JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המעבדה שלנו פיתחה הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide, מערכת הידרוג'ל דינמית, כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של ויסות רקמות נוקשות על תפקוד תא. כאן, אנו מספקים שרטוטים, תיאור, ופרוטוקולים להכנת הידרוג אלה.

Abstract

Mechanobiology הוא תחום מדעי מתפתח העוסק בתפקיד הקריטי של רמזים פיזיים בהכוונת מורפולוגיה תא ותפקוד. לדוגמא, ההשפעה של גמישות רקמות בתפקוד תא הוא אזור מרכזי של מחקר mechanobiology כי רקמות נוקשות מודולציה עם מחלה, פיתוח, ופציעה. חומרי סטטי מחקה רקמות, או חומרים שלא ניתן לשנות את קשיחות פעם תאים מצופה, המשמשים ברובה כדי לחקור את ההשפעות של רקמות נוקשות בפונקציות תא. בעוד שהמידע שנאסף ממחקרי סטטי הוא בעל ערך, מחקרים אלה אינם מעידים על האופי הדינמי של microenvironment הסלולרי in vivo. כדי לטפל טוב יותר את ההשפעות של קשיחות דינמית על תפקוד תאים, שפיתחנו מערכת crosslinked DNA הידרוג'ל polyacrylamide (ג'לים DNA). שלא כמו מצעים דינמיים אחרים, יש לי ג'לי DNA היכולת להגדיל או להקטין בקשיחות לאחר הייצור ללא גירויים. ג'לים DNA מורכב מcrossl DNAסוגי הדיו שpolymerized לתוך עמוד השדרה polyacrylamide. הוספה והסרה של crosslinks באמצעות משלוח של גדילי דנ"א יחיד מאפשרת מרחב, בזמן, ושליטה הפיכה של גמישות ג'ל. שהראינו בדוחות קודמים שאפנון דינמי של גמישות ג'ל DNA משפיע פיברובלסטים ונוירון התנהגות. בדוח זה ווידאו, אנו מספקים סכמטי המתאר את מנגנוני crosslinking ג'ל DNA והוראות צעד אחר צעד על ג'לי DNA ההכנה.

Introduction

מצעים סטטי ודינמיים שתי קטגוריות של חומרים ביולוגיים שפותחו כדי לחקור את ההשפעות של גמישות רקמות או נוקשות בתפקוד תא. מצעי סטטי אינם מסוגלים לשנות את התכונות הפיזיות שלהם אחרי שהם מפוברקים ו / או פעם תאים מצופה. Polyacrylamide ג'לים (הרשות הפלסטינית) היו מצעים הראשונים דו ממדים, סטטי שהיו מסונתזים לחקירות mechanobiology 5,17. ג'לי הרשות הפלסטינית הם קל להכנה, זול, תכליתי, והוא יכול להיות מפוברק עם מגוון רחב של moduli אלסטי. למרות יתרונות הטכניים אלה הופכים את הרשות הפלסטינית ג'לי מצע נפוץ מיושם, מצעי סטטי אינם מעידים על האופי הדינמי של מטריצת חוץ תאית (ECM) וסביבה סלולרית המקיפה in vivo. לדוגמא, ECM עובר שינויי נוקשות כתוצאה מפגיעה, פיתוח, או מחלה. מצעים דינמיים ולכן הם העדיפו כמודלים מצע מחקה רקמות במחקרי mechanobiology 22,24,25.

סינטטי רב, דו ממדי חומרים ביולוגיים טבעיים,, תלת ממדים, סטטי, ודינמיים פותחו כדי לחקות רקמות נוקשות 1,3,6,16,23,26. כמה מצעים דינמיים דורשים חום, UV, זרם חשמלי, יונים, ושינויי pH לשנות התכונות מכאניות שלהם 2,4,7,8,12,15,16, אך גירויים אלה יכולים להגביל ביו היישום של הידרוג'ל. הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide (ג'לים DNA) הם מצעי אלסטי דו ממדים דינמיים. crosslinks DNA מאפשר לאפנון מרחב, בזמן, והפיך של ג'ל DNA נוקשות על ידי תוספת של DNA חד גדילים (ssDNA) לתקשורת או חיץ 9-11,13,14,18,21. שלא כמו ג'לי הדינמי האמור שבו גירויים מוחלים לאפנון של גמישות, ג'לים DNA מסתמך על דיפוזיה של ssDNA שימושי לשינוי של גמישות. לכן, המשטח העליון ג'ל, שבו תאים גדלים, הוא האזור הראשון המווסת בגלל o השיעוראפנון גמישות f תלוי בעובי ג'ל.

