Экспресс-анализ и разведка флуоресцентной микроскопии Images

Резюме

Здесь мы опишем рабочий процесс для быстрого анализа и изучения коллекций флуоресцентной микроскопии изображений с помощью PhenoRipper, недавно разработанной анализа изображений платформу.

Аннотация

Несмотря быстрого прогресса в высокой пропускной микроскопии, количественные изображений на основе анализов по-прежнему представляют значительные трудности. В то время как множество специализированных инструментов анализа изображений доступны, большинство традиционных рабочие процессы анализа изображений на основе иметь крутых кривых обучения (для тонкой настройки параметров анализа) и привести к увеличению времени оборота между визуализации и анализа. В частности, сотовый сегментация, процесс идентификации отдельных клеток в изображении, является серьезной проблемой в этом отношении.

Здесь мы представляем альтернативное, сотовый сегментации без рабочего процесса на основе PhenoRipper, в программной платформы с открытым исходным кодом, предназначенный для экспресс-анализа и исследования микроскопии изображений. Трубопровод, представленные здесь оптимизирован для иммунофлюоресценции микроскопии изображений клеточных культур и требует минимального вмешательства пользователя. В течение получаса, PhenoRipper может анализировать данные из типичного эксперимента 96-луночный и генерации профилей изображения. Пользователи могутзатем визуально исследовать свои данные, осуществлять контроль качества на их опыте, обеспечить реакцию на возмущения и проверить воспроизводимость повторах. Это облегчает быстрый цикл обратной связи между анализом и эксперимента, которая имеет решающее значение в процессе оптимизации анализа. Этот протокол полезен не только как первый проход анализа для контроля качества, но также может быть использован в качестве раствора из конца в конец, особенно для скрининга. Рабочий процесс, описанный здесь масштабируется для больших объемов данных, таких, как генерируемых экранов высокой пропускной, и было показано, что группы экспериментальных условиях по фенотипу точно в широком диапазоне биологических систем. Интерфейс PhenoBrowser обеспечивает интуитивный рамки для изучения фенотипическую пространство и относятся изображения свойства биологических аннотации. Взятые вместе, протокол, описанный здесь снизит барьеры для принятия количественный анализ изображений на основе экранов.

Введение

За последние десять лет, быстрое развитие технологий визуализации дали много лабораторий способность выполнять с высокой пропускной микроскопии. Задача теперь переместился из одного из изображений к одному из анализа. Как мы можем охарактеризовать, сравнивать и исследовать поток сложных еще тонких фенотипов порожденных типичной экране изображения с высокой пропускной?

Ряд изображений анализ и информатика платформ дали пользователям искушенным Ящики для инструментов ^1-3 для извлечения биологическую информацию от больших коллекций изображений. Тем не менее многие значительные препятствия остаются в анализе данных с картинки основе экранов высокой пропускной. Трудности, связанные с выбором соответствующих характеризации изображений и тонкой настройки алгоритмических параметров (к системе интереса) часто приводят к увеличению времени настройки, особенно для пользователей без анализа изображений экспертизы. В частности, сотовый сегментация, процесс идентификации отдельных клеток вн изображение, является серьезной проблемой в этом отношении. Сегментация может быть очень чувствительны к экспериментальных параметров, таких как тип клеток, клеточной плотности и биомаркеров, и часто требуется повторную регулировку для большого набора данных. По этим причинам, анализ изображений часто независимый, терминал шаг осуществляется специалистами, а не составной части экспериментальной рабочего процесса. Это исключает быстрый цикл обратной связи между анализом и эксперимента, важнейшей частью развития анализа.

Здесь мы опишем альтернативный рабочий процесс, который оптимизирован для высокой пропускной флуоресцентной микроскопии и позволяет избежать многих из вышеупомянутых трудностей. С этой целью мы используем PhenoRipper ^4, в программной платформы с открытым исходным кодом для быстрого разведки и анализа микроскопических изображений. Важно отметить, что PhenoRipper позволяет избежать многих проблем, связанных с сотового сегментации, не пытаясь определить отдельные клетки. Вместо этого, PhenoRipper изображение разбивается на пиксельблоки субклеточном размера и характеризует изображения в терминах блоков, которые они содержат. В частности, PhenoRipper профили блоки с точки зрения маркеров-колокализации основе особенностей и автоматически определяет ⁴ самых представительных типов блоков в тренировочных образов. PhenoRipper затем присваивает каждому блоку наиболее близки типа представитель блока, и, наконец, характеризует изображений на основе типов блоков, которые они содержат.

По сравнению с более традиционными одноклеточные подходов, этот подход требует минимального тонкой настройки и опыт. Таким образом, пользователям необходимо только установить два параметра: размер блока и порог интенсивности (для отмены неклеточного частей изображения), оба из которых устанавливаются с графическим обратной связи. Важно отметить, что рабочий процесс, описанный здесь, как было показано ⁴ легко масштабировать, чтобы значительно большими объемами данных, где скорость и минимальная подстройка обеспечивает большое время и прибыль надежности. На практике мы видим, что это приложениеплотва сокращает время, необходимое как для настройки и запуска по нескольким порядков ^4.

Основной выход из PhenoRipper это визуальное представление сходства изображения, что позволяет пользователю определить группы экспериментальных условиях, которые вызывают клетки для отображения сходные фенотипы. Группировки PhenoRipper находит обычно имеют сравнимую «биологический интерпретируемость" для тех, порожденная наиболее трудоемких, методов на основе клеток ^4. На практике это означает, что часто, в течение получаса выполнения типичный эксперимент флуоресцентной микроскопии 96-а, экспериментатор без предварительного опыта анализа изображений может получить надежный отсчет о производительности его или ее опыта. Экспериментатор может начать исследовать отношения между различных экспериментальных условиях, касающийся этих отношений, чтобы изображения фенотипов.

Мы демонстрируем этот рабочий процесс здесь, анализируя последствиянаркотиков в различных механических занятий по HeLa клеток, окрашенных для ДНК и цитоскелета маркеров. Изображения клеток, обработанных с тем же классу препаратов были сгруппированы вместе, и качество изображения бедные (окрашивания артефакты, из фокус-клеток и так далее) появились как выбросы, что делает их легко идентифицировать и потенциально отбросить.

В то время как этот рабочий процесс полезен для большого количества изображений на основе анализов, существует четко много ситуаций, когда другой подход потенциально может быть более информативным. Например, выход из PhenoRipper это прежде всего относительное сравнение шаблонов флуоресценции через экспериментальных условиях. Если абсолютный характеристика конкретного одной чертой клетки вместо требовалось (например количество пятен в клетке), одноклеточного на основе анализа потребуется. Тем не менее, даже в такой ситуации, PhenoRipper, вероятно, обнаружить изменения в этих одноклеточных фенотипов и поэтому быть полезным инструментом для анализа Optiзацию.

протокол

1. Подготовка проб и обработки изображений

1. Клеточные культуры
   1. Сплит культур в плановом порядке и поддерживать на 20-70% слияния. За один день до эксперимента клетки HeLa расти в среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко, см. таблицу материалов) и с добавлением 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) и 1x пенициллина / стрептомицина.
   2. В день эксперимента, сплит клетки растут в культуре (около 50% сливной).
   3. Промыть клетки с PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), подвергать его воздействию приблизительно 2 мл трипсина / EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в течение нескольких секунд. Аспирируйте избыток трипсина / EDTA и сохранить клетки купались в тонкой пленке трипсина / EDTA в шкафу при комнатной температуре в течение ~ 3 мин.
   4. Механически встряхнуть колбы дважды и отделить клетки с сыворотки дополнена СМИ. Граф клеток и разбавляют до 5000 клеток/50 мкл среды и сразу же пластине 50 мкл / лунку на 384-а со стеклянным дном пластины с использованием автоматического дозирования жидкости робота (только 30 хорошос пластины здесь используются).
   5. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы минимизировать краевые эффекты в скважинах ^5. После RT инкубация, место пластин в 37 ° C / 5% СО ₂ инкубатора в течение ночи.
   6. Каждый препарат будет в дубликатах. Добавить 25 мкл препарата в соответствующие лунки на пластину, уже содержащий СМИ.
   7. Fix тарелку с 4%-ным раствором параформальдегида в PBS при 24 ч после медикаментозного лечения.
2. Окрашивание
   Конкретные первичные антитела, флуоресцентно-меченого вторичного антитела и другие флуоресцентные пятна, которые были использованы здесь, приведены в табл материалов.
   1. Фиксированные клетки проницаемыми с 0,2% Тритон Х-100 в растворе TBS (трис-забуференный физиологический раствор) в течение 3 мин и промывают TBST (трис-буферном растворе + Твин 20) 3x. Добавить 5% раствора БСА (бычий сывороточный альбумин) в TBST для блокирования.
   2. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем промывают TBST 3x.
   3. Сделать первичный разбавлять антителионы в 5% БСА в TBST (см. Таблицу материалов) и добавить 10 мкл / лунку. Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем промывают 3 раза TBST с.
   4. Сделать dilutionin вторичные антитела 5% BSA в TBST (см. таблицу материалов) и добавить 10 мкл / лунку.
   5. Инкубируйте пластины в темноте при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем дважды промывали TBST.
   6. Приготовить разведения для Hoechst и фаллоидином (см. Таблицу материалов) в PBS и добавить 10 мкл / лунку.
   7. Инкубировать в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.
   8. После 2 TBST моет, накладки в фольге и хранить при 4 ° СО / Н.
3. Изображений
   Получение изображений с помощью эпифлюорисцентной микроскоп с использованием объектива 20X с 1x1 камеры биннинга. Приобретать шестнадцать изображений для каждой лунки, в общей сложности 480 изображений (x3 каналов).

2. Анализ изображений

Скачать и установить PhenoRipper от phenoripper.org, и запустить PhenoRipper начать анализ ИМАГЭС. PhenoRipper в настоящее время поддерживает TIFF, PNG и JPEG, а все остальные форматы, поддерживаемые MATLAB (микроскоп программное обеспечение, как правило, поддерживают экспорт в TIFF).

2.1 Загрузка данных

1. Нет стандарт именования / организация существует для микроскопии изображений, которые могут сделать загрузку изображений и связывающую метаданные (т.е. экспериментальная аннотации, такие как тип лечения, а число и так далее), наиболее сложной частью рабочего процесса. Выберите один из представленных методов (см. ниже).
   1. PhenoLoader: Выберите этот вариант, к полу-автоматически загружать данные, когда имя файла и / или структура каталога содержат достаточно информации, чтобы изображениями групп по желанию (например, В16 HeLa_Drug5-DAPI.png может означать, что изображение из скважины В16, клетки обрабатывают с наркотиками с идентификатором 5, а изображение захватывает ядерной DAPI пятно - с этого именования, все изображения от лунки A1 или обрабатывали наркотиками 5 может быть легко сгруппированы). Мастернаправлять пользователя шаг за шагом, чтобы связать метаданные со снимком групп и определить маркеры следующим образом:
      1. Нажмите на "File Structure", чтобы получить доступ к окну PhenoLoader.
      2. Нажмите на кнопку "Определить корневой каталог", чтобы выбрать каталог, содержащий изображения набора данных. Тогда фильтрации файлов, которые не используются (неиспользуемых файлов) для анализа (опционально, можно оставить пустым).
      3. Нажмите на кнопку "Определить маркеры" указание биомаркеров, используемые в эксперименте и связать их с изображениями. В частности, нажмите на файле изображения выберите часть имени файла, который однозначно идентифицирует биомаркеров. Наконец, введите имя для каждого биомаркера.
      4. Нажмите на кнопку "определяющие метаданные", чтобы связать информацию с каждого изображения. В частности, нажмите на файле изображения, а затем выберите часть имени файла идентифицирующую информацию изображения (например, "B16" для имени а). Окно с запросом на имя группы (например, «МыLL ") появится, введите имя. Члены группы, извлеченной из файла будет показан на таблице группы (например, с полным списком имен также). Чтобы добавить дополнительную информацию, не присутствующий в имени файла, нажмите кнопку" (опционально) Далее ". Нажмите на кнопку" Добавить группу метаданных ", введите дополнительный имя группы (например," Друг ") и для каждого значения предопределенного группы (например," Ну "), введите его значение (например," Таксол ") . Там нет ограничений на количество дополнительных групп, которые могут быть добавлены.
      5. Наконец, нажмите на кнопку "Создать Metadatafile" для создания файла метаданных и продолжить анализ. Если файл метаданных был ранее создан, вышеупомянутые шаги можно избежать, непосредственно загрузке файла с помощью опции "Файл метаданных" (описано в 3 ниже).
   2. На основании регулярных выражений Шаблоны: Регулярные выражения стандартный подход для сопоставления моделейв тексте. Выберите этот вариант, если имя файла и / или структура каталога содержат достаточно информации, чтобы группы изображений и именования совпадает с одним из уже существующих шаблонов. Пользовательские шаблоны на основе регулярных выражений также могут быть определены и использованы повторно вручную. Это расширенный вариант рекомендуется только для пользователей, знакомых с регулярными выражениями.
   3. Метаданные Файл: Выберите эту опцию для конечной возможности настройки. Определение и загрузить значения, разделенные запятыми файлов (CSV), содержащий имена файлов и метаданные, связанные с каждым изображением. Пример формата файла доступно на загрузки части веб-сайта (phenoripper.org). Просто загрузите файл через интерфейс для отображения содержащейся в нем информации.
2. Выберите поле метаданных, который определяет повторов в эксперименте, чтобы избежать избыточной выборки. Для наборов данных, содержащих повторов (например, все изображения в яме должен быть похож), группируя их вместе (например, хорошо) может показыОве производительность. В большинстве случаев это разумно выбрать опцию по умолчанию "Случайная (не знаю)", которая выбирает случайное подмножество.

2.2 Установка параметров анализа

Нажмите на кнопку "Установить параметры", чтобы определить параметры, необходимые для обработки набора данных. Параметры, определяющие находятся на левой панели. Правая панель отображает объединенный образец набора данных. Нажмите на стрелки влево / вправо для переключения между различными изображениями.

1. Порог Интенсивность: Выберите подходящий пороговое значение, примерно определить клеточные части (а не фон, неклеточного регионы) изображений. Порог предварительно вычисленные по PhenoRipper, но может регулироваться для улучшения выделение клеточных областей с использованием полосы прокрутки доступно на верхней части изображения. Если выбранный порог не работает во всех изображений, снизить порог с тем чтобы включить неклеточного регионы, а не падать сотовой регионы.
2. Блок SИзе: Выберите подходящий размер блока (в пикселях) к сетке изображения. Блоки указанного размера будет накладываться на изображение. Отрегулируйте размер блока для получения в среднем 20-30 блоков / клетку. Для наложения сетки на изображение нажмите на флажок перед поле "Block Size".
3. Необязательные параметры: Если авто-масштабирование картинки не отображаются маркеры с заданными относительные интенсивности (например, один цвет насыщен), или если маркеры должны быть исключены из анализа, использовать опцию "Регулировка яркости каналов". Для идентификации сотовой регионы на подмножестве маркеров использовать "каналов, используемых для Threshold" вариант. Выбор по умолчанию других параметров, как правило, достаточно, но в случае необходимости, корректировать их с помощью «Расширенный анализ Options".
4. Запустите анализ, нажав кнопку "PhenoRip" на главной панели приложения. PhenoRipper автоматически определит текущие типы блоков в изображениях. Фенотипические профили будут созданы длякаждое изображение на основе фракций различных типов блоков в нем.

3. Изучение Результаты

1. Исследуйте отношения между фенотипическими профилей изображений с помощью PhenoBrowser (рис. 1). Интерфейс PhenoBrowser состоит из четырех панелей: верхний левый панель представляет собой графическое представление (точечный график) относительного сходства между различными изображений / условий, обе панели на правой выборочных дисплей изображений выбранных условий и окончательного панели (гистограммы ) сравнивает их фенотипические профили.
2. "Отказаться от пустые рамки" с помощью меню «Обработка данных».
3. Удалить качество изображения бедных: Во-первых, изучить отдельные изображения выключить группировку из меню «Обработка данных». Затем, щелкните через выброс точек в точечной диаграммы и отбросить низкие качество изображения (например, не в фокусе, окрашивания артефакт).
4. Исследуйте данные: Решите, какие метаданные поле определяетОсновной единицей сравнения (например, сравнить наркотики, изображения с одинаковым значением поля метаданных "наркотиков" должны быть сгруппированы вместе). Свернуть все изображения с тем же значением этого поля метаданных в одну точку данных с "Group By». Например, группировка по препарата в среднем изображения в пределах каждого препарата, чтобы получить одно очко за лекарства. Объектов (или отдаленные) очков в точечной диаграммы отражают условия, которые вызывают подобные (или разнородных) клеточные фенотипы. Цвет или этикетку точки (меню отображения данных) на основе имеющихся метаданных, чтобы помочь интерпретируемость. 3D Сюжет вращается, нажав на "поворотной" флажок и нажав на левую кнопку и перемещая мышь над ним.
5. Выберите две различные точки, чтобы сравнить их непосредственно. Образ панели будет отображаться примеры изображений для каждой точки, и гистограмма панели отображаются типы блоков, чьи появление частоты самые разные между двумя точками.
6. Запустите Clustergram в меню "Clustergram" для обеспечения более глобальный взгляд на отношения между типами блоков и условий эксперимента. Группировка обоих типов блоков и условия, это представление подчеркивает клеточные фенотипы, которые лучше всего отличают группы условий (рис. 5).

Результаты

Здесь мы проверили способность этого рабочего процесса группировать препаратов на основе механизма их действия. HeLa клетки высевали в 30 лунки 384-луночный планшет и окрашивают для ДНК / актина / α-тубулина. Конкретные первичные антитела, флуоресцентно меченные вторичные антитела, и други...

Обсуждение

Рабочий процесс, описанный здесь позволяет быстро и легко характеристику и сравнение микроскопии изображений. Мы впервые продемонстрировали, как это рабочий процесс может помочь оптимизации эксперимента, например, быстро обеспечения контроля качества на микроскопии изображений. Да?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, High Glucose	Invitrogen	11965	High Glucose, L-Glutamine
Marker Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock
Marker phalloidin-Alexa488	Invitrogen	A12379	Conjugated phallotoxin, dilution 1:200
Primary Antibody α-tubulin	Sigma	T9026	Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200
Secondary Antivody anti-Mouse TRITC	Jackson	115-025-166	Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol
Aldosterone			concentration used :0.2 μM
Apicidin			concentration used :20 μM
Colchicine			concentration used :0.16 μM
Cortisol			concentration used :0.2 μM
Dexamethasone			concentration used :0.2 μM
Docetaxel			concentration used :0.2 μM
M344			concentration used :20 μM
MS-275			concentration used :5 μM
Nocodazole			concentration used :0.3 μM
Prednisolone			concentration used :0.2 μM
RU486			concentration used :0.2 μM
Scriptaid			concentration used :70 μM
Taxol			concentration used :0.3 μM
Trichostatin A			concentration used :0.2 μM
Vinorelbine			concentration used :0.3 μM