Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Resumo

Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho para rapidamente analisar e explorar coleções de imagens de microscopia de fluorescência usando PhenoRipper, uma plataforma de análise de imagem recentemente desenvolvido.

Resumo

Apesar de rápidos avanços na microscopia de alto rendimento, ensaios baseados em imagem quantitativos ainda representam desafios significativos. Embora uma variedade de ferramentas de análise de imagem especializados estão disponíveis, a maioria dos fluxos de trabalho baseados em imagem-análise tradicionais têm curvas de aprendizado íngremes (para ajuste fino dos parâmetros da análise) e resultar em longos tempos de resposta entre imagem e análise. Em particular, a segmentação das células, o processo de identificação de células individuais de uma imagem, é um importante ponto de estrangulamento, a este respeito.

Apresentamos aqui, um fluxo de trabalho livre de segmentação de células-alternativo baseado em PhenoRipper, uma plataforma de software de código aberto projetado para a análise e exploração de imagens de microscopia rápida. O gasoduto apresentado aqui é otimizada para imagens de microscopia de imunofluorescência de culturas celulares e exige intervenção mínima do usuário. Dentro de meia hora, PhenoRipper pode analisar os dados a partir de um típico de 96 poços experimental e gerar perfis de imagem. Os usuários podemem seguida, explorar visualmente os seus dados, realizar o controle de qualidade em sua experiência, garantir uma resposta às perturbações e verificar a reprodutibilidade de repetições. Isso facilita um ciclo de feedback rápido entre análise e experiência, o que é crucial durante a otimização do ensaio. Este protocolo é útil não apenas como uma análise de primeira passagem para o controlo de qualidade, mas também pode ser usado como uma solução de ponta-a-ponta, especialmente para o rastreio. O fluxo de trabalho descrito aqui dimensionado para grandes conjuntos de dados, tais como os gerados por telas de alto rendimento, e tem sido demonstrado que grupos de condições experimentais pelo fenótipo com precisão ao longo de uma vasta gama de sistemas biológicos. A interface PhenoBrowser fornece uma estrutura intuitiva para explorar o espaço fenotípica e relacionar as propriedades de imagem para anotações biológicas. Tomados em conjunto, o protocolo descrito aqui vai diminuir as barreiras para a adoção de análise quantitativa de telas de imagem baseado.

Introdução

Ao longo da última década, os avanços rápidos na tecnologia de imagem têm dado muitos laboratórios a capacidade de realizar microscopia de alto rendimento. O desafio agora mudou de uma das imagens de uma das análises. Como podemos caracterizar, comparar e explorar a torrente de fenótipos ainda sutis complexas geradas por uma tela de imagem típico de alto rendimento?

Um número de imagem de análise e de informática plataformas deram usuários caixas de ferramentas sofisticadas ^1-3 para a extração de informação biológica de grandes coleções de imagens. No entanto, muitos obstáculos significativos permanecem na análise de dados de telas com base em imagens de alto rendimento. Dificuldades com a escolha de caracterizações adequadas das imagens e ajuste fino de parâmetros algorítmicos (para o sistema de juros) muitas vezes resultam em longos tempos de preparação, especialmente para usuários sem conhecimentos de análise de imagem. Em particular, a segmentação das células, o processo de identificação de células individuais numaimagem n, é um gargalo importante a este respeito. A segmentação pode ser altamente sensível aos parâmetros experimentais, tais como tipo de célula, a densidade celular e bio-marcadores, e frequentemente requer ajuste repetido para um grande conjunto de dados. Por estas razões, a análise de imagem é muitas vezes um passo independente, o terminal realizadas pelos especialistas, em vez de uma parte integrada do fluxo de trabalho experimental. Isto impede o ciclo de feedback rápido entre análise e experiência, uma parte crucial do desenvolvimento do ensaio.

Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho alternativo que é otimizado para a microscopia de fluorescência de alto rendimento e evita muitas das dificuldades acima mencionadas. Para isso, fazemos uso de PhenoRipper ^4, uma plataforma de software de código aberto para a exploração e análise de imagens de microscopia rápida. Significativamente, PhenoRipper evita muitos dos desafios envolvidos com a segmentação celular por não tentar identificar células individuais. Em vez disso, PhenoRipper divide a imagem em pixelsblocos de tamanho sub-celular e caracteriza imagens em termos de blocos que contêm. Especificamente, PhenoRipper perfis blocos em termos de co-localização com base em marcadores de recursos e automaticamente identifica ^quatro tipos mais representativos do bloco nas imagens de treinamento. PhenoRipper depois atribui a cada bloco do tipo de bloco mais representativo semelhante, e, finalmente, caracteriza imagens com base nos tipos de blocos que contêm.

Comparado a-baseados em células únicas abordagens mais tradicionais, esta abordagem exige sintonia fina mínima e especialização. Como tal, os usuários só precisa definir dois parâmetros: o tamanho do bloco e uma intensidade limiar (para descartar porções alveolares de uma imagem), os quais são definidos com feedback gráfica. É importante ressaltar que o fluxo de trabalho descrito aqui foi mostrado ⁴ de escalar facilmente para conjuntos de dados muito maiores, onde a velocidade e afinação mínima fornece grande tempo e ganhos de confiabilidade. Na prática, vemos que este aplicativoroach reduz o tempo necessário tanto para a instalação e funcionamento por várias ordens de magnitude ^4.

A saída primária de PhenoRipper é uma representação visual da imagem semelhança, que permite ao usuário para identificar grupos de condições experimentais que causam as células para exibir fenótipos semelhantes. Os agrupamentos PhenoRipper encontra normalmente têm "interpretabilidade biológica" comparável com aqueles gerados por mais, os métodos baseados em células demoradas ^4. Na prática, isso significa que, muitas vezes, dentro de meia hora de realizar um típico 96 poços experimento microscopia de fluorescência, um experimentador sem experiência de imagem de análise prévia pode obter uma leitura confiável sobre o desempenho de seu experimento. O experimentador pode, então, começar a explorar as relações entre as diferentes condições experimentais e relacionando estas relações para fenótipos de imagem.

Demonstramos esse fluxo de trabalho aqui, analisando os efeitosde drogas nas aulas mecanicistas distintos sobre as células HeLa coradas para marcadores de DNA e do citoesqueleto. Imagens de células tratadas com a mesma classe de drogas foram agrupados, e imagens de baixa qualidade (artefatos de coloração, fora das células de foco e assim por diante) apareceu como discrepantes, tornando-os fáceis de identificar e, potencialmente, descartar.

Enquanto o fluxo de trabalho é útil para um grande número de ensaios com base em imagens, é evidente que existem muitas situações em que uma abordagem diferente poderia ser potencialmente mais informativa. Por exemplo, a saída de PhenoRipper é principalmente uma comparação relativa dos padrões de fluorescência em diferentes condições experimentais. Se uma caracterização absoluta de uma característica única célula específica foi necessária em vez (por exemplo, o número de manchas de uma célula), uma única célula com base na análise seria necessária. Todavia, mesmo neste tipo de situação, é provável que PhenoRipper detectar mudanças nesses fenótipos de uma única célula e, portanto, ser uma ferramenta útil para o ensaio optização.

Protocolo

1. Preparação de amostras e de imagem

1. Cultura celular
   1. Dividir culturas rotineiramente e manter a 20-70% de confluência. Um dia antes da experiência, crescer as células HeLa em DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium, ver Tabela de Materiais) e suplementado com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino) e 1x penicilina / estreptomicina.
   2. No dia do experimento, dividir células crescendo em cultura (cerca de 50% confluentes).
   3. Lavar as células com PBS (Tampão fosfato salino), expor a cerca de 2 ml de tripsina / EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) durante alguns segundos. Aspirar o excesso de tripsina / EDTA e manter as células banhadas por uma película fina de tripsina / EDTA na capa à TA durante ~ 3 min.
   4. Mecanicamente agitar frascos duas vezes e separar as células com a mídia soro suplementado. Contagem de células e diluir para 5000 células/50 l de media e placa imediatamente 50 ul / poço em uma placa de fundo de 384 poços de vidro usando um líquido manipulação robô automatizado (apenas 30 bems da placa são usadas aqui).
   5. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 30 min para minimizar os efeitos de borda em poços ^5. Após RT incubação, colocar as placas de 37 ° C / 5% de _CO2 durante a noite.
   6. Cada droga serão testados em duplicata. Adicionar 25 ul de fármaco para as cavidades correspondentes da placa contendo já mídia.
   7. Fix placa com solução de paraformaldeído 4% em PBS a 24 horas após o tratamento de drogas.
2. Coloração
   Os anticorpos específicos primários, anticorpos secundários marcados fluorescentemente e outros corantes fluorescentes que foram utilizados aqui são listados na Tabela de Materiais.
   1. Permeabilizar as células fixadas com 0,2% de Triton X-100 em solução de TBS (solução salina tamponada com Tris), durante 3 minutos, e lava-se com TBST (soro fisiológico tamponado com Tris, Tween 20 +) 3x. Adicionar a solução de 5% de BSA (Albumina de Soro Bovino) em TBST durante o bloqueio.
   2. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 2 horas e, em seguida, lavar 3x com TBST.
   3. Faça dilut anticorpo primárioiões em BSA a 5% em TBST (ver Tabela de Materiais) e adicionam-se 10 ul / poço. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 2 horas, e, em seguida, lavar 3x com TBST.
   4. Faça dilutionin anticorpo secundário 5% BSA em TBST (ver Tabela de Materiais) e adicionar 10 mL / poço.
   5. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 2 horas e, em seguida, lavar duas vezes com TBST.
   6. Preparar diluições para Hoechst e phalloidin (ver Tabela de Materiais) em PBS e adicionar 10 mL / poço.
   7. Incubar a placa no escuro durante 30 min à temperatura ambiente.
   8. Após 2 lavagens TBST, placas de cobertura em folhas e armazenar a 4 ° CO / N.
3. Imagem
   Adquirir imagens usando um microscópio de epifluorescência, utilizando objetiva de 20X com câmera 1x1 binning. Adquirir dezesseis imagens para cada bem, para um total de 480 imagens (canais x3).

2. Analisando Images

Baixe e instale PhenoRipper de phenoripper.org e lançar PhenoRipper para começar a análise de images. PhenoRipper atualmente suporta TIFF, PNG, JPEG e e todos os outros formatos suportados pelo MATLAB (software microscópio normalmente suportam exportação para TIFF).

2.1 Carregando dados

1. Não existe convenção de nomenclatura / organização padrão para imagens de microscopia, que podem fazer o carregamento de imagens e metadados associando (ou seja, anotação experimental, como tipo de tratamento, bem número e assim por diante) a parte mais desafiadora do fluxo de trabalho. Escolha um dos métodos apresentados (descrito abaixo).
   1. PhenoLoader: Escolha essa opção para semi-automaticamente carregar os dados quando o nome do arquivo e / ou estrutura de diretório contém informações suficientes para imagens de grupo se for o caso (por exemplo, B16 HeLa_Drug5-DAPI.png pode indicar que a imagem é do bem B16, as células são tratadas com a droga cujo ID é 5, ea imagem captura a mancha DAPI nuclear - com esta convenção de nomenclatura, todas as imagens do poço A1 ou tratados com drogas 5 poderiam ser facilmente agrupados). O assistenteguiar o usuário passo a passo para associar metadados com grupos de imagens e definir os marcadores da seguinte forma:
      1. Clique em "Estrutura do arquivo" para acessar a janela PhenoLoader.
      2. Clique em "Definir diretório raiz" para selecionar o diretório que contém o conjunto de dados de imagem. Em seguida, filtrar os arquivos que não são usados ​​(os arquivos não utilizados) para a análise (opcional, pode ser deixado vazio).
      3. Clique em "Definir marcadores" para especificar os biomarcadores utilizados no experimento e associá-los com as imagens. Especificamente, clique em um arquivo de imagem, em seguida, selecionar uma parte do nome do arquivo que identifica os biomarcadores. Por fim, digite um nome para cada biomarcador.
      4. Clique em "Definir Metadados" para associar informação com cada imagem. Especificamente, clique em um arquivo de imagem e, em seguida, selecionar uma parte do nome do arquivo as informações de identificação de imagem (por exemplo, "B16" para o nome também). Uma janela pedindo um nome de grupo (por exemplo, "Nósll ") irá aparecer, digite um nome. Os membros do grupo extraído do nome do arquivo será mostrado na tabela de grupo (por exemplo, a lista completa de nomes bem). Para adicionar informação adicional não presente no nome do arquivo, clique no botão" (opcional) Next ". Clique em" Adicionar metadados Grupo ", digite o nome do grupo adicional (por exemplo," Drogas ") e para cada valor do grupo pré-definido (por exemplo," Bem "), digite o seu valor (por exemplo," Taxol ") . Não há nenhum limite para o número de grupos adicionais que podem ser adicionados.
      5. Por fim, clique em "Criar MetaDataFile" para gerar o arquivo de metadados e continuar a análise. Se um arquivo de metadados foi gerado anteriormente, os passos acima podem ser evitadas por carregar diretamente o arquivo usando a opção "Metadata File" (descrito no 3 abaixo).
   2. Modelos de Expressões Regulares base: As expressões regulares são uma abordagem padrão para os padrões de correspondênciano texto. Escolha essa opção quando o nome do arquivo e / ou estrutura de diretório contém informações suficientes para imagens de grupo e a convenção de nomenclatura corresponde a um dos modelos pré-existentes. Modelos personalizados baseados on expressões regulares também definir e reutilizados manualmente. Esta opção avançada é recomendado apenas para usuários familiarizados com expressões regulares.
   3. Metadados Arquivo: Escolha essa opção para customização final. Definir e carregar um arquivo de valores separados por vírgulas (CSV) contendo nomes de arquivos e metadados associados a cada imagem. Um exemplo do formato de arquivo está disponível na parte de download do site (phenoripper.org). Basta carregar o arquivo através da interface para exibir as informações que ele contém.
2. Selecione o campo de metadados que define repetições no experimento para evitar amostragem redundante. Para conjuntos de dados que contêm repetições (por exemplo, todas as imagens em um poço deve ser semelhante), agrupando-os (por exemplo, também) pode imprdesempenho ove. Na maioria dos casos, é razoável escolher a opção padrão "aleatório (não sei)", que seleciona um subconjunto aleatório.

2.2 Definir Parâmetros de análise

Clique em "Definir parâmetros" para definir os parâmetros necessários para processar o conjunto de dados. Os parâmetros para definir estão no painel à esquerda. O painel direito exibe uma amostra do conjunto de dados resultante da fusão. Clique nas setas para a esquerda / direita para alternar entre diferentes imagens.

1. Threshold Intensidade: Escolha um valor limite apropriado para identificar cerca de porções celulares (em vez de fundo, as regiões alveolares) de imagens. Um limiar é pré-calculada pela PhenoRipper, mas pode ser modificada para melhorar o realce de regiões celulares utilizando a barra de posicionamento disponíveis na parte superior da imagem. Se um limite escolhido não funciona em todas as imagens, baixar o limiar de modo a incluir as regiões alveolares, em vez de cair regiões celulares.
2. Bloco Size: Escolha um tamanho de bloco apropriado (em pixels) a grade da imagem. Blocos de tamanho especificado será sobreposta à imagem. Ajuste o tamanho do bloco para obter uma média de 20-30 blocos / celular. Para sobrepor a grade sobre a imagem clique na caixa de seleção em frente ao campo "Tamanho do bloco".
3. Parâmetros opcionais: Se as imagens auto-escalados não exibem marcadores com intensidades relativas desejados (por exemplo, uma cor é saturada) ou se os marcadores precisam ser descartados da análise, use a opção "ajustar a intensidade Channel". Para identificar as regiões celulares em um subconjunto dos marcadores de usar os canais utilizados "Limiar para" opção. Opções padrão de outros parâmetros geralmente são suficientes, mas se necessário, ajustá-los usando as "Opções avançadas de análise".
4. Executar a análise com a tecla "PhenoRip" no painel principal do aplicativo. PhenoRipper irá identificar automaticamente tipos de blocos recorrentes nas imagens. Perfis fenotípicos serão gerados paracada imagem com base nas fracções de diferentes tipos de blocos na mesma.

3. Resultados Explorando

1. Explorar as relações entre os perfis fenotípicos das imagens utilizando o PhenoBrowser (Figura 1). A interface PhenoBrowser consiste em quatro painéis: o painel superior esquerdo é uma representação gráfica (gráfico de dispersão) da semelhança relativa entre diferentes imagens / condições, os dois painéis sobre as imagens de amostra mostrador direito de condições seleccionadas e do painel final (gráfico de barras ) compara os perfis fenotípicos.
2. "Descartar Frames vazios" usando o menu "Processamento de Dados".
3. Remover imagens de baixa qualidade: Primeiro, para estudar imagens individuais desativar o agrupamento a partir do menu "Processamento de Dados". Em seguida, clique através dos pontos de outlier no gráfico de dispersão e descartar imagens de baixa qualidade (por exemplo, fora de foco, artefato de coloração).
4. Explorar os dados: Decida quais metadados campo defineuma unidade de base de comparação (por exemplo, para comparar as drogas, as imagens com o mesmo valor do campo de metadados "droga" precisa ser agrupados). Recolher todas as imagens com o mesmo valor deste campo de metadados em um único ponto de dados com o "Group By". Por exemplo, o agrupamento por droga, em média, as imagens dentro de cada droga para produzir um ponto por droga. Pontos no gráfico de dispersão próximos (ou distantes) refletem as condições que provocam fenótipos celulares semelhantes (ou diferentes). Cor ou etiqueta pontos (menu de exibição de dados) com base em metadados disponíveis para ajudar interpretabilidade. O enredo 3D é rotativo, clicando na caixa de seleção "rotativo" e clicando no botão esquerdo e arraste o mouse sobre ele.
5. Selecione dois pontos diferentes para compará-los diretamente. Os painéis de imagem irá exibir imagens de amostra para cada ponto, eo painel de gráfico de barras vai mostrar os tipos de blocos cuja ocorrência freqüências são mais diferentes entre os dois pontos.
6. Lançamento do clustergram do menu "clustergrama" para fornecer uma visão mais global da relação entre os tipos de blocos e condições experimentais. Ao agrupar os dois tipos e condições de bloco, esta representação destaca os fenótipos celulares que melhor distinguem grupos de condições (Figura 5).

Resultados

Aqui nós testamos a capacidade de fluxo de trabalho para este grupo de drogas com base no seu mecanismo de ação. As células HeLa foram semeadas em 30 cavidades de uma placa de 384 cavidades e coradas para ADN / actina / α-tubulina. Os anticorpos específicos primários, anticorpos secundários marcados fluorescentemente, e outras manchas fluorescentes que foram utilizados são listados na Tabela de Materiais. Os poços foram tratadas com 15 medicamentos pertencentes a três classes mecanicistas (inibindo histonades...

Discussão

O fluxo de trabalho descrito aqui permite a caracterização e comparação de imagens de microscopia fácil e rápido. Primeiro, demonstrou como esse fluxo de trabalho pode ajudar a otimização experiência, por exemplo, realizando rapidamente o controle de qualidade em imagens de microscopia. Em seguida, demonstrou seu potencial para a análise de dados high-throughput screening: fomos capazes de drogas do grupo com base em seu mecanismo de ação. O agrupamento de drogas foi comparável à observada usando métodos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, High Glucose	Invitrogen	11965	High Glucose, L-Glutamine
Marker Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock
Marker phalloidin-Alexa488	Invitrogen	A12379	Conjugated phallotoxin, dilution 1:200
Primary Antibody α-tubulin	Sigma	T9026	Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200
Secondary Antivody anti-Mouse TRITC	Jackson	115-025-166	Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol
Aldosterone			concentration used :0.2 μM
Apicidin			concentration used :20 μM
Colchicine			concentration used :0.16 μM
Cortisol			concentration used :0.2 μM
Dexamethasone			concentration used :0.2 μM
Docetaxel			concentration used :0.2 μM
M344			concentration used :20 μM
MS-275			concentration used :5 μM
Nocodazole			concentration used :0.3 μM
Prednisolone			concentration used :0.2 μM
RU486			concentration used :0.2 μM
Scriptaid			concentration used :70 μM
Taxol			concentration used :0.3 μM
Trichostatin A			concentration used :0.2 μM
Vinorelbine			concentration used :0.3 μM