ג'לי DNA דומה לעמיתיהם ג'ל הרשות שביש להם עמוד שדרה polyacrylamide, לעומת זאת crosslinks bis-acrylamide מוחלף בcrosslinks המורכב מדנ"א (איור 1). שתי ssDNAs (SA1 וSA2) להכליא עם גדיל crosslinker (L2) כדי לפצות crosslinks DNA של ג'ל. SA1 וSA2 יש רצפים שונים ששניהם מכילים שינוי Acrydite בסוף 5'להתאגדות אפקטיבית לרשת של הרשות הפלסטינית. להכנת ג'לי, SA1 וSA2 הם polymerized בנפרד לתוך עמוד השדרה של הרשות הפלסטינית ו, לאחר מכן, SA1 וSA2 polymerized מעורבבים יחד. L2, crosslinker, מתווסף לSA1 ותערובת SA2. רצף בסיס L2 הוא משלים לשני רצפי SA1 וSA2 וL2 hybridizes עם SA1 בתוספת SA2 כדי ליצור את crosslinks DNA. גמישות ראשונית, ג'ל DNA נקבעה על ידי שני ריכוזי L2 וcrosslinking (לוחות 1 ו2). ג'לי DNA המכיל כמויות stoichiometric שווה של L2, SA1, וSA2 הוא ג'לי הנוקש בגלל SA1 וSA2 100% crosslinked ידי L2 (מיועד כג'לי 100%). ריכוזים נמוכים של תוצאת L2 בשיעור נמוך יותר של crosslinking DNA, ולכן, ג'לים DNA רך יותר. ג'לים נמוך כמו 50% crosslinked (מיועד כג'לי 50%) נבנה 9-11.

figure-introduction-2961
איור 1 crosslinking ג'ל DNA ו9-11,13,14,18,21 סכמטי uncrosslinking שלב 1:. SA1 (אדום) וSA2 (כחול) הם polymerized בנפרד לתוך עמוד השדרה polyacrylamide (שחור). לאחר פילמור, פתרונות polymerized SA1 וSA2 מעורבבים יחד. שלב 2: L2 (ירוק) הוא הוסיף וhybridizes עם SA1 בתוספת SA2 כדי ליצור את crosslinks של ג'ל. שלב 3: R2 hybridizes עם tהוא דריסת הרגל של L2. שלב 4: הכלאת דריסת רגל של R2 מניעה את הרוכסן של L2 מSA1 וSA2.

שלא כמו ג'לי הרשות הפלסטינית, ג'לים DNA יכול להקשיח ולרכך לאחר סינתזה. מסיבה זו, תאים שגודל על ג'לי DNA יכולים להיות נתונה לשינויים קשיחות דינמיות. כדי להקשיח ג'לי תא חסיד, ניתן להוסיף L2 לתקשורת והתרבות של ג'לים אחוז הנמוך כדי להגדיל את האחוז של crosslinks. כדי לרכך ג'לי תא חסיד, ניתן להסיר L2 כדי להקטין את אחוז crosslinks 10,13,21. יש L2 רצף דריסת רגל נוסף בסוף 3'לאפשר L2 לuncrosslink מSA1 וSA2 (טבלת 1). הסרת L2 מושגת על ידי הכלאה של גדיל היפוך נקרא R2. R2 הוא משלים לכל אורכו של L2 וhybridizes ראשון עם דריסת רגל L2. הכלאה דריסת רגל מניעה את הרוכסן של L2 מSA1 וSA2, אשר מבטל את crosslink ומפחית את נוקשות ג'ל.

בדוח זה ו וידאו, צעד אחר צעד הוראות ניתנות להכנת התקשות וריכוך ג'לי DNA. בעוד הכנות ג'ל 100% ו80% ​​מתוארים, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי ליצור ג'לים DNA של אחוזי crosslinked הראשוניים וסופיים אחרים. באופן כללי, ג'לי 100% ו80% ​​מוכנים, משותק על תלושי כיסוי זכוכית, פונקציונליות, וזרע עם תאים. L2 מתווסף לתקשורת של 80 ג'לי% וR2 מתווסף לתקשורת של 100 ג'לי%, 48 שעות לאחר ציפוי. התוספת של L2 לתקשורת מקשיחה 80 ג'לי% ל100% crosslinked, ואילו התוספת של R2 לתקשורת מרככת 100 ג'לי% 80% crosslinked. ג'לים התקשח יועדו כ80 → 100 ג'לי% וג'לים התרכך יועדו כ100 → 80 ג'לי% בטקסט. לשליטה או ג'לים סטטי, ssDNA בהיקף של Ts או כפי שנמסר למערכת נוספת של 100% ו80 ג'לי%. לאחר מינימום של שני ימים הבאים אפנון גמישות, יכולים להיות מעובד תאים ונותחו.

