JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Наша лаборатория разработала ДНК-сшитый полиакриламид гидрогели, динамическую систему гидрогеля, чтобы лучше понять эффекты модуляции ткани жесткость на функции клеток. Здесь мы предоставляем схемы, описания и протоколы по подготовке этих гидрогели.

Аннотация

Mechanobiology является новым научно область, которая рассматривается принципиально важная роль физических сигналов в направляя морфологию и функции клеток. Например, эффект эластичности тканей на функции клеток является одной из основных областей mechanobiology исследований, потому что ткани жесткость модулирует с болезнями, развития и травмы. Статические ткани имитирующие материалы или материалы, которые не могут изменить жесткость раз клетки высевают, которые преимущественно используются для изучения влияния ткани жесткости на клеточных функций. В то время как информация, собранная из статических исследований ценно, эти исследования не свидетельствуют о динамической природе сотовой микросреды в естественных условиях. Для более эффективного решения эффекты динамической жесткости на функции клеток, мы разработали ДНК-сшитый систему полиакриламидного гидрогеля (гели ДНК). В отличие от других динамических подложках, гели ДНК обладают способностью уменьшать или увеличивать в жесткости после изготовления без стимулов. Гели ДНК состоят из crossl ДНКчернила, которые полимеризуются в полиакриламидном позвоночника. Добавление и удаление сшивки через доставку одноцепочечной ДНК позволяет временные, пространственные и обратимым контроль эластичности геля. Мы показали в предыдущих докладах, что динамическая модуляция упругости геля ДНК влияет фибробластов и нейронов поведение. В этом докладе и видео, мы предоставляем схему, которая описывает гель ДНК механизмы сшивания и шаг за шагом инструкции по гелей подготовка ДНК.

Введение

Статические и динамические субстраты две категории биоматериалов, которые были разработаны, чтобы изучить эффекты ткани эластичности или жесткости на функции клеток. Статические субстраты не в состоянии изменить свои физические свойства после того как они изготавливаются и / или раз клетки высевают. Полиакриламидные (PA) гели были первые двумерные статические субстраты, которые были синтезированы для mechanobiology исследований 5,17. PA гели легко приготовить, недорогой, универсальный, и может быть изготовлен с широким диапазоном модулей упругости. Хотя эти технические преимущества делают PA гели с широко применяется субстрат, статические субстраты не свидетельствует о динамической природе внеклеточного матрикса (ECM) и окружающей клеточной среде в естественных условиях. Например, ECM подвергается жесткости изменения в результате травмы, развития или заболевания. Динамические субстраты поэтому выступает как ткани имитирующие моделей подложки в mechanobiology исследований 22,24,25.

Многочисленные синтетические, натуральные, двумерные, трехмерные, статические и динамические биоматериалы были разработаны, чтобы имитировать ткани жесткость 1,3,6,16,23,26. Некоторые динамические субстраты требуют тепла, УФ, электрический ток, ионы, и изменения рН изменить свои механические свойства 2,4,7,8,12,15,16, но эти стимулы могут ограничить био-приложение гидрогеля в. ДНК-сшитый полиакриламид гидрогели (гели ДНК) являются динамичный двухмерный упругие субстраты. Сшивки ДНК позволяют временной, пространственной, и обратимой модуляцией гель ДНК жесткости добавлением одноцепочечной ДНК (оцДНК) к средствам массовой информации или буфер 9-11,13,14,18,21. В отличие от указанных выше динамических гелей, где раздражители применяются для модуляции упругости, гели ДНК основаны на диффузии прикладной оцДНК для изменения упругости. Таким образом, верхняя поверхность геля, где выращивают клетки, является первой областью модулированный так как скорость выводаF упругости модуляции зависит от толщины геля.

Гели ДНК схожи с их аналогами гель ПА в том, что они имеют полиакриламидном основу, однако бис-акриламида сшивки заменены, составленных из сшивок ДНК (рисунок 1). Два ssDNAs (SA1 и SA2) гибридизации с сшивателя нити (L2), чтобы составить сшивки ДНК в геле. SA1 и SA2 имеют различные последовательности, что и содержащие модификацию Acrydite в конце 5'для эффективного включения в сети ООПТ. Для подготовки гели, SA1 и SA2 индивидуально полимеризуется в позвоночнике Звуковая и, впоследствии, полимеризованный SA1 и SA2 смешиваются. L2, сшивающий агент, добавляют к SA1 и SA2 смеси. Последовательность оснований L2 является дополнением к обоим SA1 и SA2 последовательностей и L2 гибридизуется с SA1 SA2 плюс для формирования сшивок ДНК. Начальное, упругость гель ДНК определяется как концентрации L2 и сшивания (таблицы 1 и 2). Гели ДНК, содержащие равные стехиометрических количеств L2, SA1, SA2 и являются армированных гели потому SA1 и SA2 100% сшитый L2 (обозначенного как 100% гелей). Более низкие концентрации L2 результате в более низкий процент сшивки ДНК и, следовательно, более мягкие гели ДНК. Гели, как низкие, как 50% сшитого (обозначены как 50% гели) были построены 9-11.

figure-introduction-3482
Рис.1 гель ДНК сшивания и uncrosslinking принципиальная 9-11,13,14,18,21 Шаг 1:. SA1 (красный) и SA2 (синий) индивидуально полимеризуется в полиакриламидном позвоночника (черный). После полимеризации SA1 и SA2 Полимеризованные растворы смешивают вместе. Шаг 2: L2 (зеленый) добавляется и гибридизуется с SA1 SA2 плюс для формирования сшивки геля. Шаг 3: R2 гибридизуется с тон опоры из L2. Шаг 4: опоры гибридизация R2 продвигает распаковки из L2 от SA1 и SA2.

В отличие от ПА гелей, гелей ДНК могут ужесточить и смягчить после синтеза. По этой причине, клетки, выращенные на гелей ДНК могут быть подвергнуты динамических изменений жесткости. Для придания жесткости гели клеток прилипания, L2, могут быть добавлены в культуральную среду низких процентных гелей, чтобы увеличить процент сшивок. Чтобы смягчить гели клеток-единомышленником, L2 могут быть удалены, чтобы уменьшить процент сшивки 10,13,21. L2 имеет дополнительное последовательность опоры в конце 3', чтобы позволить L2, чтобы uncrosslink от SA1 и SA2 (Таблица 1). Удаление L2 осуществляется путем гибридизации разворота нити под названием R2. R 2 является дополнением к полной длины L2 и гибридизуется с первым плацдарм L2. Опоры гибридизации продвигает распаковки из L2 от SA1 и SA2, что исключает поперечных связей и снижает жесткость геля.

В этом докладе, ивидео, шаг за шагом инструкции предназначены для подготовки жесткости и смягчения гели ДНК. В то время как 100% и 80% гель препараты описаны, этот протокол может быть адаптирована для создания гели ДНК других начальных и конечных сшитых процентах. В общем, 100% и 80% гели получают, иммобилизуют на стекло покровные стекла, функционализированные и засевали клетками. L2, добавляется в средствах массовой информации 80% гели и R2 добавляется в средствах массовой информации о 100% гелей, 48 ч после посева. Добавление L2 на носитель застывает 80% гели в 100% сшитый, в то время как добавление R2 на носитель смягчает 100% гели с 80% сшитого. Окоченевшего гели обозначены как 80 → 100% гелей и смягченные гели обозначаются как 100 → 80% гели в тексте. Для контроля или статических гелей, одноцепочечной ДНК, состоящая из Ц. или Как доставляется к другому набору 100% и 80% гелей. После не менее двух дней, следующих упругости модуляции, клетки могут быть обработаны и проанализированы.

Сшивки ДНК # Основ Последовательность (опоры) Модификация Температура плавления (Т м, ° C) Комментарии
5 '→ 3'
Дизайн 1 SA1 10 GCA ССТ ТТГ C 5 'Acrydite 34,9
SA2 10 GTC AGA ATG 5 'Acrydite 23.6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA ГГТ GC G CTA CAC ТТГ 56 Последовательность плацдарм 10 б.п. включен.
R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC ТТТ GCG ТСА GAA TGA R 2 является дополнением к L2
Дизайн 2 SA1 14 ВКТ GGC ATA GGA КТ 5 'Acrydite 46.9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC GTC CTA ТГК CAC G GT TAC СТТ CAT C 65.9 Последовательность плацдарм 12 б.п. включен.
R2 40 GAT GAA ГГТ AAC ВКТ GGC ATA GGA CTG ТТТ CCC AAT CAG 65.9 R 2 является дополнением к L2
Desigн 3 SA1 20 ACG GAG GTG ТАТ GCA ATG TC 5 'Acrydite 55
SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56.6
L2 40 TCC AGT ВКТ CCC ТАА GCA TG G ACA ТТГ CAT ACA ССТ CCG T 68.8 Опоры не входит.
Управления Управления 20-40 AAA AAA (и т.д.) или
ТТТ ТТТ (и т.д.)

Таблица 1 Базовые последовательности для одноцепочечной ДНК 9-11,13,14,18,21. Сотовый и механические исследования использованы несколько дifferent поперечные конструкции для создания гелей ДНК с рядом статических и динамических механических свойств. Параметры модулированные в дизайне сшивки являются последовательность оснований и длина последовательности или длина сшивки. Смелые и курсивом шрифты иллюстрируют спаривание оснований между SA1 и L2, а также между SA2 и L2 соответственно.

Дизайн
1 2 3
Акриламид Концентрация (%) 10 10 10 4
SA1 плюс SA2 гибридизации с L2 (% сшитого) 50 80 100 50 80 100 100 100
<сильный> Эластичность (кПа, среднее ± SEM) 6.6 ± 0.6 17,1 ± 0,8 29,8 ± 2,5 5.85 ± 0.62 12.67 ± 1.33 22.88 ± 2.77 25,2 ± 0,5 10.4 ± 0.6

Таблица 2 модуль Юнга (Е) гелей ДНК 9-11,13,14,18,21. Концентрации акриламида, сшивки и процент длины сшивки можно модулировать в геле ДНК. Конструкции 1, 2, и 3 имеют 20, 28, и 40 п.о. поперечных длин, соответственно. 100% гели для всех конструкций имеют аналогичные модули, указывающий сшивания длину не влияет эластичность геля. Тем не менее, вариации в концентрации акриламида изменить эластичность ДНК из геля.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся протокол от приготовления геля к обработке клеток занимает минимум шесть дней. Расчетное время для приготовления геля составляет 8 ч плюс O / N Инкубационный. Расчетное время для гель иммобилизации и отжига ДНК является 8 часов плюс O / N полоскания. Расчетное время для гель функционализации является 2 ч. Время для посева и роста клеток зависит от типа культуры и применения, но не менее четырех дней требуется.

1 Получение гелей ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка гели ДНК в трех шагах. Во-первых, индивидуально полимеризации SA1 и SA2 одноцепочечной ДНК в позвоночнике PA. Эти растворы называются полимеризованный раствор SA1 и SA2 полимеризованного раствора, соответственно (§ 1.1). Во-вторых, распустить сшивающий агент, обратимое прядь и управления ssDNAs. Растворите лиофилизированный L2 одноцепочечной ДНК (сшивающего). Это называется 100% раствора L2 и используется для изготовления 100% гели (§ 1.2). Развести аликвоту 100% растворе L2до 80%. Это называется 80% раствор L2 и используется для изготовления 80% гели. Растворите лиофилизированный R2 (обратимым нити) и управления одноцепочечной ДНК для использования в § 4. В-третьих, смешать SA1 полимеризованный раствор, раствор полимеризованного SA2 и 100% или 80% раствора L2 в соотношении 10: 10: 6 (SA1: SA2: L2) с образованием 100% и 80% гели, соответственно. (§ 1.3).

1 Подготовка SA1 и SA2 полимеризованном Solutions

  1. Выберите и заказать подходящий SA1, последовательности оснований SA2, L2 и R2 от таблицах 1 и 2. Базовые последовательности и длина последовательности были оптимизированы в предыдущих докладах 9-11,13,14.
  2. Рассчитать все форме растворов (таблицы 3-4). ПРИМЕЧАНИЕ: тщательно расчеты документов для устранения неполадок. Построение шаблона Excel рекомендуется и может быть использован повторно для получения ДНК из геля. Пожалуйста, смотрите таблицы 3 и 4 для примера подведения для дизайна 2 (В таблицах 1 и 2). Объемы, указанные в таблице 4, будет использоваться в течение этого протокола, но объемы будут меняться в зависимости от каждого аликвоты лиофилизированного оцДНК.
Решение Со концентрации раствора Процент маточного раствора в SA1 или SA2 полимеризованном решения (о / о) Конечная концентрация раствора в SA1 или SA2 полимеризованном решения
не акриламид (No-бисакриламида) 40% 25 10%
SA1 или SA2 решение 100% 60 60%
КЭ буфер 10x 10 1x
TEMED 20% 2.5 0.50%
APS 2% 2.5 0,05%

Таблица 3. Процент решений для изготовления SA1 или SA2 заполимеризованные решения. Первая колонка показывает решения для формулирования гели ДНК. Вторая колонка показывает фондовые концентрации этих растворов. В третьем столбце показан процент исходных растворов в SA1 или SA2 полимерных растворов (объем / объем). В последнем столбце отражает конечные концентрации в SA1 и SA2 решений.

оцДНК решения (§ 1.1)
Компоненты решения
Решение Со Концентрация Конечная концентрация Решение Расчет Добавочная Комментарии
Решение SA1 320,7 нмоль лиофилизированного SA1 одноцепочечной ДНК 3,00 мМ 320,7 нмоль / 3.00 нмоль мкл -1 = 107 мкл 107 мкл ТЕ-буфера к лиофилизированной одноцепочечной ДНК SA1 раствор 60% SA1 полимеризованного раствора.
107 мкл / 0,600 = 178 мкл
178 мкл является общий объем SA1 полимеризованном решения (Таблица 3).
Решение SA2 324,4 нмоль лиофилизированного SA2 одноцепочечной ДНК 3,00 мМ 324,4 нмоль / 3.00 нмоль мкл -1 = 108 мкл 108 мкл ТЕ-буфера к лиофилизированной одноцепочечной ДНК SA2 раствор 60% SA2 полимеризованного раствора.
108 мкл / 0,600 = 180 мкл
180 мкл является общий объем SA2 полимеризованном решения (Таблица 3).
100% решение L2 657,4 нмоль лиофилизированного L2 одноцепочечной ДНК 3,00 мМ 657,4 нмоль / 3.00 нмоль мкл -1 = 219 мкл 219 мкл ТЕ-буфера к лиофилизированной одноцепочечной ДНК Развести аликвоту 100% L2 до 80% раствора L2
80% раствор L2 80 мкл 100% L2 одноцепочечной ДНК 80% - 20 мкл ТЕ-буфера в 80 мкл 100% растворе L2
Контрольный раствор 332,6 нмоль лиофилизированный поли T или онДНК 3,00 мМ 332,6 нмоль / 3.00 нмоль мкл -1 = 111 мкл 111 мкл ТЕ-буфера к лиофилизированной одноцепочечной ДНК
Решение R2 193,8 нмоль лиофилизированного R2 одноцепочечной ДНК 3,00 мМ 193,8 нмоль / 3.00 нмоль мкл -1 = 64,6 мкл 64,6 мкл ТЕ-буфера к лиофилизированной одноцепочечной ДНК
Полимеризованные решения (§ 1.2)
SA1 полимеризуется решение 40% акриламида 10% 178 мкл х 0,25 = 44,5 мкл 45 мкл Рассчитать количество акриламида, КЭ, APS, и TEMED на основе общего объема 178 мкл (смотри выше и в таблице 3).
10x КЭ 1x 178 мкл х 0,10 = 17,8 мкл 18 мкл
100% раствор SA1 60% - 107 мкл SA1 раствор 60% полимеризованного раствора SA1 (смотри выше и в таблице 3).
2% APS 0,05% 178 мкл х 0,025 = 4,45 мкл 4,5 мкл Добавить и смешать APS перед добавлением TEMED.
20% TEMED 0.50% 178 мкл х 0,025 = 4,45 мкл 4,5 мкл
SA2 полимеризуется решение 40% акриламида 10% 180 мкл х 0,25 = 45 мкл 45 мкл Рассчитать количество акриламида, КЭ, APS, и TEMED на основе общего объема 180 мкл (смотри выше и в таблице 3).
10x КЭ 1x 180 мкл х 0,10 = 18 мкл 18 мкл
100% раствор SA2 60% - 108 мкл SA2 раствор 60% полимеризованного раствора SA2 (смотри выше и в таблице 3).
2% APS 0,05% 180 мкл х 0,025 = 4,5 мкл 4,5 мкл Добавить и смешать APS перед добавлением TEMED
20% TEMED 0.50% 180 мкл х 0,025 = 4,5 мкл 4,5 мкл
Гелевые решения (§ 1.3)
100% раствор Гель 100% полимеризуется решение SA1 10 частей - 10 мкл Написать 100% гели со следующим SA1: SA2: отношение L2, 10: 10: 6.
100% SA2 полимеризуется зольution 10 частей - 10 мкл
100% решение L2 6 частей - 6 мкл
80% раствор Гель 100% полимеризуется решение SA1 10 частей - 10 мкл Написать 80% гели со следующим SA1: SA2: отношение L2, 10: 10: 6.
100% полимеризуется решение SA2 10 частей - 10 мкл
80% раствор L2 6 частей - 6 мкл
Динамические гели (§3-4)
80 → 100% гель 80% гель 100% GEл Расчет 1: 1 мкл 100% раствора L2 в культуральной среде Расчеты основаны на том, 20 мкл гели на покровных стеклах. Прежде всего, преобразования части 100% растворе L2 в 20 мкл геля в мкл. Во-вторых, вычислить количество (в мкл) 100% раствора L2, необходимой для дополнительного 20% сшивки. Добавить эту сумму 100% раствора L2 в гель.
(20 мкл / 26 части) х 6 частей = 4,6 мкл
Расчет 2:
5 мкл х 0,2 = 1 мкл
100 → 80% гель 100% гель 80% гель Расчет 1: 1 мкл 100% раствора R2, в культуральной среде Расчеты основаны на том, 20 мкл гели на покровных стеклах. Во-первых, конвертировать тон части 100% раствора L2 в 20 мкл геля в мкл. Во-вторых, вычислить количество (в мкл) 100% раствора L2, необходимой, чтобы быть удалены, чтобы составить 20% гель. Добавить количество раствора R2 в гель.
(20 мкл / 26 части) х 6 частей = 4,6 мкл
Расчет 2:
5 мкл х 0,2 = 1 мкл
100% гель (контроль) 100% гель 100% гель - 1 мкл контрольного раствора в культуру средств массовой информации Количество контрольного раствора эквивалентно количество раствора добавили R2.
80% гель (контроль) 80% гель 80% гель - 1 мкл контрольного раствора в культуру средств массовой информации Количество контрольного раствора эквивалентно размере 100% раствора L2, добавляется.

Таблица 4 Пример вычисления для получения ДНК из геля. Макет цифры приведены, чтобы проиллюстрировать вычисления для получения 80%, 100%, 100 → 80% и 80% → 100 гелей. Гели ДНК Дизайн 2 в таблице 1.

  1. Центрифуга лиофилизированный SA1 оцДНК при 2000 х г в течение 15 сек, чтобы гарантировать, что все оцДНК находится в нижней части флакона. ПРИМЕЧАНИЕ: правильная концентрация раствора SA1 имеет решающее значение для синтеза ДНК в геле.
  2. Подготовьте 3 мм SA1 раствор путем добавления 107 мкл 1х трис-ЭДТА, рН 8,0 буфер (ТЕ-буфера) в ампулу (таблицы 3-4).
  3. Тепло SA1 в ТЕ буфере при 70 ° С в течение 5 мин или до оцДНК гранулы полностью не растворится. ПРИМЕЧАНИЕ: Температура нагрева должна быть не менее 5 ° С выше температуры плавления (Т м) для обеспечения ДНК в одноцепочечной государства.
  4. Готовят раствор SA1 полимеризации путем добавления 40% акриламида и 10x трис-борат-ЭДТА (КЭ) буфера при указанных процентах (таблица 3). В этом примере, добавить 45 мкл и 18, соответственно, к 107 мкл раствора SA1 (Таблица 4).
  5. Дега газообразным азотом в течение 3 мин, чтобы облегчить смешивание. Вставьте наконечник P200, прикрепленный к источнику газообразного азота в раствор и медленно позволяют газообразный азот, чтобы пройти через раствор. Проверьте расход газа азота в воде до дегазации раствора SA1 для предотвращения разбрызгивания.
  6. Центрифуга на 15 сек при 2000 мкг в собирать решение.
  7. Добавить 4,5 мкл 2% персульфата аммония (APS, Столы 3-4) для инициирования полимеризации геля.
  8. Переверните пробирку несколько раз перемешать.
  9. Центрифуга на 15 сек при 2000 мкг в собирать решение для однородной полимеризации.
  10. Добавить 4,5 мкл 20% тетраметилэтилендиамина (TEMED, Таблицы 3-4), чтобы катализировать полимеризацию.
  11. Переверните пробиркунесколько раз перемешать.
  12. Центрифуга на 15 сек при 2000 мкг в собирать решение для однородной полимеризации.
  13. Дега газообразным азотом в течение 3-5 мин, чтобы завершить полимеризацию и свести к минимуму непрореагировавшего мономера.
  14. Инкубируйте раствор в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы завершить полимеризацию. ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение называется SA1 полимеризованный решение.
  15. Повторите шаги 1.1.3-1.1.16 с лиофилизированной SA2 одноцепочечной ДНК, но добавить 45, 18, ​​4,5, и 4,5 мкл акриламида, КЭ, APS, и TEMED, соответственно, в 108 мкл SA2 решения (таблицы 3-4). ПРИМЕЧАНИЕ: SA1 и SA2 Полимеризованные решения могут храниться при температуре 4 ° С в течение до одного месяца.

2 Получение L2, R2 и управления Solutions

  1. Повторите шаги 1.1.3-1.1.5 с лиофилизированной R2 одноцепочечной ДНК, но добавить 64,4 мкл ТЕ-буфера (таблица 4).
  2. Повторите шаги 1.1.3-1.1.5 с лиофилизированной контрольной одноцепочечной ДНК, но добавить 111 мкл буфера ТЕ (таблица 4 ).
  3. Повторите шаги 1.1.3-1.1.5 с лиофилизированной L2 одноцепочечной ДНК, но добавить 219 мкл буфера ТЕ (таблица 4). ПРИМЕЧАНИЕ: Это 100% раствор L2. Добавление 100% раствор L2 к SA1 и SA2 полимерных растворов (см § 1.3) образуют 100% гель сшитой ДНК (100% гель), потому SA1, SA2, и L2 будет стехиометрический эквивалент.
  4. Развести аликвоту 100% растворе L2 до 80% путем добавления 20 мкл ТЕ-буфера 1x до 80 мкл 100% растворе L2 (таблица 4). Примечание: Этот раствор 80% раствор L2. Добавление 80% раствора L2 к SA1 и SA2 полимеризованных решений (см § 1.3) образуют на 80% гель сшитой ДНК (80% гель), так как только 80% SA1 и SA2 будет сшит с L2. Решения могут храниться при температуре 4 ° С в течение до одного месяца.

3 Получение гелевых Solutions

  1. Тепло SA1 и SA2 Полимеризованные решения на 70 ° С до вязкости раствора уменьшается (около 1 мин). Повышение температуры до 80 °С решением, если до сих пор слишком вязким для пипетки.
  2. Добавить 10 мкл или 10 частей SA1 полимеризованного раствора до 10 мкл и 10 частей SA2 полимеризованного раствора (Таблица 4). ПРИМЕЧАНИЕ: SA1 и SA2 Полимеризованные решения чрезвычайно вязкой и трудно пипетки. Поскольку концентрации имеют решающее значение для образования геля, использовать положительный смещения пипетки с этой точки вперед или см обсуждение для других методов обработки. Кроме того, пипетки в нескольких, небольших аликвот (> 20 мкл), а не одного, большого объема.
  3. Mix SA1 и SA2 Полимеризованные решения вместе через переменный отопление (на 15 сек при 70 ° С) и перемешивают (в течение 15 сек с кончика пипетки) на общую сумму 1 мин.
  4. Добавить 6 мкл или 6 частей 100% раствора L2, чтобы сформировать 100% гель (таблица 4).
  5. Смешайте чередованием нагрева и перемешивания, как описано в шаге 1.3.3.
  6. Тепло гель в течение 1 часа при оптимальной температуре отжига (35 ° C). Рассчитатьnnealing путем вычитания температуры на 5 ° C от последовательности оцДНК с низкой температурой плавления (Таблица 1).
  7. Внесите 100% геля в 60-мм чашки Петри.
  8. Разрешить сшивки ДНК продолжать rehybridize путем инкубации гель в течение 4 ч при комнатной температуре.
  9. Обложка гель с PBS, содержащий кальций и магний и инкубировать O / N при комнатной температуре. ПРИМЕЧАНИЕ: Гели увеличится примерно в 3 раза превышающей начальную громкость. Кроме того, гели будут равновесие с буфером и избыток акриламида будет диффундировать из гелей. Кальций и магний в PBS стабилизации гибридизации ДНК и предотвратить гель разрыва (см Обсуждение для toubleshooting гель лопнул).
  10. Удалить остатки буфер из чашки Петри.
  11. Для изготовления 80% гели, повторите шаги 1.3.1-1.3.10 но заменить 100% раствор L2 в шаге 1.3.4 с 80% раствором L2. Храните 100% и 80% гели при 4 ° С в течение одного месяца. ПРИМЕЧАНИЕ: жесткости различия между 80% и 100% гелей физически различимы.

    12. 2 Гель иммобилизация на стекле

    ПРИМЕЧАНИЕ: Остановите аликвот 100% или 80% гелей на стекло покровные стекла (Рисунок 2).

    1. Нагреть 100% геля при 70 ° С в течение примерно 30 секунд или до гель менее вязкой для пипетки.
    2. Место стеклянная крышка скользит на 70 ° C тепла блока и позволяют нагревать в течение 1-2 мин.
    3. Добавить каплю оптического клея к каждому покровным стеклом.
    4. Добавить 20 мкл 100% гель для каждого покровным стеклом (таблица 4). Примечание: 10-30 мкл можно обойтись на каждом покровным стеклом.
    5. Разрешить гель таять и распространяются на покровным стеклом. ПРИМЕЧАНИЕ: Если гель топология не появляется даже после плавления, распрямите гель с силиконом покровным стеклом. Тем не менее, дополнительное набухание будет происходить на последующих стадиях, и внести свой вклад в геле неровностей.
    6. Удалить стекла, содержащего гель от тепла блока и поместить в 24-луночный блюдо культуры ткани.
    7. Повторите шаги 2.1-2.6 с 8 0% гель.
    8. Тепловые гели течение 1 часа при оптимальной температуре отжига (35 ° C). ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально для гели становиться сухой и эта проблема будет решена, когда гели инкубируют в PBS.
    9. Защиту чашках, содержащих 80% и 100% гели к ультрафиолетовому (УФ, 365 нм) света в течение 15 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: ультрафиолетовое облучение одновременно лечит клей и стерилизует гели. Если УФ-сшивки камера не доступна, гели могут быть помещены под УФ-светом, на котором установлен в шкафу биологической безопасности. После УФ-облучения, выполнения последующих шагов этого протокола в кабинете биологической безопасности для поддержания гель стерильность. Кроме того, используйте стерильные растворы с этого момента.
    10. Разрешить сшивки ДНК, чтобы rehybridize при комнатной температуре в течение 4 часов.
    11. Добавить PBS и инкубируют O / N при 4 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: PBS Инкубационный ополаскиватели, уравновешивает, и набухает гели снова, потому что повторяется отопление может обезвоживают гели.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    Рисунок 2 Схема гель иммобилизации и функциональных групп. После гели ДНК (серые) получают, гели прикреплены к стекла покровные стекла (белых) по оптической клея (зеленый). Гели одновременно отверждают и стерилизуют ультрафиолетовым светом. После набухания, гели толщиной примерно 1 мм. Далее, гели, функционализированный в двухступенчатого процесса (красный прямоугольнике). Во-первых, сульфо-SANPAH конъюгируют с акриламида на геле поверхностей с помощью УФ-освещенности. Во-вторых, гели инкубируют с коллагеном или поли-D-лизина, который привязывается к сульфо-N-гидроксисукцинимид эфира в сульфо-SANPAH. Эта цифра была изменена с 10.

    3 Гель Функционализация

    ПРИМЕЧАНИЕ: гель функционализацию ДНК требуется для клеточной адгезии с полиакриламидные гели являются инертными материалами (Рисунок 2). В этом разделе, гели будут функционализированный в двух этапов. Во-первых, Н -Sulfosuccinimidyl-6-(4 &# 39; азидо-2'-нитрофениламино) гексаноат или сульфо-SANPAH будут ковалентно связаны посредством фотолиза азида нитрофенил группы в полиакриламидном позвоночника гелей ДНК. Во-вторых, первичные амины в коллагена или поли-D-лизина будет приложить к сульфо- N -hydroxysuccinimide эфира в сульфо-SANPAH приложить белки на поверхности геля.

    1. Удалить буфер в скважинах с помощью пипетки и быть осторожными, чтобы не аспирата гель. ПРИМЕЧАНИЕ: Не выполняйте вакуум-аспирации, чтобы уменьшить вероятность аспирации гель.
    2. Необязательно) Вымойте гели трижды в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы удалить избыток мономера акриламида, TEMED и APS.
    3. Добавить около 300 мкл сульфо-SANPAH для покрытия каждый гель.
    4. Expose гели для УФ (365 нм) в течение 5 мин.
    5. Удалить сульфо-SANPAH.
    6. Промыть гели раз с PBS, чтобы удалить лишнюю сульфо-SANPAH.
    7. Повторите шаги 3.3-3.6.
    8. Инкубируйте гели примерно 300 мкл 0,2 мг / мл поли-D-лизина в течение 1 часа при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Примечание: В качестве альтернативы, инкубировать гели с 0,2 мг / мл коллагена типа 1 O / N при 4 ° С.
    9. Промыть гели дважды PBS в течение 5 мин, чтобы удалить избыток поли-D-лизина.
    10. Инкубируйте гели в около 300 мкл среды в течение 30 мин, чтобы уравновесить гели.
    11. Удалить СМИ непосредственно перед покрытием клетки.

    4 культивирования клеток и изображений

    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе мы предоставить информацию по вопросу смягчения или ужесточения гелей после клеточной обшивки. Подробный протокол для культивирования клеток не предусмотрено по нескольким причинам. Во-первых, многочисленные типы клеток могут придерживаться на гелях ДНК и каждый тип клеток потребует особых корректировок исследователя для сотового покрытия. Во-вторых, стандартные методы клеток и тканей культивирования используются для этих экспериментов и могут быть найдены в многочисленных оригинальных статей, технических статей и справочников. Методы специально покрытие фибробласты и нейроны на гелей ДНК можно найти в PREVIOUS публикации 9-11,19-21.

    1. Пластина клеток. Для протоколов, касающихся вскрытия и / или культивирование нейронов или фибробластов, упомянутых в этой статье, относятся к одной из следующих публикаций 9-11,19-21.
    2. После как минимум 48 ч, модулируют гель жесткость с помощью пипетки 1 мкл контрольного раствора, L2, R2 или близкой к гелю (Таблица 4).
      1. Для придания жесткости гели с 80% до 100% сшитого (80 → 100% гели), добавляют оставшиеся 20% от L2 до 80% гелей добавлением 1 мкл 100% раствора L2, близкой к гелю.
      2. Чтобы смягчить гели от 100% до 80% сшитого (100 → 80% гели), добавьте R2, чтобы удалить 20% сшивок из 100% гелей добавлением 1 мкл 100% растворе R2, близкой к гелю.
      3. Для управления, добавьте равные объемы раствора управления для подмножества 100% и 80% гелей добавлением 1 мкл контрольного раствора, близкой к гелю.
    3. Выполните нужную обработки и передачи данных сотового анализ послеминимум 48 часов.

Результаты

До наших исследований, клетка-ECM взаимодействия наблюдались на статических совместимых биоматериалов или на необратимых и однонаправленных динамических подложках. Эти субстраты не точно отражают динамичный характер клеточном микросреды. Наша работа сдвигает существующих техническ...

Обсуждение

Способность гелей ДНК, чтобы смягчить или ужесточить до и после клеточной адгезии делает их идеальным модель для изучения роли динамической жесткости ткани на функции клеток. Все три конструкции были использованы в механических и биологических исследований. Тем не менее, все три имею?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить: д-р Франк Цзян, доктор Дэвид Лин, доктор Бернард Yurke и доктора Uday Chippada за их вклад по разработке технологии геля ДНК; Доктор Норелл Hadzimichalis, Смит Шах, Кимберли Peterman, Роберт Arter за их комментарии и правок этой рукописи; источники финансирования, включая Нью-Джерси комиссии по спинного мозга исследований (грант # 07A-019-SCR1, NAL) и Нью-Джерси Neuroscience Institute (MLP); и издатели тканевой инженерии, часть за разрешение перепечатать рисунки 2 и 4 и биоматериалов для получения разрешения на перепечатку Рисунок 3.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ssDNAIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesiumAny brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)93290TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solutionFisher Scientific (Pittsburg, PA)BP14021Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)A3678Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)T9281Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglassFisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		12-545-82
Norland optical adhesive 72Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		NOA72
24-well tissue culture plateAny brand.
Microcentrifuge tubesAny brand.
Sulfo-SANPAHProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		C111 or 22589Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)P6407Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type IAffymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		13813Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glassFisher Scientific (Pittsburg, PA)12-544-G
Positive-displacement pipetteGilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		F148504
Heat blockFisher Scientific (Pittsburg, PA)11-718
UV light sourcePlace gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
ThermometerAny brand.
Nitrogen gasGTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		NI 5.0UH-R

Ссылки

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

90ECMmechanobiology

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены