà di cui sopra. A tal fine, ci avvaliamo di PhenoRipper ^4, una piattaforma software open-source per una rapida esplorazione e l'analisi di immagini di microscopia. Significativamente, PhenoRipper evita molti dei problemi connessi con la segmentazione delle cellule, non tentare di identificare le singole cellule. Invece, PhenoRipper divide le immagini in pixelblocchi di dimensione subcellulare e caratterizza immagini in termini di blocchi che contengono. In particolare, PhenoRipper profili blocchi in termini di-base di colocalizzazione-marcatori caratteristiche e automaticamente identifica ⁴ tipi più rappresentativi di blocco nelle immagini di formazione. PhenoRipper poi assegna a ciascun blocco il tipo di blocco rappresentante più simile, e caratterizza finalmente immagini basate sui tipi di blocchi che contengono.

Rispetto agli approcci basati su celle singole-più tradizionali, questo approccio richiede la messa a punto minimo e competenza. Come tale, gli utenti devono solo impostare due parametri: la dimensione del blocco e una intensità soglia (per eliminare le parti non cellulari di un'immagine), entrambi i quali sono fissato con feedback grafico. È importante sottolineare che il flusso di lavoro qui descritto è stato dimostrato da ⁴ a scalare facilmente ai set di dati molto più grandi, dove la velocità e la messa a punto minima fornisce grande tempo e guadagni di affidabilità. In pratica, troviamo che questa appscarafaggio riduce il tempo necessario sia per la configurazione e l'esecuzione da parte di più ordini di grandezza ^4.

L'output primario di PhenoRipper è una rappresentazione visiva di immagine somiglianza, che consente all'utente di identificare gruppi di condizioni sperimentali che inducono le cellule da visualizzare fenotipi simili. I raggruppamenti PhenoRipper reperti hanno in genere comparabile "interpretabilità biologico" per quelli generati da più in termini di tempo, a base di cellule metodi ^4. In pratica, ciò significa che spesso, nel giro di mezz'ora di eseguire un tipico esperimento di microscopia a fluorescenza a 96 pozzetti, uno sperimentatore, senza esperienza immagine-analisi preventiva può ottenere una lettura affidabile sulle prestazioni del suo esperimento. Lo sperimentatore può quindi iniziare ad esplorare le relazioni tra diverse condizioni sperimentali e relative tali relazioni per fenotipi di immagine.

Dimostriamo questo flusso di lavoro qui analizzando gli effettidi farmaci in diverse classi meccanicistiche sulle cellule HeLa colorati per DNA e del citoscheletro marcatori. Immagini di cellule trattate con la stessa classe di farmaci sono stati raggruppati insieme, e le immagini di scarsa qualità (artefatti di colorazione, su cellule di fuoco e così via) è apparso come valori anomali, che li rende facili da identificare e potenzialmente scartare.

Mentre questo flusso di lavoro è utile per un gran numero di saggi basati su immagini, ci sono chiaramente molte situazioni in cui un approccio diverso potrebbe potenzialmente essere più informativo. Per esempio, l'uscita dal PhenoRipper è principalmente un rapporto relativo di pattern di fluorescenza di tutti condizioni sperimentali. Se una caratterizzazione assoluta di uno specifico tratto della cellula singolo è stato invece richiesto (ad esempio il numero di macchiettature in una cella), una singola base di cellule analisi sarebbe necessario. Tuttavia, anche in questo tipo di situazione, PhenoRipper rischia di rilevare variazioni di questi fenotipi monocellulari e quindi essere un utile strumento per dosaggio ottimalezazione.

Protocollo

1. Campioni Preparazione e Imaging

1. Coltura cellulare
   1. Split culture di routine e mantenere al 20-70% di confluenza. Un giorno prima dell'esperimento, crescere cellule HeLa in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, vedi Tabella dei Materiali) e completata con il 10% FBS (siero fetale bovino) e 1x penicillina / streptomicina.
   2. Il giorno dell'esperimento, le celle divise in crescita in coltura (circa il 50% confluenti).
   3. Lavare le cellule con PBS (Phosphate Buffered Saline), esporre a circa 2 ml di tripsina / EDTA (Etilendiammintetraacetato) per alcuni secondi. Aspirare eccesso tripsina / EDTA e mantenere le cellule immerse in una sottile pellicola di tripsina / EDTA nella cappa a temperatura ambiente per ~ 3 min.
   4. Meccanicamente scuotere fiaschi due volte e staccare le cellule con siero integrato dei media. Contare le celle e diluire a 5.000 cells/50 microlitri di media e piastra subito 50 microlitri / pozzetto su una piastra inferiore di vetro 384 pozzetti utilizzando una manipolazione liquido robot automatico (solo il 30 benes della piastra sono usati qui).
   5. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti per minimizzare gli effetti di bordo in pozzetti ^5. Dopo RT incubazione, posto piastre a 37 ° C 5% CO ₂ incubatore / notte.
   6. Ogni farmaco viene saggiata in duplicato. Aggiungere 25 ml di farmaco ai corrispondenti pozzetti sulla piastra già contenente supporti.
   7. Fissare la piastra con una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS a 24 ore dopo trattamento farmacologico.
2. Colorazione
   Gli anticorpi specifici primari, anticorpi secondari fluorescente-etichettati e altre macchie fluorescenti che sono stati utilizzati qui sono elencati nella Tabella dei Materiali.
   1. Permeabilize cellule fissate con 0,2% Triton X-100 soluzione in TBS (soluzione salina tamponata con Tris) per 3 minuti, e lavare con TBST (soluzione salina tamponata con Tris + Tween 20) 3x. Aggiungere la soluzione 5% BSA (Bovine Serum Albumin) in TBST per il blocco.
   2. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore e poi lavare con TBST 3x.
   3. Fai dilut anticorpo primarioioni a 5% BSA in TBST (vedi Tabella dei Materiali) e aggiungere 10 microlitri / pozzetto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore, e poi lavare 3x con TBST.
   4. Fai dilutionin anticorpo secondario 5% BSA in TBST (vedi Tabella dei Materiali) e aggiungere 10 microlitri / pozzetto.
   5. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 2 ore e poi lavare due volte con TBST.
   6. Preparare diluizioni per la Hoechst e falloidina (vedi Tabella dei Materiali) in PBS e aggiungere 10 microlitri / pozzetto.
   7. Incubare la piastra al buio per 30 minuti a RT.
   8. Dopo 2 lavaggi TBST, piastre di copertura in fogli e conservare a 4 ° CO / N.
3. Imaging
   Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a epifluorescenza con obiettivo 20X con la macchina fotografica 1x1 binning. Acquisire sedici immagini per ogni pozzetto, per un totale di 480 immagini (canali x3).

2. Analizzando Immagini

Scaricare e installare PhenoRipper da phenoripper.org, e lanciare PhenoRipper per iniziare l'analisi di imaGES. PhenoRipper attualmente supporta TIFF, PNG e JPEG e tutti gli altri formati supportati da MATLAB (software microscopio in genere supportano l'esportazione in TIFF).

2.1 Caricamento dei dati

1. Non esiste alcuna convenzione di denominazione / organizzazione standard per immagini di microscopia, che possono rendere il caricamento delle immagini e metadati associazione (vale a dire annotazione sperimentale come il tipo di trattamento, anche il numero e così via) la parte più impegnativa del flusso di lavoro. Scegliere uno dei metodi presentati (descritto di seguito).
   1. PhenoLoader: Scegliere questa opzione per semi-automatico caricare i dati quando il nome del file e / o la struttura di directory contengono informazioni sufficienti per immagini di gruppo, se lo desideri (es. B16 HeLa_Drug5-DAPI.png potrebbe indicare che l'immagine è di ben B16, le cellule vengono trattate con il farmaco il cui ID è 5, e l'immagine cattura la macchia DAPI nucleare - con questa convenzione di denominazione, tutte le immagini di ben A1 o trattati con Droga 5 potrebbe essere facilmente raggruppati). La procedura guidataguidare l'utente passo passo per associare metadati con gruppi di immagini e definire i marcatori come segue:
      1. Clicca su "Struttura del file" per accedere alla finestra PhenoLoader.
      2. Clicca su "Definisci Directory Root" per selezionare la directory che contiene il set di dati immagine. Poi filtrare i file che non vengono utilizzati (inutilizzato File) per l'analisi (opzionale, può essere lasciato vuoto).
      3. Clicca su "Definire indicatori" per specificare i biomarcatori utilizzati nell'esperimento e associarli con le immagini. In particolare, fare clic su un file di immagine, quindi selezionare una parte del nome del file che identifica in modo univoco i biomarcatori. Infine, immettere un nome per ogni biomarker.
      4. Clicca su "Definisci metadati" per associare le informazioni di ciascuna immagine. In particolare, fare clic su un file di immagine, e quindi selezionare una parte del nome del file informazioni identificative immagine (ad esempio "B16" per il nome bene). Una finestra chiedendo il nome del gruppo (ad esempio, "Noill ") si aprirà, inserire un nome. membri del gruppo estratto dal nome del file sarà mostrato sul tavolo di gruppo (ad esempio l'elenco completo dei nomi e). Per aggiungere ulteriori informazioni non presenti nel nome del file, fare clic su" (opzionale) Avanti ". Clicca su" Aggiungi Metadata Group ", inserire il nome del gruppo aggiuntivo (ad esempio" Drug ") e per ogni valore del gruppo predefinito (ad esempio," Well "), immettere il relativo valore (ad esempio" Taxol ") . Non c'è limite al numero di gruppi aggiuntivi che possono essere aggiunti.
      5. Infine, fare clic su "Crea MetaDataFile" per generare il file di metadati e continuare l'analisi. Se un file di metadati è stato generato in precedenza, i passaggi di cui sopra possono essere evitati caricando direttamente il file utilizzando l'opzione "File Metadata" (descritto al punto 3).
   2. Modelli Regular Expression base: espressioni regolari sono un approccio standard per la corrispondenza modellinel testo. Scegliere questa opzione se il nome del file e / o la struttura di directory contengono informazioni sufficienti per immagini di gruppo e la convenzione di denominazione corrisponde uno dei modelli pre-esistenti. I modelli personalizzati basati su espressioni regolari possono anche essere definiti e riutilizzati manualmente. Questa opzione avanzata è consigliata solo per gli utenti che hanno familiarità con le espressioni regolari.
   3. Metadati File: Scegliere questa opzione per personalizzazione finale. Definire e caricare un file di valori separati da virgola (CSV) contenente i nomi dei file e dei metadati associati ad ogni immagine. Un esempio del formato è disponibile da parte di download del sito web (phenoripper.org). Basta caricare il file tramite l'interfaccia per visualizzare le informazioni in esso contenute.
2. Selezionare il campo metadati che definiscono repliche nell'esperimento per evitare campionamento ridondante. Per i set di dati che contengono repliche (ad esempio, tutte le immagini in un pozzo dovrebbero essere simili), raggruppandole (ad esempio bene) può improve le prestazioni. Nella maggior parte dei casi è ragionevole scegliere l'opzione di default "Random (non so)" che seleziona un sottoinsieme casuale.

2.2 Impostazione Parametri di analisi

Clicca su "Impostazione dei parametri" per definire i parametri necessari per elaborare il dataset. I parametri da definire sono sul pannello di sinistra. Il pannello di destra mostra un esempio dalla fusione del dataset. Clicca sulle frecce sinistra / destra per passare tra le diverse immagini.

1. Soglia Intensità: Scegliere un valore di soglia appropriato per identificare grossolanamente le porzioni cellulari (anziché i precedenti, regioni non cellulari) di immagini. Una soglia viene precalcolata da PhenoRipper, ma può essere modificata per migliorare evidenziazione di regioni cellulari utilizzando la barra di scorrimento disponibili sopra l'immagine. Se una soglia scelta non funziona tra tutte le immagini, abbassare la soglia in modo da includere regioni non cellulari anziché cadere regioni cellulari.
2. Block Size: Scegli una dimensione del blocco appropriata (in pixel) alla rete l'immagine. Blocchi di dimensioni specificate verranno sovrapposte sull'immagine. Regolare la dimensione del blocco per ottenere una media di 20-30 blocchi / cell. Per sovrapporre la griglia sopra l'immagine clicca sulla casella di controllo davanti al campo "Block Size".
3. Parametri facoltativi: Se le immagini di auto in scala non visualizzano marcatori con intensità relative desiderato (ad esempio un colore è saturo) o se i marcatori devono essere caduto dall'analisi, usa l'opzione "Regola Intensità Channel". Per identificare regioni cellulari su un sottoinsieme di marcatori utilizzare i "Canali utilizzati soglia di" opzione. Le scelte di default di altri parametri sono di solito sufficienti, ma se necessario, regolare utilizzando le "Opzioni di analisi avanzate".
4. Eseguire l'analisi premendo il tasto "PhenoRip" sul pannello principale dell'applicazione. PhenoRipper identifica automaticamente i tipi di blocco ricorrenti nelle immagini. Verranno generati i profili fenotipici perciascuna immagine a seconda delle frazioni dei diversi tipi di blocco in esso.

3. Risultati Esplorare

1. Esplorare le relazioni tra i profili fenotipici delle immagini utilizzando la PhenoBrowser (Figura 1). L'interfaccia PhenoBrowser si compone di quattro pannelli: il pannello in alto a sinistra è una rappresentazione grafica (scatter plot) della relativa somiglianza tra immagini diverse / condizioni, i due pannelli a destra immagini campione visualizzazione di condizioni selezionate, e il pannello finale (grafico a barre ) mette a confronto i loro profili fenotipici.
2. "Scartare Frames vuote" utilizzando il menu "Data Processing".
3. Rimuovere immagini di scarsa qualità: in primo luogo, per studiare le singole immagini spegnere raggruppamento dal menu "elaborazione dati". Successivamente, fare clic attraverso i punti outlier nel grafico a dispersione ed eliminare immagini di bassa qualità (ad esempio, fuori fuoco, artefatto colorazione).
4. Esplorare i dati: Decidere quale metadati definisce campouna unità di base di confronto (ad esempio per confrontare farmaci, immagine con lo stesso valore del campo metadati "farmaco" devono essere raggruppati). Chiudi tutte le immagini con lo stesso valore di questo campo metadati in un singolo punto di dati con "Raggruppamento". Ad esempio, il raggruppamento da farmaco media le immagini all'interno di ciascun farmaco a cedere un punto per droga. Punti del diagramma a dispersione nelle vicinanze (o lontani) riflettono le condizioni che provocano fenotipi cellulari simili (o dissimili). Colori o etichette punti (menu di visualizzazione dei dati) basato su metadati disponibili per aiutare interpretabilità. La trama 3D è ruotabile facendo clic sulla casella di controllo "ruotabile" e cliccando sul tasto sinistro e trascinando il mouse su di esso.
5. Selezionare due punti diversi per confrontarli direttamente. I pannelli di immagini verranno visualizzate immagini di esempio per ogni punto, e il pannello grafico a barre mostreranno i tipi di blocco le cui frequenze evento sono più differente tra i due punti.
6. Avviare il clustergram dal menu "Clustergram" per fornire una visione più globale del rapporto tra i tipi di blocco e le condizioni sperimentali. Raggruppando entrambi i tipi e le condizioni di blocco, questa rappresentazione evidenzia i fenotipi cellulari che meglio distinguono gruppi di condizioni (Figura 5).

Risultati

Qui abbiamo testato la capacità di questo flusso di lavoro per i farmaci del gruppo in base al loro meccanismo d'azione. Cellule HeLa sono state seminate in 30 pozzetti di una piastra da 384 pozzetti e colorate per DNA / actina / α-tubulina. Gli anticorpi specifici primari, anticorpi secondari fluorescenti marcate, e altre macchie fluorescenti che sono stati utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali. Wells sono stati trattati con 15 farmaci appartenenti a tre classi meccanicistici (istone deacetilasi in...

Discussione

Il flusso di lavoro qui descritto consente la caratterizzazione e comparazione di immagini di microscopia facile e veloce. In primo luogo abbiamo dimostrato come questo flusso di lavoro può aiutare l'ottimizzazione esperimento, per esempio eseguire rapidamente il controllo di qualità sulle immagini di microscopia. Successivamente, abbiamo dimostrato il suo potenziale per l'analisi high-throughput dati di screening: siamo stati in grado di droghe raggruppare in base al loro meccanismo d'azione. Il raggruppa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, High Glucose	Invitrogen	11965	High Glucose, L-Glutamine
Marker Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock
Marker phalloidin-Alexa488	Invitrogen	A12379	Conjugated phallotoxin, dilution 1:200
Primary Antibody α-tubulin	Sigma	T9026	Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200
Secondary Antivody anti-Mouse TRITC	Jackson	115-025-166	Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol
Aldosterone			concentration used :0.2 μM
Apicidin			concentration used :20 μM
Colchicine			concentration used :0.16 μM
Cortisol			concentration used :0.2 μM
Dexamethasone			concentration used :0.2 μM
Docetaxel			concentration used :0.2 μM
M344			concentration used :20 μM
MS-275			concentration used :5 μM
Nocodazole			concentration used :0.3 μM
Prednisolone			concentration used :0.2 μM
RU486			concentration used :0.2 μM
Scriptaid			concentration used :70 μM
Taxol			concentration used :0.3 μM
Trichostatin A			concentration used :0.2 μM
Vinorelbine			concentration used :0.3 μM