crosslink DNA # של בסיסים רצף (דריסת רגל) שינוי (T מ ', ° C) טמפרטורת התכה תגובות
5 '→ 3'
עיצוב 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'Acrydite 34.9
SA2 10 GTC AGA ATG 5 'Acrydite 23.6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 רצף דריסת רגל 10 נ"ב כלול.
R2 30 TAG CAA GTG CGC ACC TTT gcg TCA GAA TGA R2 הוא משלים לL2
עיצוב 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'Acrydite 46.9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 דריסת רגל רצף נ"ב 12 כלולה.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG 65.9 R2 הוא משלים לL2
Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'Acrydite 55
SA2 20 TAG GCT CAT GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56.6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 דריסת הרגל אינה כלולה.
בקרה בקרה 20-40 AAA AAA (וכו ') או
TTT TTT (וכו ')
יפ-together.within-page = "תמיד">

.1 רצפי בסיס השולחן לssDNA 9-11,13,14,18,21. נייד ומחקרים מכאניים נצלו כמה דעיצובי crosslink ifferent ליצור ג'לי DNA עם מגוון רחב של תכונות מכאניות סטטי ודינמיות. הפרמטרים מווסת בעיצוב crosslink הם רצף בסיס ואורך רצף או אורך crosslink. גופנים מודגש ונטויים להמחיש זיווג בסיס בין SA1 וL2 ובין SA2 וL2, בהתאמה.

עיצוב
1 2 3
ריכוז acrylamide (%) 10 10 10 4
SA1 בתוספת SA2 הכלאה לL2 (% crosslinked) 50 80 100 50 80 100 100 100
אלסטיות (kPa, ממוצע ± SEM) 6.6 ± 0.6 17.1 ± 0.8 29.8 ± 2.5 5.85 ± 0.62 12.67 ± 1.33 22.88 ± 2.77 25.2 ± 0.5 10.4 ± 0.6

לוח 2: מודול יאנג (E) של ג'לים DNA 9-11,13,14,18,21. ריכוז Acrylamide, אחוז crosslink, ואורך crosslink יכול להיות מווסת בג'לים DNA. יש עיצובים 1, 2, ו -3 20, 28, ו40 אורכי crosslink נ"ב, בהתאמה. יש לי 100 ג'לי% עבור כל העיצובים moduli דומה המצביע על אורך crosslink אינו משפיע על אלסטיות ג'ל. עם זאת, שינויים בריכוז acrylamide לשנות גמישות ג'ל DNA.

Protocol

הערה: כל הפרוטוקול מהכנת ג'ל לעיבוד תאים לוקח מינימום של שישה ימים. זמן משוער להכנת ג'ל הוא 8 שעות בתוספת O / דגירה N. זמן משוער לקיבוע ג'ל וחישול DNA הוא 8 שעות בתוספת צעד O / N שטיפה. זמן משוער לfunctionalization ג'ל הוא 2 שעות. זמן לציפוי תא וצמיחה תלוי בסוג התרבות ויישום, אבל מינימום של ארבעה ימים נדרש.

.1 הכנת ג'לי DNA

הערה: הכן ג'לי DNA בשלושה שלבים מובחנים. ראשית, באופן אישי לפלמר SA1 וSA2 ssDNA לתוך עמוד השדרה של הרשות הפלסטינית. פתרונות אלה נקראים פתרון SA1 polymerized ופתרון polymerized SA2, בהתאמה (§1.1). שנית, לפזר את crosslinker, גדיל הפיך, וssDNAs שליטה. ממיסים את L2 ssDNA lyophilized (crosslinker). זה נקרא 100% פתרון L2 ומשמש לפברק 100 ג'לי% (§1.2). לדלל aliquot של 100% פתרון L280%. זה נקרא 80% פתרון L2 ומשמש לפברק 80 ג'לי%. לפזר lyophilized R2 (גדיל הפיך) והשליטה ssDNA להשתמש בסעיף 4. שלישית, לערבב SA1 פתרון polymerized, פתרון polymerized SA2, ו100% או 80% פתרון L2 על יחס של 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) ליצירת ג'לים 100% ו80%, בהתאמה. (§1.3).

.1 הכנת פתרונות polymerized SA1 וSA2

  1. בחר ולהורות על SA1 המתאים, רצפי בסיס SA2, L2, וR2 מלוחות 1 ו -2. רצפי בסיס ואורך רצף היו מותאמים בדוחות קודמים 9-11,13,14.
  2. לחשב את כל הניסוחים הפתרון (לוחות 3-4). הערה: חישובי מסמך בקפידה למטרות פתרון בעיות. בנייה של תבנית Excel מומלצת וניתן להשתמש בם שוב ושוב להכנת ג'ל DNA. אנא ראה לוחות 3 ו -4 לדוגמה לליווח ל2 עיצוב (לוחות 1 ו -2). הכרכים מפורטים בטבלה 4 יהיו בשימוש בכל פרוטוקול זה אבל כרכים ישתנו עם כל aliquot של ssDNA lyophilized.
פתרון ריכוז מאגר הפתרון אחוז מניות הפתרון בSA1 או פתרון polymerized SA2 (V / V) ריכוז סופי של הפתרון בSA1 או פתרון SA2 polymerized
Acrylamide (No-Bisacrylamide) 40% 25 10%
פתרון SA1 או SA2 100% 60 60%
חיץ TBE 10x 10 1x
TEMED 20% 2.5 0.50%
APS 2% 2.5 0.05%

טבלה 3. אחוז של פתרונות עבור בודה SA1 או פתרונות polymerized SA2. העמודה הראשונה מציגה את הפתרונות לגיבוש ג'לי DNA. העמודה השנייה מציגה את מניית הריכוזים של פתרונות אלה. העמודה השלישית מציגה את אחוז פתרונות המניות בSA1 או פתרונות polymerized SA2 (V / V). הטור האחרון משקף את הריכוזים הסופיים בפתרונות SA1 וSA2.

פתרונות ssDNA colspan> (§1.1)
רכיבי פתרון
פתרון ריכוז מניות ריכוז פתרון סופי חישוב הסכום להוספה תגובות
פתרון SA1 320.7 nmol של lyophilized SA1 ssDNA 3.00 מ"מ 320.7 nmol / 3.00 nmol μl -1 = 107 μl 107 μl של חיץ TE לssDNA lyophilized פתרון SA1 הוא 60% מפתרון polymerized SA1.
107 μl / 0.600 = 178 μl
178 μl הוא הנפח הכולל של פתרון SA1 polymerized (לוח 3).
פתרון SA2 324.4 nmol של lyophilized SA2 ssDNA 3.00 מ"מ 324.4 nmol / 3.00 nmol μl -1 = 108 μl 108 μl של חיץ TE לssDNA lyophilized פתרון SA2 הוא 60% מפתרון polymerized SA2.
108 μl / 0.600 = 180 μl
180 μl הוא הנפח הכולל של פתרון SA2 polymerized (לוח 3).
100% פתרון L2 657.4 nmol של lyophilized L2 ssDNA 3.00 מ"מ 657.4 nmol / 3.00 nmol μl -1 = 219 μl 219 μl של חיץ TE לssDNA lyophilized לדלל aliquot של 100% L2 80% פתרון L2
80% פתרון L2 80 μl של 100% ssDNA L2 80% - 20 μl של חיץ TE 80 μl של 100% פתרון L2
פתרון בקרה 332.6 nmol של lyophilized פולי T או ssDNA 3.00 מ"מ 332.6 nmol / 3.00 nmol μl -1 = 111 μl 111 μl של חיץ TE לssDNA lyophilized
פתרון R2 193.8 nmol של lyophilized R2 ssDNA 3.00 מ"מ 193.8 nmol / 3.00 nmol μl -1 = 64.6 μl 64.6 μl של חיץ TE לssDNA lyophilized
פתרונות polymerized (§1.2)
פתרון polymerized SA1 acrylamide 40% 10% 178 μl x 0.25 = 44.5 μl 45 μl לחשב את כמות acrylamide, TBE, APS, וTEMED מבוסס על נפח כולל של 178 μl (ראה לעיל ולוח 3).
TBE 10x 1x 178 μl x 0.10 = 17.8 μl 18 μl
100% פתרון SA1 60% - 107 μl פתרון SA1 הוא 60% מפתרון polymerized SA1 (ראה לעיל ולוח 3).
2% APS 0.05% 178 μl x 0.025 = 4.45 μl 4.5 μl להוסיף ולערבב APS לפני הוספת TEMED.
20% TEMED 0.50% 178 μl x 0.025 = 4.45 μl 4.5 μl
פתרון polymerized SA2 acrylamide 40% 10% 180 μl x 0.25 = 45 μl 45 μl לחשב את כמות acrylamide, TBE, APS, וTEMED מבוסס על נפח כולל של 180 μl (ראה לעיל ולוח 3).
TBE 10x 1x 180 μl x 0.10 = 18 μl 18 μl
100% פתרון SA2 60% - 108 μl פתרון SA2 הוא 60% מפתרון polymerized SA2 (ראה לעיל ולוח 3).
2% APS 0.05% 180 μl x 0.025 = 4.5 μl 4.5 μl להוסיף ולערבב APS לפני הוספת TEMED
20% TEMED 0.50% 180 μl x 0.025 = 4.5 μl 4.5 μl
פתרונות ג'ל (§1.3)
100% פתרון ג'ל 100% פתרון polymerized SA1 10 חלקים - 10 μl להלחין 100 ג'לי% עם SA1 הבא: SA2: יחס L2, 10: 10: 6.
100% סול polymerized SA2ution 10 חלקים - 10 μl
100% פתרון L2 6 חלקים - 6 μl
80% פתרון ג'ל 100% פתרון polymerized SA1 10 חלקים - 10 μl להלחין ג'לי 80% עם SA1 הבא: SA2: יחס L2, 10: 10: 6.
100% פתרון polymerized SA2 10 חלקים - 10 μl
80% פתרון L2 6 חלקים - 6 μl
ג'לים דינמי (§3-4)
ג'ל 80 → 100% ג'ל 80% 100% gel חישוב 1: 1 μl של 100% פתרון L2 לתקשורת והתרבות חישובים מבוססים על צורך 20 ג'לי μl על מכסה מחליק. ראשית, להמיר את החלקים של 100% פתרון L2 ב20 μl של ג'ל לμl. שנית, לחשב את הסכום (בμl) של 100% פתרון L2 הדרוש ל20% נוספים מcrosslinking. להוסיף סכום זה של 100% פתרון L2 לג'ל.
(20 μl / 26 חלקים) x 6 חלקים = ​​4.6 μl
חישוב 2:
5 μl x 0.2 = 1 μl
ג'ל 100 → 80% ג'ל 100% ג'ל 80% חישוב 1: 1 μl של 100% פתרון R2 לתקשורת והתרבות חישובים מבוססים על צורך 20 ג'לי μl על מכסה מחליק. ראשית, להמיר tחלקיו של 100% פתרון L2 ב20 μl של ג'ל לμl. שנית, לחשב את הסכום (בμl) של 100% פתרון L2 צריך להסיר להלחין ג'ל 20%. להוסיף סכום זה של פתרון R2 לג'ל.
(20 μl / 26 חלקים) x 6 חלקים = ​​4.6 μl
חישוב 2:
5 μl x 0.2 = 1 μl
100 ג'ל% (בקרה) ג'ל 100% ג'ל 100% - 1 μl של פתרון שליטה לתקשורת והתרבות הסכום של פתרון שליטה הוא שווה ערך לסכום של פתרון R2 הוסיף.
ג'ל 80% (בקרה) ג'ל 80% ג'ל 80% - 1 μl של פתרון שליטה לתקשורת והתרבות הסכום של פתרון שליטה הוא שווה ערך לסכום של 100% פתרון L2 הוסיף.

מספרי לוח 4: חישובי דוגמא להכנת ג'ל DNA. מוק מסופקים כדי להמחיש את החישובים להכנת 80%, 100%, 100 → 80%, ו80 → 100 ג'לי%. ג'לי DNA הוא עיצוב 2 בטבלה 1.

  1. צנטריפוגה lyophilized SA1 ssDNA XG ב 2000 ל15 שניות כדי להבטיח את כל ssDNA הוא בחלק התחתון של הבקבוקון. הערה: ריכוז נכון של פתרון SA1 הוא קריטית עבור סינתזת ג'ל DNA.
  2. הכן 3 פתרון מ"מ של SA1 על ידי הוספת 107 μl של 1x טריס-EDTA, pH 8.0 חיץ (חיץ TE) לבקבוקון (לוחות 3-4).
  3. SA1 החום במאגר TE ב 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד גלולה ssDNA הוא נמס לגמרי. הערה: טמפרטורת חימום צריכה להיות מינימום של C ° 5 מעל טמפרטורת התכה (T מ ') כדי להבטיח DNA הוא במצב חד גדילים.
  4. הכן פתרון פילמור SA1 על ידי הוספת acrylamide 40% לבין 10x טריס- Borate-EDTA חיץ (TBE) באחוזים מצויינים (לוח 3). בדוגמא זו, להוסיף 45 ו18 μl, בהתאמה, ל107 μl של פתרון SA1 (לוח 4).
  5. דגה עם גז חנקן במשך 3 דקות כדי להקל על ערבוב. הכנס קצה p200 המצורף למקור גז חנקן לתוך הפתרון ולאפשר לאט גז חנקן לעבור הפתרון. בדוק את קצב הזרימה של גז חנקן במים לפני פתרון SA1 סילוק גזים כדי למנוע מתיז.
  6. צנטריפוגה ל15 שניות ב2,000 XG לאסוף פתרון.
  7. הוספת 4.5 μl של 2% persulfate אמוניום (APS, שולחנות 3-4) ליזום פילמור ג'ל.
  8. להפוך את הצינור מספר פעמים על מנת לערבב.
  9. צנטריפוגה ל15 שניות ב2,000 XG לאסוף פתרון לפילמור הומוגנית.
  10. הוספת 4.5 μl של tetramethylethylenediamine 20% (TEMED, שולחנות 3-4) כדי לזרז פילמור.
  11. להפוך את הצינורכמה פעמים כדי לערבב.
  12. צנטריפוגה ל15 שניות ב2,000 XG לאסוף פתרון לפילמור הומוגנית.
  13. דגה בגז חנקן ל3-5 דקות כדי להשלים פילמור ולמזער מונומרים לבטל הגיב.
  14. דגירה פתרון ל10 דקות ב RT כדי להשלים פילמור. הערה: פתרון זה נקרא SA1 פתרון polymerized.
  15. חזור על שלבים 1.1.3-1.1.16 עם lyophilized SA2 ssDNA, אבל להוסיף 45, 18, ​​4.5, ו4.5 μl של acrylamide, TBE, APS, וTEMED, בהתאמה, ל108 μl של פתרון SA2 (לוחות 3-4). הערה: SA1 ופתרונות polymerized SA2 יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.

2 הכנת L2, R2, ופתרונות בקרה

  1. חזור על שלבי 1.1.3-1.1.5 עם lyophilized R2 ssDNA אבל להוסיף 64.4 μl של חיץ TE (לוח 4).
  2. חזור על שלבי 1.1.3-1.1.5 עם ssDNA השליטה lyophilized אבל להוסיף 111 μl של חיץ TE (לוח 4 ).
  3. חזור על שלבי 1.1.3-1.1.5 עם lyophilized L2 ssDNA אבל להוסיף 219 μl של חיץ TE (לוח 4). הערה: זו 100% פתרון L2. הוספת 100% פתרון L2 לSA1 ופתרונות polymerized SA2 (ראה §1.3) יהווה 100% ג'ל DNA crosslinked (ג'ל 100%) כי SA1, SA2, וL2 יהיה stoichiometrically שווה ערך.
  4. לדלל aliquot של 100% פתרון L2 80% על ידי הוספת 20 μl של חיץ 1x TE 80 μl של 100% פתרון L2 (לוח 4). הערה: פתרון זה הוא 80% פתרון L2. הוספת 80% פתרון L2 לSA1 ופתרונות polymerized SA2 (ראה §1.3) יהווה 80% ג'ל DNA crosslinked (ג'ל 80%) משום שרק 80% מSA1 וSA2 יהיו crosslinked לL2. ניתן לאחסן פתרונות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.

.3 הכנת פתרונות ג'ל

  1. SA1 חום ופתרונות polymerized SA2 ב 70 מעלות צלזיוס עד צמיגות פתרון מצטמצמים (כ 1 דק '). להעלות את הטמפרטורה עד 80 °C אם הפתרון הוא עדיין צמיג מדי לפיפטה.
  2. הוסף 10 μl או 10 חלקים של פתרון polymerized SA1 ל10 μl או 10 חלקים של פתרון SA2 polymerized (לוח 4). הערה: SA1 ופתרונות polymerized SA2 מאוד צמיגים וקשים לפיפטה. מאז ריכוזים הם קריטיים להיווצרות קריש, להשתמש פיפטה חיובי עקירה מכאן ולהבא או ראה דיון לטכניקות טיפול אחרים. כמו כן, פיפטה בaliquots המרובים, קטנים (> 20 μl) ולא כרך אחד, גדול.
  3. פתרונות polymerized Mix SA1 וSA2 יחד באמצעות לסירוגין חימום (ל15 שניות ב70 ° C) וערבוב (ל15 שניות עם קצה פיפטה) עבור הסכום כולל של 1 דקות.
  4. להוסיף 6 μl או 6 חלקים של 100% פתרון L2 כדי ליצור ג'ל 100% (לוח 4).
  5. מערבבים על ידי לסירוגין חימום ובחישה כמתואר בשלב 1.3.3.
  6. ג'ל חום לשעה 1 בטמפרטורת חישול האופטימלית (35 ° C). לחשבnnealing טמפרטורה על ידי הפחתת 5 ° C מרצף ssDNA עם הטמפרטורה הנמוכה ביותר ההיתוך (טבלת 1).
  7. פיפטה ג'ל 100% לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ.
  8. מאפשר crosslinks DNA להמשיך rehybridize ידי דוגרים ג'ל ל4 שעות ב RT.
  9. ג'ל כיסוי עם PBS המכיל סידן ומגנזיום ודגירת O / N ב RT. הערה: ג'לים יתנפח 3 פעמים על הנפח הראשוני שלהם. בנוסף, ג'לים יהיה לאזן עם חיץ וacrylamide העודף יהיו מפוזר מהג'לי. סידן ומגנזיום בPBS לייצב הכלאת DNA ולמנוע ג'ל מתפוצצים (ראה דיון להתפוצצות ג'ל toubleshooting).
  10. הסר חיץ שנותר מצלחת פטרי.
  11. לפברק 80 ג'לי%, חזור על שלבים 1.3.1-1.3.10 אבל להחליף 100% פתרון L2 בשלב 1.3.4 עם 80% פתרון L2. אחסן ג'לי 100% ו80% ​​ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. הערה: הבדלי הקשיחות בין 80% ו100 ג'לי% ניתן להבחין מבחינה פיזית.

    12. .2 ג'ל קיבוע על זכוכית

    הערה: לשתק aliquots של ג'לי 100% או 80% על תלושי כיסוי זכוכית (איור 2).

    1. מחממים ג'ל 100% ב70 מעלות צלזיוס למשך כ -30 שניות או עד ג'ל הוא פחות צמיג לpipetting.
    2. כיסוי זכוכית מקום מחליק על גוש חום 70 ° C ולאפשר לחום ל1-2 דק '.
    3. הוסף טיפה של דבק אופטי לכל להחליק את מכסה זכוכית.
    4. הוסף 20 μl של ג'ל 100% לכל אחד להחליק את מכסה זכוכית (לוח 4). הערה: 10-30 μl ניתן לוותר על כל אחד להחליק את המכסה.
    5. לאפשר ג'ל כדי להמס ומשתרע על פני כיסוי הזכוכית להחליק. הערה: אם טופולוגיה ג'ל אינה מופיעה גם לאחר התכה, לשטח את הג'ל עם להחליק את מכסה זכוכית siliconized. עם זאת, נפיחות נוספת תתרחש בשלבים הבאים ותתרום לאחידות ג'ל.
    6. הסר ג'ל המכיל זכוכית מגוש חום ומקום לתוך צלחת תרבית רקמת 24 גם.
    7. חזור על שלבים 2.1-2.6 עם 8 ג'ל 0%.
    8. ג'לי חום לשעה 1 בטמפרטורה האופטימלית חישול (35 ° C). הערה: זה נורמלי לג'לים להיות יבש וזה ייפתר כאשר ג'לי מודגרת בPBS.
    9. לחשוף צלחות המכילות ג'ל 80% ו100% לאור אולטרה סגולים (UV, 365 ננומטר) במשך 15 דקות. הערה: חשיפה לקרינת UV בו זמנית מרפאה דבק ומעקרת ג'לי. אם תא crosslinking UV אינו זמין, ניתן להציב ג'לי תחת אור UV שמצויד בארון בטיחות ביולוגי. לאחר חשיפה לקרינת UV, לבצע צעדים הבאים של פרוטוקול זה תחת ארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על סטריליות ג'ל. כמו כן, משתמש בפתרוני סטרילי מרגע זה והלאה.
    10. לאפשר crosslinks DNA לrehybridize ב RT למשך 4 שעות.
    11. הוסף PBS ודגירת O / N ב 4 ° C.. הערה: הדגירה PBS שטיפות, equilibrates, ומתנפחת ג'לי שוב כי חימום חוזר ונשנה יכול ליבש את הג'לים.

    51,323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    סכמטי איור 2 של חוסר תנועת ג'ל וfunctionalization. לאחר ג'לים DNA (אפור) מוכנים, ג'לים מצורף לתלושי כיסוי זכוכית (לבן) על ידי דבק אופטי (ירוקה). ג'לים בו זמנית נרפא ומעוקר על ידי אור UV. לאחר נפיחות, ג'לים הוא כ 1 מ"מ עובי. בשלב הבא, ג'לי פונקציונליות בתהליך בן שני שלבים (התיבה אדומה שתואר). ראשית, sulfo-SANPAH הוא מצומדת לacrylamide על משטחי הג'ל על ידי חשיפת אור UV. שנית, ג'לי מודגרת עם קולגן או פולי-D-ליזין, אשר מייחס לאסתר sulfo-N-hydroxysuccinimide בsulfo-SANPAH. נתון זה שונה מ10.

    .3 ג'ל Functionalization

    הערה: functionalization ג'ל DNA דרוש להידבקות תא מאז ג'ל polyacrylamide הוא חומרי אינרטי (איור 2). בסעיף זה, ג'לים יהיה פונקציונליות בשני שלבים. ראשית, N -Sulfosuccinimidyl-6 (4 &# 39; hexanoate -azido-2'-nitrophenylamino) או sulfo-SANPAH יהיה צמוד קוולנטית ידי photolysis של קבוצה אזיד nitrophenyl לשדרת polyacrylamide של ג'לי DNA. שנית, אמינים ראשוניים בקולגן או פולי-D-ליזין יצרפו לאסתר -hydroxysuccinimide N sulfo- בsulfo-SANPAH לצרף חלבונים על פני השטח ג'ל.

    1. הסר חוצץ בבארות עם טפטפת ולהיזהר שלא לשאוב את הג'ל. הערה: אל תבצע שאיפת ואקום להקטין את ההסתברות של aspirating ג'ל.
    2. ג'לי אופציונאלי) לשטוף שלוש פעמים במשך 15 דקות ב RT כדי להסיר מונומר acrylamide העודף, TEMED, וAPS.
    3. הוסף על 300 μl של sulfo-SANPAH כדי לכסות את כל הג'ל.
    4. לחשוף ג'לי לUV (365 ננומטר) במשך 5 דקות.
    5. הסר sulfo-SANPAH.
    6. ג'לים יש לשטוף פעם עם PBS כדי להסיר את עודפי sulfo-SANPAH.
    7. חזור על שלבים 3.3-3.6.
    8. דגירה ג'לי בכ -300 μl של 0.2 מ"ג / מ"ל ​​של פולי-D-ליזין עבור שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C. הערה: לחלופין, דגירה ג'לי עם 0.2 מ"ג / מ"ל ​​של קולגן סוג 1 O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    9. לשטוף ג'לי פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כדי להסיר פולי-D-ליזין העודף.
    10. דגירה ג'לי בכ -300 μl חברות מדיה ל30 דקות לאזן ג'לי.
    11. הסר את המדיה באופן מיידי לפני שתאי ציפוי.

    .4 Culturing תא והדמיה

    הערה: בסעיף זה, אנו מספקים פרטים בדבר הריכוך או הקשחה של ג'לים לאחר ציפוי תא. פרוטוקול culturing התא מפורט אינו מסופק מכמה סיבות. ראשית, סוגים רבים של תאים יכולים לדבוק על ג'לים DNA וכל סוג תא ידרוש התאמות ספציפיות על ידי החוקר לציפוי תא. שנית, טכניקות culturing תא והרקמה סטנדרטית המשמשות לניסויים אלה, וניתן למצוא במספר רב של מאמרים מקוריים, מאמרים טכניים, וספרי עיון. ניתן למצוא טכניקות באופן ספציפי ציפוי fibroblasts ותאי עצב על ג'לים DNA בpreviפרסומים מפוקפקים 9-11,19-21.

    1. פלייט תאים. לפרוטוקולים הנוגעים לנתיחה ו / או culturing של תאי עצב או פיברובלסטים שהוזכרו במאמר זה, מתייחס לאחד מהפרסומים 9-11,19-21 הבאים.
    2. לאחר מינימום של 48 שעות, לווסת ג'ל נוקשות על ידי pipetting μl 1 של שליטה, פתרון L2, או R2 קרוב לג'ל (לוח 4).
      1. כדי להקשיח ג'לי מ80% ל100% crosslinked (80 → 100 ג'לי%), להוסיף 20% הנותרים של L2 80 ג'לי% על ידי הוספת 1 μl של 100% פתרון L2 קרוב לג'ל.
      2. כדי לרכך ג'לי מ100% 80% crosslinked (100 → 80 ג'לי%), להוסיף R2 כדי להסיר 20% מcrosslinks מג'לי 100% על ידי הוספת 1 μl של 100% פתרון R2 קרוב לג'ל.
      3. עבור פקדים, להוסיף כמויות שווה של פתרון שליטה לקבוצת משנה של ג'לי 100% ו80% ​​על ידי הוספת 1 μl של פתרון שליטה קרוב לג'ל.
    3. לבצע ניתוח עיבוד תאים ונתונים הרצוי לאחרמינימום של 48 שעות.

תוצאות

לפני המחקרים שלנו, אינטראקציות התא-ECM נצפו בחומרים ביולוגיים תואמים סטטי או על מצעים דינמיים בלתי הפיכים וחד כיווני. מצעים אלו אינם משקפים את האופי הדינמי של microenvironment הסלולרי. העבודה שלנו מסיטה את פרדיגמות טכניות הקיימות על ידי מתן מודל פיסיולוגי יותר לחקר אינטראקצי...

Discussion

היכולת של ג'לי DNA כדי לרכך או להקשיח לפני ואחרי הידבקות התא הופכת אותם למודל אידיאלי כדי ללמוד את התפקיד של קשיחות רקמה דינמית על תפקוד תא. כל שלושה העיצובים שנעשו שימוש במחקרים מכאניים וביולוגיים. עם זאת, יש את כל שלושת העיצובים גמישויות דומות בשיעורי crosslink שונים, ה?...

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות ל: ד"ר פרנק ג'יאנג, ד"ר דוד לין, ד"ר ברנרד Yurke וד"ר עודאי Chippada על תרומתם בפיתוח טכנולוגית ג'ל DNA; ד"ר Norell Hadzimichalis, סמיט השאה, קימברלי פיטרמן, רוברט Arter להערות והעריכות של כתב היד הזה שלהם; מקורות מימון כולל ועדת ניו ג'רזי על חוט השדרה המחקר (גרנט # 07Â-019-SCR1, מעבדת המאיץ הלאומי) וניו ג'רזי Neuroscience מכון (MLP); ומוציאים לאור של הנדסת רקמות, חלק א 'לאישור להדפיס מחדש איורים 2 ו 4 וBiomaterials רשות להדפיס מחדש את איור 3.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ssDNAIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesiumAny brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)93290TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solutionFisher Scientific (Pittsburg, PA)BP14021Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)A3678Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)T9281Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglassFisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		12-545-82
Norland optical adhesive 72Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		NOA72
24-well tissue culture plateAny brand.
Microcentrifuge tubesAny brand.
Sulfo-SANPAHProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		C111 or 22589Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)P6407Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type IAffymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		13813Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glassFisher Scientific (Pittsburg, PA)12-544-G
Positive-displacement pipetteGilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		F148504
Heat blockFisher Scientific (Pittsburg, PA)11-718
UV light sourcePlace gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
ThermometerAny brand.
Nitrogen gasGTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		NI 5.0UH-R

References

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

90bioengineeringviscoelasticbis acrylamideECMmechanobiology

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved