Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

Zusammenfassung

Unser Labor hat DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogele, ein dynamisches System Hydrogel entwickelt, um die Effekte der Modulation Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktion zu verstehen. Hier bieten wir Schaltpläne, Beschreibungen und Protokolle, um diese Hydrogele vorzubereiten.

Zusammenfassung

Mechanobiologie ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet, das die kritische Rolle der körperliche Signale in der Leitung der Zellmorphologie und Funktion adressiert. Zum Beispiel ist die Wirkung der Elastizität des Gewebes auf die Zellfunktion ein wichtiger Bereich der Forschung, da Mechanobiologie Gewebesteifigkeit moduliert mit der Krankheit, Entwicklung und Verletzungen. Statische Gewebe-ähnlichen Materialien oder Materialien, die nicht ändern kann, wenn die Steifigkeit Zellen plattiert werden hauptsächlich verwendet, um die Effekte der Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktionen zu untersuchen. Während Informationen aus statischen Studien gesammelt wertvoll ist, sind diese Studien kein Hinweis auf die dynamische Natur der zellulären Mikroumgebung in vivo. Um die Wirkungen der dynamischen Steifigkeit auf die Zellfunktion besser erfüllen eine DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogel-System (DNS-Gele) entwickelt. Im Gegensatz zu anderen dynamischen Substraten, haben DNA-Gelen die Fähigkeit zu verringern oder zu erhöhen in der Steifigkeit nach der Herstellung ohne Reize. DNA-Gele bestehen aus DNA crosslTinten, die in einem Polyacrylamid-Grundgerüst polymerisiert werden. Hinzufügen und Entfernen von Vernetzungen durch Lieferung von Einzelstrang-DNA kann zeitlicher, räumlicher und reversible Steuerung Gelelastizität. Wir haben in früheren Berichten dargestellt, dass die dynamische Modulation der DNA-Gel Elastizität beeinflusst Fibroblasten und Neuronen Verhalten. In diesem Bericht und Video bieten wir eine schematische, die die DNA-Gel Vernetzungsmechanismen und Schritt-für-Schritt-Anleitung beschreibt auf die Vorbereitung DNA-Gelen.

Einleitung

Statische und dynamische Substrate gibt zwei Kategorien von Biomaterialien, die entwickelt wurden, um die Wirkungen einer Gewebe Elastizität oder Steifigkeit auf die Zellfunktion untersucht werden. Statische Substrate sind nicht in der Lage, ihre physikalischen Eigenschaften ändern, nachdem sie hergestellt sind, und / oder einmal Zellen plattiert. Polyacrylamid (PA)-Gelen wurden die ersten zweidimensionalen statischen Substraten für Untersuchungen Mechanobiologie ^5,17 synthetisiert. PA Gele sind leicht herzustellen, preiswert, flexibel und kann mit einer Vielzahl von elastischen Moduli hergestellt werden. Obwohl diese technischen Vorteile machen PA-Gele häufig angewendet Substrat, sind statische Substrate kein Hinweis auf die Dynamik der extrazellulären Matrix (ECM) und die umliegenden Zellumgebung in vivo. Zum Beispiel kann die ECM-Steifigkeit erfährt Änderungen als Folge von Verletzungen, die Entwicklung oder Krankheit. Dynamische Substrate werden daher als gehirnähnlichen Substrat Modelle in Mechanobiologie Studien begünstigt ^22,24,25.

Zahlreiche synthetische, natürliche, zweidimensionalen, dreidimensionalen, statischen und dynamischen Biomaterialien wurden entwickelt, um Gewebesteifigkeit ^{1,3,6,16,23,26} imitieren. Einige dynamische Substrate benötigen Wärme, UV, elektrischen Strom, Ionen und pH-Änderungen, um ihre mechanischen Eigenschaften zu verändern ^{2,4,7,8,12,15,16,} aber diese Reize Bio-Anwendung des Hydrogels zu beschränken. DNA-Polyacrylamid vernetzt Hydrogele (DNA Gele) sind dynamisch zweidimensionalen elastischen Substraten. DNA-Vernetzungen ermöglichen zeitlichen, räumlichen und reversible Modulation der DNA-Gel-Steifigkeit durch die Zugabe von Einzelstrang-DNA (ssDNA), um Medien oder Puffer ^{9-11,13,14,18,21.} Im Gegensatz zu den oben erwähnten dynamischen Gele wo Stimuli zur Modulation der Elastizität aufgebracht, stützen sich die DNA Gele auf der Diffusion von Applied ssDNA zur Veränderung der Elastizität. Deshalb ist die obere Geloberfläche, wo Zellen gezüchtet werden, ist der erste Bereich moduliert, da die Geschwindigkeit of Elastizität Modulation hängt von der Gel-Dicke.

DNA-Gele sind ähnlich wie ihre Gegenstücke in PA-Gel, dass sie eine Polyacrylamid-Rückgrat haben jedoch die Bis-Acrylamid Vernetzungen mit Vernetzungen von DNA (Figur 1) zusammengesetzt ersetzt. Zwei ssDNAs (SA1 und SA2) hybridisieren mit einem Vernetzer Strang (L2) bilden die DNA-Quervernetzungen des Gels. SA1 und SA2 haben verschiedene Sequenzen, die sowohl eine ACRYDIT Modifikation am 5'Ende für eine effektive Einbindung in die PA-Netzwerk enthalten. Zur Herstellung des Gels, SA1 und SA2 werden einzeln in einem PA Gerüst polymerisiert und anschließend die polymerisierten SA1 und SA2 werden miteinander vermischt. L2, das Vernetzungsmittel wird zu der SA1 und SA2 Mischung zugegeben. Der L2-Basensequenz komplementär zu beiden SA1 und SA2 und L2 Sequenzen hybridisiert SA1 und SA2, um die DNA-Vernetzungen zu bilden. Initial, DNA-Gel Elastizität wird von beiden L2-Konzentrationen und Vernetzung (Tabellen 1 bestimmt und 2). DNA-Gelen, die gleiche stöchiometrische Mengen L2, SA1, SA2 und sind die härtesten Gele, weil SA1 und SA2 sind 100% vernetzt durch L2 (als 100% Gele bezeichnet). Niedrigere Konzentrationen von L2 zu einem niedrigeren Prozentsatz an DNA-Vernetzung und damit weicher DNA Gele. Gele so niedrig wie 50% vernetzt (zu 50% Gele bezeichnet) wurden konstruiert, ^9-11.

Abbildung 1. DNA-Gel Vernetzung und uncrosslinking schematische ^{9-11,13,14,18,21.} Schritt 1: SA1 (rot) und SA2 (blau) werden einzeln in einem Polyacrylamid-Rückgrat (schwarz) polymerisiert. Nach der Polymerisation werden SA1 und SA2 polymerisiert Lösungen miteinander vermischt. Schritt 2: L2 (grün) zu und hybridisiert mit SA1 und SA2, die Vernetzungen des Gels. Schritt 3: R2 hybridisiert mit ter Ansatzpunkt von L2. Schritt 4: Brückenkopf-Hybridisierung von R2 treibt das Entpacken von L2 von SA1 und SA2.

Im Gegensatz zu PA-Gele können DNA-Gele zu versteifen und zu erweichen nach der Synthese. Aus diesem Grund können die Zellen auf DNA-Gelen gezüchtet, um dynamische Steifigkeit Änderungen unterzogen werden. Zellhaftenden Gelen erstarren kann L2 zu den Kulturmedien von geringen Prozentsatz Gels zugegeben werden, um den Prozentsatz von Vernetzungen zu erhöhen. Erweichen zellhaft Gele können L2 entfernt werden, um den Prozentsatz von Vernetzungen ^10,13,21 verringern. L2 hat einen zusätzlichen Brückenkopf-Sequenz am 3'Ende zu ermöglichen L2 von SA1 und SA2 (Tabelle 1) uncrosslink. Entfernung von L2 durch Hybridisierung einer Umkehrstrang genannt R2 erreicht. R2 ist komplementär zu der vollen Länge von L2 und hybridisiert mit dem ersten Ansatzpunkt L2. Brückenkopf-Hybridisierung treibt das Entpacken von L2 von SA1 und SA2, die die Vernetzungs beseitigt und reduziert das Gel Steifigkeit.

In diesem Bericht undVideo, Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Herstellung von Versteifungs und Erweichung DNA-Gelen zur Verfügung gestellt. Während 100% und 80% Gel Präparate beschrieben, kann dieses Protokoll zugeschnitten werden, um DNA-Gelen anderer anfänglichen und endgültigen vernetzten Prozentsätze zu erstellen. Im allgemeinen sind 100% und 80% Gele hergestellt, auf Glas-Deckgläschen immobilisiert, funktionalisiert und mit Zellen besät. L2 ist mit den Medien 80% Gele gegeben und R2 ist mit dem Medium 100% Gelen, 48 h nach dem Plattieren zugegeben. Die Zugabe von L2 Medien versteift 80% bis 100% Gelen vernetzt, während die Zugabe von R2 Medien erweicht 100% Gele zu 80% vernetzt ist. Versteift Gele sind als 80 → 100% Gele bezeichnet und aufgeweicht Gele als 100 → 80% Gele im Text bezeichnet. Für die Kontrolle oder statische Gele, ssDNA aus Ts oder As ist, um einen weiteren Satz von 100% und 80% Gelen geliefert. Nach einem Minimum von zwei Tagen nach der Elastizität Modulations können Zellen verarbeitet und analysiert werden.

	DNA-Vernetzung	# Basen	Sequenz (Brückenkopf)	Änderung	Schmelztemperatur (T m ° C)	Kommentare
			5 '→ 3'
Design 1	SA1	10	GCA CCT TTG C	5 'ACRYDIT	34,9
	SA2	10	GTC AGA ATG A	5 'ACRYDIT	23,6
	L2	30	TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG		56	Ein 10 bp-Sequenz Ansatzpunkt ist inbegriffen.
	R2	30	CAA GTG CGC TAG ACC TTT GCG TCA GAA TGA			R2 ist komplementär zu L2
Design 2	SA1	14	CGT GGC ATA GGA CT	5 'ACRYDIT	46,9
	SA2	14	GTT TCC CAA TCA GA	5 'ACRYDIT	40,2
	L2	40	TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C		65,9	Ein 12-bp-Sequenz Ansatzpunkt ist inbegriffen.
	R2	40	GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A		65,9	R2 ist komplementär zu L2
Design 3	SA1	20	ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC	5 'ACRYDIT	55
	SA2	20	CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA	5 'ACRYDIT	56,6
	L2	40	TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T		68,8	Ansatzpunkt ist nicht inbegriffen.
Kontrolle	Kontrolle	20-40	AAA AAA (etc.) oder
			TTT TTT (usw.)

Tabelle 1. Basissequenzen für ssDNA ^{9-11,13,14,18,21.} Zelluläre und mechanischen Studien haben mehrere d verwendetifferent Vernetzungs Designs zur DNA-Gelen mit verschiedenen statischen und dynamischen mechanischen Eigenschaften zu erzeugen. Die in der Quer Design moduliert Parameter sind Basensequenz und Sequenzlänge oder vernetzen Länge. Bold und kursiv Schriften veranschaulichen Basenpaarung zwischen SA1 und L2 und zwischen SA2 und L2.

	Design
	1			2			3
Acrylamidkonzentration (%)	10			10			10	4
SA1 und SA2 auf den L2-hybridisiert (% vernetzt)	50	80	100	50	80	100	100	100
Elastizität (kPa, Mittelwert ± SEM)	6,6 ± 0,6	17,1 ± 0,8	29,8 ± 2,5	5,85 ± 0,62	12,67 ± 1,33	22.88 ± 2.77	25,2 ± 0,5	10,4 ± 0,6

Tabelle 2. Elastizitätsmodul (E) von DNA-Gelen ^{9-11,13,14,18,21.} Acrylamidkonzentration, Vernetzungsprozent und Vernetzungs Länge kann in DNA-Gelen moduliert werden. Motive 1, 2 und 3 sind 20, 28 und 40 bp Vernetzungslängen sind. 100%-Gele für alle Ausführungen haben ähnliche Module anzeigt vernetzen Länge hat keinen Einfluss auf Gel-Elastizität. Variationen in Acrylamidkonzentration verändern jedoch DNA-Gel Elastizität.

Protokoll

HINWEIS: Die gesamte Protokoll von Gelzubereitung zur Zellenverarbeitung dauert mindestens sechs Tage. Geschätzte Zeit für die Gel-Präparat ist 8 Stunden plus eine O / N Inkubation. Geschätzte Zeit für die Gel-Immobilisierung und DNA-Annealing ist 8 Stunden plus eine O / N Spülvorgang. Geschätzte Zeit für die Gel-Funktionalisierung ist 2 Stunden. Zeit für Zellwachstum und Beschichtung ist abhängig von Kultur-Typ und Anwendung, aber ein Minimum von vier Tagen erforderlich.

1. Herstellung von DNA-Gelen

HINWEIS: Bereiten DNA-Gelen in drei verschiedenen Schritten. Zuerst einzeln polymerisieren SA1 und SA2 ssDNA in eine PA-Backbone. Diese Lösungen werden als SA1 polymerisierten Lösung und SA2 polymerisierten Lösung, bzw. (§ 1.1). Zweitens, die Auflösung der Vernetzer, reversible Strang und Steuer ssDNAs. Lösen Sie die lyophilisierten L2 ssDNA (Vernetzer). Dies wird als 100%-Lösung L2 und wird verwendet, um 100%-Gelen (§ 1.2) herzustellen. Einen aliquoten von 100% L2-Lösungbis 80%. Dies wird als 80%-Lösung und L2 verwendet wird, um 80% Gele herzustellen. Auflösen lyophilisierten R2 (reversible Strang) und Steuer ssDNA in § 4 zu verwenden. Drittens mischen SA1 polymerisierte Lösung, SA2 polymerisierte Lösung und 100% bzw. 80% L2 Lösung in einem Verhältnis von 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) auf 100% und 80% Gele bilden. (§ 1.3).

1. Herstellung der SA1 und SA2 Polymerisiertes Lösungen

1. Wählen und bestellen Sie das passende SA1, SA2, L2, R2 und Basensequenzen aus den Tabellen 1 und 2. Basensequenzen und Sequenzlänge wurden in früheren Berichten ^9-11,13,14 optimiert.
2. Berechnen Sie alle Lösungsformulierungen (Tabellen 3-4). HINWEIS: Akribisch Dokument Berechnungen für die Fehlerbehebung. Aufbau einer Excel-Vorlage wird empfohlen und kann wiederholt für die DNA-Zubereitung verwendet werden. Bitte siehe Tabellen 3 und 4 für ein Beispiel für die Aufstellung für Design 2 (Tabellen 1 und 2). Die in Tabelle 4 angegeben Mengen werden in diesem Protokoll verwendet werden, aber Volumen wird mit jedem Aliquot lyophilisierten ssDNA variieren.

Lösung	Lager Lösungskonzentration	Prozentsatz der Stammlösung in SA1 oder SA2 polymerisierte Lösung (v / v)	Endgültige Konzentration der Lösung in SA1 oder SA2 polymerisierte Lösung
Acrylamid (No-Bisacrylamid)	40%	25	10%
SA1 oder SA2 Lösung	100%	60	60%
TBE-Puffer	10x	10	1x
TEMED	20%	2.5	0,50%
APS	2%	2.5	0,05%

Tabelle 3. Prozentsatz der Lösungen für die Herstellung von SA1 oder SA2 polymerisiert Lösungen. Die erste Spalte zeigt die Lösungen für die Formulierung der DNA-Gele. Die zweite Spalte zeigt die Lager Konzentrationen dieser Lösungen. Die dritte Spalte zeigt den Prozentsatz der Stammlösungen in SA1 oder SA2 polymerisiert Lösungen (v / v). Die letzte Spalte gibt die Endkonzentrationen in SA1 und SA2-Lösungen.

ssDNA-Lösungen (§ 1.1)

Lösungskomponenten
Lösung		Auf Konzentration	Endlösung Konzentration	Berechnung	Betragen hinzufügen	Kommentare
SA1 Lösung		320,7 nmol lyophilisierter SA1 ssDNA	3,00 mm	320,7 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 107 ul	107 ul TE-Puffer lyophilisiert ssDNA	SA1 Lösung ist 60% der SA1 polymerisierten Lösung.
						107 ul / 0,600 = 178 ul
						178 ul ist das Gesamtvolumen der SA1 polymerisierte Lösung (Tabelle 3).
SA2 Lösung		324,4 nmol lyophilisierter SA2 ssDNA	3,00 mm	324,4 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 108 ul	108 ul TE-Puffer lyophilisiert ssDNA	SA2 Lösung ist 60% der SA2 polymerisierten Lösung.
						108 ul / 0,600 = 180 ul
						180 ul ist das Gesamtvolumen der SA2 polymerisierte Lösung (Tabelle 3).
100% L2-Lösung		657,4 nmol lyophilisierter L2 ssDNA	3,00 mm	657,4 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 219 ul	219 ul TE-Puffer lyophilisiert ssDNA	Einen aliquoten von 100% auf 80% L2 L2-Lösung
80% L2-Lösung		80 ul 100% L2 ssDNA	80%	-	20 ul TE Puffer zu 80 ul 100% L2 Lösung
Steuerungslösung		332,6 nmol lyophilisierter Poly-T-oder A ssDNA	3,00 mm	332,6 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 111 ul	111 ul TE-Puffer lyophilisiert ssDNA
R2-Lösung		193,8 nmol lyophilisierter R2 ssDNA	3,00 mm	193,8 nmol / 3,00 nmol ul -1 = 64,6 ul	64,6 ul TE Puffer lyophilisiert ssDNA
Polymerisiert Lösungen (§ 1.2)
SA1 polymerisierten Lösung		40% Acrylamid	10%	178 x 0,25 = ul ul 44,5	45 ul	Berechnen der Menge an Acrylamid, TBE, APS und TEMED, bezogen auf ein Gesamtvolumen von 178 ul (siehe oben und Tabelle 3).
		10x TBE	1x	178 x 0,10 = ul ul 17,8	18 ul
		100% SA1 Lösung	60%	-	107 ul	SA1 Lösung ist 60% der SA1 polymerisierten Lösung (siehe oben und Tabelle 3).
		2% APS	0,05%	178 x 0,025 = ul ul 4,45	4,5 ul	Hinzufügen und mischen APS bevor TEMED.
		20% TEMED	0,50%	178 x 0,025 = ul ul 4,45	4,5 ul
SA2 polymerisierten Lösung		40% Acrylamid	10%	180 ul x 0,25 = 45 ul	45 ul	Berechnen der Menge an Acrylamid, TBE, APS und TEMED, bezogen auf ein Gesamtvolumen von 180 ul (siehe oben und Tabelle 3).
		10x TBE	1x	180 ul x 0,10 = 18 ul	18 ul
		100% SA2 Lösung	60%	-	108 ul	SA2 Lösung ist 60% der SA2 polymerisierten Lösung (siehe oben und Tabelle 3).
		2% APS	0,05%	180 ul x 0,025 = 4,5 ul	4,5 ul	Hinzufügen und mischen APS bevor TEMED
		20% TEMED	0,50%	180 ul x 0,025 = 4,5 ul	4,5 ul
Gel-Lösungen (§ 1.3)
100% Gel-Lösung		100% SA1 polymerisierten Lösung	10 Teile	-	10 ul	Komponieren 100% Gele mit dem folgenden SA1: SA2: L2-Verhältnis 10: 10: 6.
		100% SA2 polymerisiert Solution	10 Teile	-	10 ul
		100% L2-Lösung	6 Teile	-	6 ul
80% Gel-Lösung		100% SA1 polymerisierten Lösung	10 Teile	-	10 ul	Komponieren 80% Gele mit dem folgenden SA1: SA2: L2-Verhältnis 10: 10: 6.
		100% SA2 polymerisierten Lösung	10 Teile	-	10 ul
		80% L2-Lösung	6 Teile	-	6 ul
Dynamische Gelen (§3-4)
80 → 100% Gel		80% Gel	100% gel	Berechnung 1:	1 ul 100% L2 Lösung in Kulturmedien	Die Berechnungen basieren auf mit 20 ul Gele auf Deckgläser basiert. Zunächst wandeln die Teile 100% L2-Lösung in den 20 ul ul Gel in. Zweitens berechnen die Höhe (in ul) von 100% für weitere 20% der Vernetzung benötigt L2-Lösung. Fügen Sie diesen Betrag von 100% L2-Lösung zu einem Gel.
				(20 ul / 26 Teile) x 6 Teile = 4,6 ul
				Berechnung 2:
				5 ul 0,2 x = 1 ul
100 → 80% Gel		100% Gel	80% Gel	Berechnung 1:	1 ul 100% R2 Lösung in Kulturmedien	Die Berechnungen basieren auf mit 20 ul Gele auf Deckgläser basiert. Zuerst konvertieren ter Teile 100% L2-Lösung in den 20 ul ul Gel in. Zweitens berechnen die Höhe (in ul) von 100% benötigt, um entfernt, um eine 20%-Gel komponieren L2-Lösung. Fügen Sie diesen Betrag von R2-Lösung zu einem Gel.
				(20 ul / 26 Teile) x 6 Teile = 4,6 ul
				Berechnung 2:
				5 ul 0,2 x = 1 ul
100%-Gel (Control)		100% Gel	100% Gel	-	1 ul Steuerungslösung in das Kulturmedium	Menge an Kontroll-Lösung ist äquivalent zu der Menge an R2-Lösung gegeben.
80% Gel (Control)		80% Gel	80% Gel	-	1 ul Steuerungslösung in das Kulturmedium	Menge an Kontroll-Lösung ist äquivalent zu der Menge von 100% L2-Lösung gegeben.

Tabelle 4. Beispiel Berechnungen für die DNA-Zubereitung. Mock Zahlen sind vorgesehen, um die Berechnungen für die Herstellung von 80%, 100%, 100 → 80% und 80 → 100% Gele veranschaulichen. DNA-Gele sind Design 2 in Tabelle 1.

3. Zentrifuge SA1 lyophilisierten ssDNA bei 2.000 × g für 15 s, um sicherzustellen, alle ssDNA befindet sich am Boden des Fläschchens. HINWEIS: Die richtige Konzentration der SA1-Lösung ist entscheidend für die DNA-Gel-Synthese.
4. Vorbereitung 3 mM SA1 Lösung durch Zugabe von 107 ul 1x Tris-EDTA, pH 8,0 Puffer (TE-Puffer) in die Ampulle (Tabellen 3-4).
5. Wärme SA1 in TE-Puffer bei 70 ° C für 5 min oder bis ssDNA Pellet vollständig aufgelöst ist. HINWEIS: Die Erwärmungstemperatur sollte mindestens 5 ° C über der Schmelztemperatur (T _m) zu gewährleisten, ist in einer DNA-Einzelstrang-Zustand.
6. Bereiten SA1 Polymerisation Lösung durch Zugabe von 40% Acrylamid und 10x Tris-Borat-EDTA (TBE)-Puffer mit den angegebenen Prozentsätzen (Tabelle 3). In diesem Beispiel von 45, und 18 ul bzw. 107 ul SA1-Lösung (Tabelle 4).
7. Entgasen mit Stickstoff für 3 Minuten Mischen zu erleichtern. Legen Sie eine p200 Spitze zu einem Stickstoffgasquelle in die Lösung befestigt und langsam ermöglichen Stickstoffgas durch die Lösung weiterzugeben. Testen Sie die Durchflussrate von Stickstoffgas in Wasser vor der Entgasung SA1 Lösung um Spritzer zu vermeiden.
8. Zentrifuge für 15 Sekunden bei 2.000 xg Lösung zu sammeln.
9. Fügen 4,5 ul 2% Ammoniumpersulfat (APS, Tabellen 3-4), um Gel Polymerisation zu initiieren.
10. Wird das Röhrchen mehrmals zu mischen.
11. Zentrifuge für 15 Sekunden bei 2.000 xg Lösung für homogene Polymerisation zu sammeln.
12. Fügen 4,5 ul 20% Tetramethylethylendiamin (TEMED, Tabellen 3-4), um die Polymerisation zu katalysieren.
13. Das Röhrchenmehrmals, um zu mischen.
14. Zentrifuge für 15 Sekunden bei 2.000 xg Lösung für homogene Polymerisation zu sammeln.
15. Entgasen mit Stickstoff für 3-5 min zur Vervollständigung der Polymerisation und zur Minimierung nicht-umgesetzten Monomeren.
16. Inkubieren Lösung für 10 min bei RT, um die Polymerisation zu vervollständigen. HINWEIS: Diese Lösung heißt SA1 polymerisierten Lösung.
17. Die Schritte 1.1.3-1.1.16 mit lyophilisierten SA2 ssDNA, sondern fügen 45, 18, ​​4,5 und 4,5 ul Acrylamid, TBE, APS und TEMED, jeweils mit 108 ul der Lösung SA2 (Tabellen 3-4). HINWEIS: SA1 und SA2 polymerisierten Lösungen bei 4 ° C für bis zu einem Monat gelagert werden.

2. Herstellung von L2, R2, and Control Solutions

1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.3-1.1.5 mit gefriergetrockneten R2 ssDNA aber fügen 64,4 ul TE-Puffer (Tabelle 4).
2. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.3-1.1.5 mit gefriergetrockneten Steuer ssDNA aber fügen 111 ul TE-Puffer (Tabelle 4 ).
3. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.3-1.1.5 mit gefriergetrockneten L2 ssDNA aber fügen 219 ul TE-Puffer (Tabelle 4). Hinweis: Dies ist 100% L2-Lösung. Zugabe von 100% L2 Lösung SA1 und SA2 polymerisiert Lösungen (siehe § 1.3) wird eine 100% vernetzten DNA-Gel (100% Gel) bilden, weil SA1, SA2, und L2 wird stöchiometrisch äquivalent sein.
4. Ein Aliquot von 100% L2-Lösung zu 80% durch Zugabe von 20 ul 1x TE Puffer zu 80 ul 100% L2-Lösung (Tabelle 4). HINWEIS: Diese Lösung ist 80% L2-Lösung. Zugabe von 80% L2 Lösung SA1 und SA2 polymerisiert Lösungen (siehe § 1.3) wird eine 80% vernetzten DNA-Gel (80% Gel) bilden, weil nur 80% der SA1 und SA2 wird L2 vernetzt werden. Lösungen bei 4 ° C für bis zu einem Monat gelagert werden.

3. Herstellung von Gel-Lösungen

1. Wärme SA1 und SA2 polymerisierten Lösungen bei 70 ° C, bis die Lösungsviskosität reduziert (etwa 1 min). Erhöhen Sie die Temperatur bis zu 80 °C, wenn Lösung ist immer noch zu viskos Pipette.
2. Werden 10 ul oder 10 Teile SA1 polymerisierte Lösung zu 10 ul oder 10 Teile SA2 polymerisierte Lösung (Tabelle 4). HINWEIS: SA1 und SA2 polymerisiert Lösungen sind extrem zäh und schwierig, Pipette. Seit Konzentrationen sind entscheidend für die Gel-Bildung, verwenden Sie ein Verdrängungspipette von diesem Punkt an oder siehe Diskussion für andere Behandlungstechniken. Auch Pipette in mehrere kleine Teilmengen (> 20 ul) anstelle eines einzelnen, großen Volumen.
3. Mischung SA1 und SA2 polymerisierten Lösungen miteinander über alternierende Heizung (15 sec bei 70 ° C) und Rühren (für 15 sec mit einer Pipettenspitze) für eine Gesamtzahl von 1 min.
4. Hinzufügen 6 ul oder 6 Teile 100% L2 Lösung, um eine 100%-Gel (Tabelle 4) zu bilden.
5. Mischen durch abwechselnde Erhitzen und Rühren, wie in Schritt 1.3.3 beschrieben.
6. Wärme Gel 1 h lang bei der optimalen Annealing-Temperatur (35 ° C). Berechnen Sie einennealing Temperatur durch Subtrahieren 5 ° C von der ssDNA-Sequenz mit der niedrigsten Schmelztemperatur (Tabelle 1).
7. Pipettieren 100% Gel in einer 60-mm-Petrischale.
8. DNA-Vernetzungen ermöglichen, weiterhin durch Inkubation Gel für 4 h bei RT rehybridisieren.
9. Cover Gel mit PBS, Calcium und Magnesium und Inkubation O / N bei RT. HINWEIS: Die Gele werden etwa 3-fache ihres ursprünglichen Volumens aufquellen. Darüber hinaus werden Gele mit Puffer äquilibriert und überschüssiges Acrylamid wird der Gele diffundieren. Calcium und Magnesium in der PBS zu stabilisieren und verhindern, dass die DNA-Hybridisierung Gel platzt (siehe Diskussion für Toubleshooting Gel Platzen).
10. Entfernen von Restpufferpetrischale.
11. Zu 80% Gele herzustellen, wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.10 aber ersetzen 100% L2 Lösung in Schritt 1.3.4 mit 80% L2-Lösung. Speicher 100% und 80% Gele bei 4 ° C für bis zu einem Monat. HINWEIS: Die Steifigkeit Differenzen zwischen 80% und 100% Gele sind physikalisch unterscheidbar.

2. Gel Immobilisierung auf Glas

HINWEIS: Immobilisieren Aliquots von 100% oder 80% Gelen auf Glasdeckgläschen (Abbildung 2).

1. Wärme 100% Gel bei 70 ° C für etwa 30 s oder bis Gels zum Pipettieren weniger viskos.
2. Ort Glasplättchen auf einer 70 ° C Wärmeblock und lassen Sie es 1-2 Minuten erhitzen.
3. Fügen Sie einen Tropfen Klebstoff auf jede optische Deckglas.
4. Mit 20 ul 100% iges Gel zu jedem Deckglas (Tabelle 4). HINWEIS: 10-30 ul können auf jedem Deckglas verzichtet werden.
5. Ermöglichen Gel zu schmelzen und sich über Deckglas. HINWEIS: Wenn Gel-Topologie noch nicht einmal nach dem Schmelzen erscheinen, glätten Gel mit einem silikonisierten Deckglas. Allerdings werden zusätzliche Schwellung in nachfolgenden Schritten auftreten und dazu beitragen, Gel Unebenheiten.
6. Entfernen glashaltigen Gel aus Wärmeblock und in einen 24-Loch-Gewebekulturschale.
7. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.6 mit 8 0% Gel.
8. Wärme Gele 1 Stunde lang bei der optimalen Annealing-Temperatur (35 ° C). HINWEIS: Es ist normal, Gele trocken werden, und dies wird aufgelöst, wenn Gele werden in PBS inkubiert werden.
9. Aussetzen Platten, die 80% und 100% Gelen (UV, 365 nm) Licht für 15 Minuten Ultraviolettlicht. HINWEIS: UV-Exposition gleichzeitig heilt Leim und sterilisiert Gele. Wenn eine UV-Vernetzung Kammer nicht verfügbar ist, können Gele unter UV-Licht, das in einem biologischen Sicherheitsschrank ausgestattet ist, angeordnet werden. Nach der UV-Exposition, führen nachfolgende Schritte in diesem Protokoll unter einem biologischen Sicherheitsschrank zur Gel Sterilität zu erhalten. Verwenden Sie auch sterile Lösungen von diesem Punkt an.
10. Ermöglichen DNA-Vernetzungen bei RT für 4 h rehybridisieren.
11. Fügen PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C. HINWEIS: PBS Inkubation Spülungen, Gleichgewicht, und schwillt Gele wieder, weil wiederholt Heizung können die Gele entwässern.

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Abbildung 2. Schematische Darstellung des Gel-Immobilisierung und Funktionalisierung. Nach der DNA-Gele (grau) hergestellt, Gele werden auf Glasdeckgläschen (weiß) durch optische Kleber (grün) angebracht ist. Gele werden gleichzeitig ausgehärtet und durch UV-Licht sterilisiert. Nach dem Quellen, sind Gele etwa 1 mm dick. Als nächstes werden Gele in einem zweistufigen Verfahren funktionalisiert (rot umrandet Kasten). Zunächst wird Sulfo-SANPAH Acrylamid-Gel auf den Oberflächen durch UV-Belichtung konjugiert. Zweitens werden die Gele mit Kollagen oder Poly-D-Lysin inkubiert, was zu der Sulfo-N-hydroxysuccinimidester in Sulfo-SANPAH isst. Diese Zahl wurde von ¹⁰ geändert wurde.

3. Gel Funktionalisierung

HINWEIS: DNA Gel Funktionalisierung für die Zelladhäsion erforderlich, da Polyacrylamidgelen inerte Materialien (Abbildung 2). In diesem Abschnitt werden Gele in zwei Schritten funktionalisiert werden. Erste, N -Sulfosuccinimidyl-6 (4-# 39; Azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat oder Sulfo-SANPAH kovalent durch Photolyse nitrophenyl Azidgruppe zu dem Polyacrylamid-Rückgrat der DNA Gele verknüpft werden. Zweitens werden primäre Amine in Kollagen oder Poly-D-Lysin an die Sulfo N-Hydroxysuccinimid-Ester in Sulfo-SANPAH befestigen, um die Proteine ​​an die Gel-Oberfläche zu befestigen.

1. Entfernen Puffer in Vertiefungen, die mit einer Pipette vorsichtig sein und nicht, um das Gel absaugen. HINWEIS: Vakuum-Aspiration führen nicht um die Wahrscheinlichkeit von Absaugen des Gels zu reduzieren.
2. Optional) Wasch Gele dreimal für 15 min bei RT, um überschüssiges Monomer Acrylamid, TEMED und APS entfernen.
3. Fügen Sie über 300 ul Sulfo-SANPAH, jedes Gel decken.
4. Aussetzen Gels mit UV (365 nm) für 5 min.
5. Entfernen Sulfo-SANPAH.
6. Spülen Gele einmal mit PBS, um überschüssige Sulfo-SANPAH entfernen.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,6.
8. Gele Inkubieren in 300 ul 0,2 mg / ml Poly-D-Lysin für 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. HINWEIS: Alternativ inkubieren Gele mit 0,2 mg / ml Kollagen Typ 1 O / N bei 4 ° C ist.
9. Zweimal waschen Gele mit PBS 5 min, um überschüssige Poly-D-Lysin zu entfernen.
10. Gele in etwa 300 ul Medium Inkubation 30 min Gele äquilibrieren.
11. Entfernen Sie das Medium unmittelbar vor dem Beschichten Zellen.

4. Zellkultivierung und Imaging

HINWEIS: In diesem Abschnitt geben wir Details über die Erweichung oder Versteifungs von Gelen nach der Zellbeschichtung. Eine detaillierte Zellkultivierungsprotokoll aus mehreren Gründen nicht vorgesehen. Erstens können zahlreiche Zelltypen auf DNA-Gele haften und jeder Zelltyp werden spezifische Anpassungen durch den Forscher für die Zell Beschichtung erfordern. Zweitens werden Standard-Zell-und Gewebekulturtechniken für diese Experimente verwendet und kann in zahlreichen Original-Artikel, technische Artikel, Bücher und Referenz gefunden werden. Techniken für die Beschichtung speziell Fibroblasten und Neuronen auf DNA-Gele können in Previ gefunden werdenschiedenen Publikationen ^9-11,19-21.

1. Plattenzellen. Für Protokolle über Dissektion und / oder Kultivierung von Neuronen oder Fibroblasten in diesem Artikel erwähnt, um eine der folgenden Publikationen ^9-11,19-21 beziehen.
2. Nach mindestens 48 Stunden, modulieren Gel Steifigkeit durch Pipettieren von 1 ul Steuer, L2, R2 oder Lösung in der Nähe des Gel (Tabelle 4).
   1. Gele von 80% bis 100% vernetzt (80 → 100% Gele) versteifen, die restliche 20% der L2 80% Gele durch Zugabe von 1 ul 100% L2 Lösung in der Nähe des Gels.
   2. Bis zu 80% vernetzt (100 → 80% Gele) erweichen Gele aus 100% addieren R2 bis 20% der Querverbindungen 100% Gele durch Zugabe von 1 ul 100% R2 Lösung nahe dem Gel zu entfernen.
   3. Für Kontrollen hinzu gleichen Volumina Kontrolllösung auf eine Teilmenge von 100% und 80% Gele durch Zugabe von 1 ul der Kontroll-Lösung in der Nähe des Gels.
3. Führen Sie die gewünschte Zellverarbeitung und Datenanalyse nachein Minimum von 48 Stunden.

Ergebnisse

Vor unserer Studien wurden zell ECM-Wechselwirkungen auf statische konform Biomaterialien oder irreversibel und unidirektionalen dynamischen Substraten beobachtet. Diese Substrate müssen nicht genau die dynamische Natur der zellulären Mikroumgebung. Unsere Arbeit verschiebt die bestehenden technischen Paradigmen, indem sie einen physiologischen Modell zur Untersuchung von Zell-ECM-Interaktionen auf Erweichung und Versteifungs dynamische Biomaterialien. In früheren Studien untersuchten wir die Wirkungen von dynamische...

Diskussion

Die Fähigkeit von DNA-Gelen zu erweichen oder zu versteifen, bevor und nachdem die Zelladhäsion macht sie zu einem idealen Modell, um die Rolle von Gewebesteifigkeit dynamisch auf die Zellfunktion untersucht werden. Alle drei Ausführungen sind in mechanischen und biologischen Untersuchungen verwendet. Allerdings haben alle drei Ausführungen ähnlich Elastizitäten bei verschiedenen Vernetzungsprozent anzeigt Vernetzungslänge nicht beeinflusst DNA Gel-Elastizität (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu betr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ssDNA	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com		Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium			Any brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com	T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	93290	TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	BP14021	Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	A3678	Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	T9281	Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglass	Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com	12-545-82
Norland optical adhesive 72	Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com	NOA72
24-well tissue culture plate			Any brand.
Microcentrifuge tubes			Any brand.
Sulfo-SANPAH	ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com	C111 or 22589	Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	P6407	Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I	Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com	13813	Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glass	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	12-544-G
Positive-displacement pipette	Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com	F148504
Heat block	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	11-718
UV light source			Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer			Any brand.
Nitrogen gas	GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/	NI 5.0UH-R