JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

当研究室では、より良い細胞機能に組織の硬さを調節する効果を理解するためにDNA架橋ポリアクリルアミドハイドロゲル、動的なヒドロゲル系を開発しました。ここでは、これらのヒドロゲルを調製するための回路図、説明、およびプロトコルを提供する。

要約

メカノは、細胞の形態と機能を向ける内の物理的な手がかりの重要な役割に対処する新たな科学的な領域です。組織の剛性は、疾患、発達、および傷害に調節するため、例えば、細胞機能に対する組織の弾性の影響は、メカノ研究の主要な領域である。細胞がプレーティングされると剛性を変えることができない静的な組織模倣物質、または物質は、主に細胞の機能上の組織の剛性の影響を調査するために使用される。静的試験から収集した情報は貴重であるが、これらの研究は、 生体内での細胞の微小環境の動的な性質を示すものではありません。より良い細胞機能に対する動的剛性の影響に対処するために、DNA架橋ポリアクリルアミドヒドロゲルシステム（DNAゲル）を開発した。他の動的基質とは異なり、DNAゲルは、減少または刺激することなく、製造後に剛性が増加する能力を持っている。 DNAゲルは、DNAのcrosslから成りポリアクリルアミドバックボーンに重合されるインク。追加および一本鎖DNAの送達を介して架橋を除去することは、時間、空間、およびゲル弾性の可逆的制御を可能にする。私たちは、DNAゲルの弾力性の動的調節が線維芽細胞と神経細胞の挙動に影響を与えることがこれまでの報告に示されている。本報告書やビデオでは、準備のDNAゲル上でDNAゲルの架橋メカニズムと、ステップ·バイ·ステップの手順を説明する模式図を提供する。

概要

静的および動的な基板は、細胞機能に対する組織弾性または剛性の効果を研究するために開発された生体材料の二つのカテゴリーである。静的基板は、それらが製造された後、および/または細胞がプレーティングされれば、それらの物理的特性を変更することはできません。ポリアクリルアミド（PA）ゲルはメカノ調査5,17ために合成した第1の2次元、静的な基質であった。 PAゲルは、調製が容易で、安価で、多用途であり、弾性率​​の広い範囲で製造できる。これらの技術的利点は、PAが一般的に適用される基板をゲル化することが、静的な基質は、細胞外マトリックス（ECM）の動的な性質を示すものではないし、インビボで細胞環境を取り囲む。例えば、ECMは、傷害、開発、または疾患の結果としての剛性の変化を受ける。ダイナミック基板は、したがって、メカノ研究における組織模倣基質モデルとして好まれる 22,24,25。

多数の合成は、天然の、二次元、三次元の、静的および動的な生体材料は、組織1,3,6,16,23,26剛性を模倣するために開発されている。いくつかの動的な基板は、それらの機械的特性2,4,7,8,12,15,16を変更するために、熱、紫外線、電流、イオン、pH変化が必要ですが、これらの刺激は、ヒドロゲルのバイオアプリケーションを制限することができます。 DNA架橋ポリアクリルアミドヒドロゲル（DNAゲル）は、動的二次元弾性基質である。 DNAの架橋は、メディアへの一本鎖DNA（ssDNA）の添加によってDNAゲルの剛性の時間的、空間的、可逆変調のために許可または9-11,13,14,18,21バッファ 。刺激は弾力性の調節のために適用され、上記の動的なゲルとは異なり、DNAゲルは、弾力性の変化のために適用された一本鎖DNAの拡散に依存している。したがって、細胞を増殖さ上部ゲル表面は、レートoをので、変調された第1の領域であるF弾性変調はゲルの厚さに依存している。

DNAゲルは、しかしながら、ビス-アクリルアミド架橋はDNA（ 図1）からなる架橋で置き換えられ、それらはポリアクリルアミド骨格を有するという点で、それらのPAゲル対応物に類似している。二つのssDNA（SA1とSA2）は、ゲルのDNA架橋を補うために、架橋剤ストランド（L2）とハイブリダイズ。 SA1とSA2は、両方のPAネットワークへの効果的な取り込みのために、5 '端にアクリダイト修正が含まれている明確な配列を有する。ゲル、SA1およびSA2の調製のために個別にPA主鎖に重合されると、その後、重合されたSA1およびSA2を一緒に混合する。 L2、架橋剤は、SA1およびSA2混合物に添加される。 L2の塩基配列は、両方SA1およびSA2配列に相補的であり、L2は、DNA架橋を形成するSA1プラスSA2とハイブリダイズする。初期、DNAゲルの弾性は、L2濃度および架橋（ 表1の両方によって決定されると2）。 SA1およびSA2は、（100％ゲルと呼ぶ）L2 100質量％架橋されているため、L2、SA1およびSA2の等しい化学量論量を含むDNAゲルは、硬いゲルである。 DNA架橋の低い割合でのL2結果のより低い濃度であり、したがって、よりソフトなDNAゲル。 （50％ゲルと呼ぶ）50％架橋された程度の低いゲルは9-11構築されている。

figure-introduction-1698
図1：DNAゲル架橋およびuncrosslinking概略図9-11,13,14,18,21手順1：SA1（赤）とSA2（青）を個別にポリアクリルアミドバックボーン（黒）に重合される。重合後、SA1およびSA2重合溶液が一緒に混合される。ステップ2：L2（緑）を添加し、ゲルの架橋を形成するSA1プラスSA2とハイブリダイズされる。ステップ3：R2がtとハイブリダイズ彼は、L2の足掛かり。ステップ4：R2の足掛かりハイブリダイゼーションは、SA1とSA2からL2の解凍を推進。

PAゲルとは異なり、DNAゲルは、合成後に硬くかつ柔らかくすることができます。そのため、DNAのゲル上で増殖した細胞は、動剛性の変化に供することができる。細胞接着性ゲルを補強するために、L2は、架橋の割合を増加させるために低いパーセンテージのゲルの培養培地に添加することができる。細胞接着性ゲルを柔らかくするために、L2は、架橋10,13,21の割合を減少させるために除去することができる。 L2は、L2は、SA1およびSA2（ 表1）からuncrosslinkできるように、3 '端に付加的な足掛かり配列を有する。 L2の除去は、R2と呼ばれる反転鎖のハイブリダイゼーションによって達成される。 R2はL2の全長に相補的であり、L2の足掛かりを最初にハイブリダイズする。足掛かりハイブリダイゼーションは架橋を排除し、ゲル剛性を減少させSA1とSA2からL2の解凍を推進する。

本報告ではとビデオは、段階的な手順は、DNAゲルを補強し、軟化させるの調製のために設けられている。 100％および80％ゲル製剤が記載されているが、このプロトコルは、他の初期および最終の架橋割合のDNAゲルを作成するために調整することができる。一般に、100％および80％ゲルを用意し、ガラスカバースリップ上に固定化、官能化、および細胞を播種。 L2は、80％ゲルの培地に添加され、R2は、100％のゲル、メッキの48時間後の培地に添加する。メディアへのR2の添加が80％架橋、100％ゲルを柔らかくし、一方メディアにL2の添加は、架橋された100％、80％ゲルを硬くする。剛化ゲルを80→100％ゲル軟化ゲルとして指定されているテキストで100→80％のゲルとして指定されている。制御または静的ゲル、ssDNAのためにTsとか​​ら成るかのように、100％および80％ゲルの別のセットに配信される。弾性変調次の二日間の最小限の後、細胞を処理し、分析することができる。

DNAクロスリンク 塩基の数 シーケンス（ 足掛かり ） 修飾 融解温度（T mは 、°C） コメント
5 '→3'
デザイン1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'アクリダイト 34.9
SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'アクリダイト 23.6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 10 bpの足掛かりシーケンスが含まれています。
R2 30 CAA GTGタグCGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2はL2に相補的である
デザイン2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'アクリダイト 46.​​9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'アクリダイト 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 12 bpの配列の足掛かりは含まれています。
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65.9 R2はL2に相補的である
療nは3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'アクリダイト 55
SA2 20 CAT GCTタグGGA CGA CTG GA 5 'アクリダイト 56.6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 足掛かりは含まれていません。
コントロール コントロール 20-40 AAA AAA（ など ）や
TTT TTT（ その他 ）

セルラーと機械の研究をd、いくつか利用している。のssDNA 9-11,13,14,18,21表1に塩基配列ifferent架橋設計は、静的および動的機械的特性の範囲を有するDNAゲルを生成する。架橋設計において変調パラメータは、塩基配列と、配列の長さまたは架橋の長さである。太字やイタリック体のフォントは、SA1とL2との間にそれぞれSA2とL2の間の塩基対形成を示している。

デザイン
1 2 3
アクリルアミド濃度（％） 10 10 10 4
SA1プラスL2にハイブリダイズSA2（％架橋） 50 80 100 50 80 100 100 100
<強い>弾力性（キロパスカル、平均±SEM） 6.6±0.6 17.1±0.8 29.8±2.5 5.85±0.62 12.67±1.33 22.88±2.77 25.2±0.5 10.4±0.6

DNAゲルの表2ヤング率（E）9-11,13,14,18,21。アクリルアミド濃度、架橋の割合、および架橋の長さはDNAゲルに変調することができる。設計1,2、及び3は、それぞれ、20,28、および40 bpの架橋長さを有する。すべてのデザインのための100％のゲルは、ゲル弾性に影響を与えない架橋長さを示す類似の弾性率を持っている。しかし、アクリルアミド濃度のばらつきはDNAゲルの弾性を変化させる。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

注：ゲル製剤からの細胞の処理にプロトコル全体は、6日以上かかります。ゲル調製のための推定時間は8時間プラスO / Nインキュベーションである。ゲル固定化し、DNAアニーリングの推定時間は8時間プラスO / Nがすすぎ工程である。ゲル官能化のための推定時間は2時間である。細胞播種と成長のための時間は、培養の種類やアプリケーションに依存しているが、4日以上が必要となります。

DNAのゲルの調製

注：三つの異なる段階でのDNAのゲルを準備します。まず、個別のPAバックボーンにSA1とSA2のssDNAを重合する。これらのソリューションは、（§1.1）は、それぞれ、SA1、重合液およびSA2重合したソリューションと呼ばれます。第二に、架橋剤は、可逆的鎖と、制御たssDNAを溶解する。凍結乾燥されたL2のssDNA（架橋剤）を溶解する。これは、100％L2溶液と呼ばれ、100％のゲル（§1.2）を作製するために使用される。 100％のL2溶液のアリコートを希釈し80％。これは、80％L2溶液と呼ばれ、80％のゲルを製造するために使用される。 §4で使用する凍結乾燥されたR2（可逆ストランド）と制御のssDNAに溶解する。それぞれ、100％および80％ゲルを形成する10：6（L2 SA1：SA2）第三に、10の比でSA1重合溶液、SA2重合溶液および100％または80％L2の溶液を混合する。 （§1.3）。

SA1とSA2重合した溶液の調製

  1. 表1及び表2から、適切なSA1、SA2、L2およびR2の塩基配列を選択し、注文する。塩基配列および配列長は、以前の報告9-11,13,14に最適化した。
  2. すべての溶液製剤（ 表3-4）を計算します。注：トラブルシューティングのために細心の注意を払った文書の計算。 Excelテンプレートの構築が推奨され、DNAゲル調製のために繰り返し使用することができる。 （デザイン2用集計の例については、 表3および4を参照してください表1および2）。表4に指定されたボリュームは、このプロトコル全体で使用されますが、ボリュームは凍結乾燥された一本鎖DNAの各分量に応じて変化する。
ソリューション ソリューションのストック濃度 SA1やSA2溶液重合における原液の割合（V / V） SA1やSA2重合した中の溶液の最終濃度
アクリルアミド（なし - ビスアクリルアミド） 40％ 25 10％
SA1やSA2ソリューション 100％ 60 60％
TBEバッファー 10倍 10 1倍
TEMED 20％ 2.5 0.50％
APS 2％ 2.5 0.05％

表3。SA1やSA2重合したソリューションを製造するためのソリューションの割合。最初の列は、DNAゲルを調合するためのソリューションを示しています。 2番目の列には、これらのソリューションのストック濃度を示している。 3列目SA1またはSA2重合溶液中のストック溶液のパーセンテージを示す（v / v）である。最後の列は、SA1とSA2ソリューションにおける最終濃度を反映している。

のssDNAソリューション（§1.1）
ソリューションコンポーネント
ソリューション ストック濃度 最終的な溶液濃度 計算 追加金額 コメント
SA1ソリューション 凍結乾燥されたSA1のssDNAの320.7ナノモル 3.00 mMの 320.7ナノモル/ 3.00ナノモルμlの-1 = 107μlの凍結乾燥された一本鎖DNAへのTE緩衝液107μlを SA1溶液は、SA1、重合溶液の60％である。
107μL/ 0.600 = 178μlの
178μlのSA1、重合溶液（ 表3）の全容積である。
SA2ソリューション 凍結乾燥したSA2のssDNAの324.4ナノモル 3.00 mMの 324.4ナノモル/ 3.00ナノモルμlの-1 = 108μlの凍結乾燥された一本鎖DNAへのTE緩衝液108μlをSA2溶液は、SA2、重合溶液の60％である。
108μL/ 0.600 = 180μlの
180μlをSA2、重合溶液（ 表3）の総容量である。
100％のL2ソリューション 凍結乾燥されたL2のssDNAの657.4ナノモル 3.00 mMの 657.4ナノモル/ 3.00ナノモルμlの-1 = 219μlの凍結乾燥された一本鎖DNAへのTE緩衝液219μlを 80％L2溶液に100％L2のアリコートを希釈
80％のL2ソリューション 100％のL2のssDNAを80μl 80％ - 100％のL2ソリューションを80μlにTE緩衝液20μl
対照溶液 凍結乾燥されたの332.6ナノモルのポリTまたは一本鎖DNA 3.00 mMの 332.6ナノモル/ 3.00ナノモルμlの -1 = 111μlの凍結乾燥された一本鎖DNAへのTE緩衝液111μlを
R2ソリューション 凍結乾燥したR2のssDNAの193.8ナノモル 3.00 mMの 193.8ナノモル/ 3.00ナノモルμlの-1 = 64.6μlの凍結乾燥された一本鎖DNAへのTE緩衝液64.6μlの
重合しソリューション（§1.2）
SA1重合したソリューション 40％のアクリルアミド 10％ 178μlのX 0.25 = 44.5μlの 45μlの （上記の表3参照）178μlの総容量に基づいて、アクリルアミド、TBE、APSおよびTEMEDの量を計算します。
10×TBE 1倍 178μlのX 0.10 = 17.8μlの 18μlの
100％SA1溶液 60％ - 107μlの SA1溶液（上記表3参照）SA1重合溶液の60％である。
2％APS 0.05％ 178μlのX 0.025 = 4.45μlの 4.5μlの TEMEDを追加する前に、APSを加え、混合する。
20％TEMED 0.50％ 178μlのX 0.025 = 4.45μlの 4.5μlの
SA2重合したソリューション 40％のアクリルアミド 10％ 180μlのX 0.25 = 45μlの 45μlの （上記の表3参照）を180μlの全体積を基準にしてアクリルアミド、TBE、APSおよびTEMEDの量を計算します。
10×TBE 1倍 180μlのX 0.10 = 18μlの 18μlの
100％SA2溶液 60％ - 108μlの SA2溶液（上記表3参照）SA2重合溶液の60％である。
2％APS 0.05％ 180μlのX 0.025 = 4.5μlの 4.5μlの TEMEDを追加する前に、APSを加え、混合する
20％TEMED 0.50％ 180μlのX 0.025 = 4.5μlの 4.5μlの
ゲル溶液（§1.3）
100％のゲル溶液 100％SA1重合化ソリューション 10部 - 10μlの以下SA1 100％ゲルを構成する：SA2：L2比10：10：6。
100％SA2の重合ゾルution 10部 - 10μlの
100％のL2ソリューション 6部 - 6μlの
80％のゲル溶液 100％SA1重合化ソリューション 10部 - 10μlの以下SA1 80％ゲルを構成する：SA2：L2比10：10：6。
100％SA2重合化ソリューション 10部 - 10μlの
80％のL2ソリューション 6部 - 6μlの
ダイナミックゲル（§3-4）
80→100％ゲル 80％ゲル 100％GEL 計算1： 培養培地への100％のL2溶液1μl 計算は、カバースリップ上に20μlのゲルを有することに基づいている。まず、μlの中にゲルの20μlの100％のL2ソリューションの一部を変換します。第二に、架橋の追加の20％のために必要な100％のL2液（μlの）量を算出する。ゲルに100％のL2液のこの量を追加します。
（20μL/ 26部）6部= 4.6μlのX
計算2：
5μlのX 0.2 = 1μlの
100→80％ゲル 100％ゲル 80％ゲル計算1： 培養培地への100％のR2溶液1μl 計算は、カバースリップ上に20μlのゲルを有することに基づいている。まず、Tに変換μlの中にゲルの20μlの100％のL2ソリューションの彼の部分。第二に、20％ゲルを構成するために除去する必要が100％L2溶液（μlの中で）の量を計算する。ゲルにR2液のこの量を追加します。
（20μL/ 26部）6部= 4.6μlのX
計算2：
5μlのX 0.2 = 1μlの
100％ゲル（コントロール） 100％ゲル 100％ゲル - 培養培地への制御溶液1μl 対照溶液の量は、溶液を添加R2の量に相当する。
80％ゲル（コントロール） 80％ゲル 80％ゲル - 培養培地への制御溶液1μl 対照溶液の量は、L2溶液を添加し、100％の量に相当する。

DNAゲルを調製するための表4の例の計算。モック数字は80％、100％、100→80％、80→100％ゲルを調製するための計算を説明するために提供される。 DNAゲルは、 表1のデザイン2である。

  1. すべてのssDNAを確保するために15秒2000×gで遠心分離し、凍結乾燥SA1のssDNAは、バイアルの底にある。注：SA1液の適切な濃度は、DNAゲル合成のために重要である。
  2. バイアル（ 表3-4）に1×トリス-EDTA、pH8.0緩衝液（TE緩衝液）の107 ​​を添加することにより、SA1液の3mMのを準備します。
  3. 5分間または一本鎖DNAペレットが完全に溶解するまで70℃のTE緩衝液中の熱SA1。 NOTE：加熱温度はDNAが一本鎖状態であることを確認するために融解温度（T m）より5°Cの最小であるべきである。
  4. 40％のアクリルアミドを添加することによりSA1重合溶液を調製し、10xのトリス-ホウ酸-EDTA示さ割合で（TBE）バッファー（ 表3）。この例では、SA1溶液（ 表4）の107μlに、それぞれ、45および18μlを添加する。
  5. 3分間窒素ガスで脱気混合を容易にする。溶液中に窒素ガス源に取り付けP200先端を挿入し、ゆっくりと窒素ガスを溶液に通過させる。スプラッタを防止するために、前脱気SA1溶液に、水中の窒素ガスの流量を試験する。
  6. 解決策を収集するために、2000×gで15秒間遠心します。
  7. ゲル重合を開始するために、2％過硫酸アンモニウム4.5μlの（APS、 表3-4）を加える。
  8. 混合するチューブを数回転倒。
  9. 均質な重合のためのソリューションを収集するために、2000×gで15秒間遠心する。
  10. 重合を触媒するために20％のテトラメチルエチレンジアミン（TEMED、 表3-4）の4.5を添加する。
  11. チューブを反転ミックスを数回。
  12. 均質な重合のためのソリューションを収集するために、2000×gで15秒間遠心する。
  13. 3〜5分間窒素ガスで脱気し、重合を完了し、未反応モノマーを最小限にする。
  14. 重合を完了し、RTで10分間溶液をインキュベートする。注：このソリューションは、SA1、重合ソリューションと呼ばれています。
  15. 繰り返しますが、凍結乾燥SA2のssDNAと1.1.3-1.1.16を繰り返したが、アクリルアミドの45、18、4.5、および4.5μLを追加し、TBE、APSおよびTEMED、SA2溶液（ 表3-4）のそれぞれに108μlの。 NOTE：SA1およびSA2重合溶液は、1ヶ月まで4℃で保存することができる。

L2、R2、および制御ソリューションの調製

  1. 凍結乾燥されたR2のssDNAとの手順を繰り返しますが、1.1.3-1.1.5 TEバッファー（ 表4）の64.4μlを添加する。
  2. TE緩衝液111μlを（ 表4を凍結乾燥されたコントロールのssDNAと1.1.3-1.1.5の手順を繰り返しますが、追加）。
  3. 凍結乾燥されたL2のssDNAと1.1.3-1.1.5の手順を繰り返しますが、TEバッファー（ 表4）の219μlを添加する。注：これは100％のL2ソリューションです。 SA1、SA2、およびL2は、化学量論的に等価になるので（§1.3参照）SA1およびSA2重合ソリューション100％L2溶液を添加すると、100％架橋したDNAゲル（100％ゲル）を形成する。
  4. 100％L2溶液を80μl（ 表4）に1×TE緩衝液20μlを添加することにより80％、100％L2溶液のアリコートを希釈する。注：このソリューションは、80％のL2ソリューションです。 SA1およびSA2のわずか80％がL2に架橋されるため（§1.3参照）SA1およびSA2重合溶液への80％L2溶液を添加すると、80％の架橋されたDNAゲル（80％ゲル）を形成する。ソリューションは、1ヶ月まで4℃で保存することができる。

ゲル溶液の調製

  1. 溶液粘度が低下するまで70℃で加熱SA1およびSA2重合の溶液（約1分）。 80℃までの温度を上げる解決策はまだピペットにあまりにも粘性であれば、C。
  2. SA2の重合溶液（ 表4）を10μlまたは10部に10μlあるいはSA1重合した溶液を10部を追加します。注：SA1とSA2重合したソリューションは、ピペットに非常に粘性が困難である。濃度はゲル形成に重要であるため、これ以降の容積式ピペットを使用したり、その他の取り扱い技術のための説明を参照してください。また、複数の、少量のアリコート（>20μL）のではなく、単一の大きなボリューム内のピペット。
  3. （70℃で15秒間）加熱を交互に1分間の合計（ピペットチップで15秒間）しながら介して一緒SA1とSA2重合した溶液を混合。
  4. 100％ゲル（ 表4）を形成するために6μlの100％L2水溶液6部を加える。
  5. 加熱を交互にステップ1.3.3で説明したように撹拌することにより混合する。
  6. 最適なアニーリング温度（35℃）で1時間熱ゲル。計算最低溶融温度（ 表1）のssDNA配列から5°Cを減算することにより温度をnnealing。
  7. 60mmのペトリ皿に100％のゲルをピペットで。
  8. DNA架橋は、室温で4時間ゲルをインキュベートすることによりrehybridizeし続けることができるようにします。
  9. PBSをカルシウム及びマグネシウムを含有し、室温でO / Nインキュベートしてゲルをカバー。注：ゲルは約3倍の初期体積を膨張します。また、ゲルは、ゲルの外に拡散し、バッファと過剰アクリルアミドと平衡します。 PBS中のカルシウムとマグネシウムは、（ゲルバーストをtoubleshootingためのディスカッションを参照）DNAハイブリダイゼーションを安定化させ、ゲル破裂を防ぐ。
  10. ペトリ皿からの残りのバッファを削除します。
  11. 80％のゲルを製造するために、繰り返し1.3.1-1.3.10を繰り返したが80％のL2溶液とステップ1.3.4で100％のL2ソリューションを交換してください。 1ヶ月まで4℃で100％および80％ゲルを保管してください。注：80％〜100％ゲル剛性の違いは、物理的に区別可能である。

    12. ガラス上の2。ゲルの固定化

    注：ガラスカバースリップ上に100％または80％ゲルのアリコートを固定化する（ 図2）。

    1. 約30秒間、またはゲルがピペッティングのために低粘度になるまで、70℃で100％のゲルを加熱する。
    2. 置きガラスカバーは、70℃のヒートブロック上に滑って1〜2分間加熱することができます。
    3. 各ガラスカバースリップへの光学接着剤の液滴を追加します。
    4. 各ガラスカバースリップ（ 表4）100％ゲル20μlのを追加します。注：10〜30μlを各カバースリップ上に分配することができます。
    5. ゲルが溶融し、ガラスカバースリップに広がるようにします。注：ゲル·トポロジーにも溶融後、シリコン処理ガラスカバースリップでゲルを平らに表示されない場合。しかし、追加の腫れがその後の工程で発生し、ゲルムラに貢献していきます。
    6. 24ウェル組織培養皿にヒートブロックと場所からガラス含有ゲルを取り外します。
    7. 8で、手順2.1から2.6を繰り返します 0％ゲル。
    8. 最適なアニーリング温度（35°C）で1時間熱ゲル。注：ゲルが乾燥することは正常であり、ゲルは、PBS中でインキュベートされたとき、これが解決されます。
    9. 15分間紫外線（UV 365 nm）の光に対して80％を含有するプレート100％ゲルを露出させる。注：UV露光が同時に接着剤を硬化し、ゲルを滅菌する。 UV架橋室が利用できない場合、ゲルは、生物学的安全キャビネットに搭載され、UV光下に置くことができる。 UV露光した後、ゲル無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネットの下で、このプロトコルのその後の手順を実行します。また、これ以降の無菌溶液を使用しています。
    10. のDNA架橋が4時間、室温でrehybridizeできるようにします。
    11. PBSを加え、4℃でO / Nインキュベートする。注：PBSのインキュベーションは、リンス平衡、その繰り返しの加熱ゲルを脱水することができるので、再びゲルを膨潤する。

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    ゲル固定化および官能化の図2の回路図 （灰色）DNAゲルを調製した後、ゲルを、光学接着剤（緑）でガラスカバースリップ（白）に取り付けられている。ゲルは、同時に硬化させ、UV光により滅菌される。膨潤後、ゲルは、約1mmの厚さである。次に、ゲルは、二段階プロセス（赤概説ボックス）で官能化される。まず、スルホ-SANPAH、UV光照射によってゲル表面にアクリルアミドに結合される。第二に、ゲルはコラーゲンまたはスルホ-SANPAHでスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルに付着したポリ-D-リジン、と共にインキュベートする。この図は、10から変更されている。

    3ジェル機能化

    NOTE：ポリアクリルアミドゲルは、不活性材料（ 図2）であるので、DNAゲル官能化は、細胞接着に必要とされる。このセクションでは、ゲルは、二段階で官能化される。まず、N -Sulfosuccinimidyl -6-（4 -＃39; - アジド2'-ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸またはスルホ-SANPAHが共有結合するDNAゲルのポリアクリルアミドバックボーンにニトロフェニルアジド基の光分解によってリンクされます。第二に、コラーゲンまたはポリ-D-リジンでの第一級アミンは、ゲル表面にタンパク質を付着させるスルホ- SANPAHにおけるスルホNヒドロキシスクエステルに添付します。

    1. ピペットでウェル中のバッファを削除し、ゲルを吸引しないように注意してください。注：ゲルを吸引する確率を減らすために真空吸引を行わないでください。
    2. オプション）ウォッシュゲルは、三度、室温で15分間過剰アクリルアミドモノマー、TEMEDおよびAPSを削除します。
    3. 各ゲルをカバーするためにスルホ - SANPAHの約300を添加する。
    4. 5分間のUV（365 nm）にゲルを公開します。
    5. スルホ - SANPAHを削除します。
    6. 過剰スルホSANPAHを除去するためにPBSで一回ゲルを洗浄します。
    7. 繰り返します3.3から3.6を繰り返します。
    8. RTで1時間、ポリ-D-リジン0.2 mg / mlでの約300μlのまたはO / Nで4℃でゲルをインキュベートする。注：別の方法として、コラーゲン1型、O / N、4℃での0.2 mg / mlのでゲルをインキュベートする。
    9. 過剰のポリ-D-リジンを除去するために5分間のPBSで2回ゲルを洗浄する。
    10. ゲルを平衡化し、30分間のメディア約300μlの中でゲルをインキュベートする。
    11. すぐに細胞を播種する前に、メディアを取り出します。

    4。細胞培養およびイメージング

    注：このセクションでは、細胞播種後のゲルの軟化または補強に関する詳細を提供する。詳細な細胞培養プロトコルは、いくつかの理由のために設けられていない。まず、多数の細胞型は、DNAゲルに付着することができ、各細胞型は、細胞播種のために研究者によって特定の調整を必要とする。第二に、標準的な細胞および組織培養技術は、これらの実験のために使用され、数多くのオリジナルの記事、技術資料、および参考書に記載されています。特に、DNAゲルに線維芽細胞と神経細胞をメッキするための技術はpreviに記載されていますOUの出版物9-11,19-21。

    1. プレート細胞。解剖および/ ​​またはこの資料に記載された神経細胞や線維芽細胞の培養に関するプロトコルの場合、以下の出版9-11,19-21のいずれかを参照。
    2. 48時間の最小値後、ゲル（ 表4）に近い制御、L2、またはR2溶液1μlをピペッティングすることによって、ゲルの剛性を調節する。
      1. （80→100％ゲル）、架橋80％から100％までのゲルを補強するために、ゲルに近い100％のL2溶液1μlを添加することにより、80％のゲルにL2の残りの20％を加算。
      2. 架橋の80％​​（100→80％ゲル）を100％からゲルを柔らかくするために、R2がゲルに100％に近いR2溶液1μlを添加することにより、100％のゲルからの架橋の20％を除去するために追加する。
      3. コントロールの場合、ゲルに近い対照溶液1μlを添加することにより、100％および80％ゲルのサブセットにコントロール溶液の等容量を追加します。
    3. 後に所望の細胞処理及びデータ分析を実行48時間の最小値。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

本発明者らの研究に先立って、細胞 - ECM相互作用は、静的に準拠生体材料上または不可逆一方向動的基板上に観察された。これらの基板は、正確な細胞の微小環境の動的な性質を反映していない。私たちの仕事は、動的な生体材料を軟化し、補強に細胞-ECM相互作用を研究するための、より生理的なモデルを提供することで、既存の技術上のパラダイムをシフトする。以前の研究では、これ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

細胞接着は、それらの細胞機能に対する動的な組織の剛性の役割を研究するための理想的なモデルとなる前と後の軟化または硬くするDNAゲルの能力。すべての3つの設計では、機械的および生物学的研究に使用されている。しかし、すべての3つのデザインは、架橋の長さはDNAゲル弾性（ 表2）影響を与えないことを示す、さまざまな架橋の割合で同様弾力性を持っている。これと?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者らは、開示することは何もない。

謝辞

作者は感謝したいと思います：博士フランク·江、デビッド·リン博士バーナードYurke博士ウダイChippadaをDNAゲル技術の開発に貢献するために、博士ノレルHadzimichalis、スミット·シャー、キンバリーピーターマン、ロバートArterこの原稿の彼らのコメントや編集をするため;脊髄研究に関するニュージャージー委員会（助成＃07A-019-SCR1、NAL）とニュージャージー神経科学研究所（MLP）を含む資金調達源; 図3を転載する許可を図2と図4およびバイオマテリアルを転載する許可のための組織工学のパブリッシャー、パートA。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
ssDNAIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesiumAny brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)93290TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solutionFisher Scientific (Pittsburg, PA)BP14021Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)A3678Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)T9281Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglassFisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		12-545-82
Norland optical adhesive 72Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		NOA72
24-well tissue culture plateAny brand.
Microcentrifuge tubesAny brand.
Sulfo-SANPAHProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		C111 or 22589Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)P6407Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type IAffymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		13813Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glassFisher Scientific (Pittsburg, PA)12-544-G
Positive-displacement pipetteGilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		F148504
Heat blockFisher Scientific (Pittsburg, PA)11-718
UV light sourcePlace gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
ThermometerAny brand.
Nitrogen gasGTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		NI 5.0UH-R

参考文献

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

90 ECM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved