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요약

본 연구실은 더 세포 기능에 티슈 강성 변조의 효과를 이해하는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔, 하이드로 겔 동적 시스템을 개발했다. 여기서, 우리는 이러한 하이드로 겔을 제조하기위한 회로도, 설명, 및 프로토콜을 제공한다.

초록

제어 공학은 세포 형태와 기능을 연출 물리적 신호의 중요한 역할을 해결하는 새로운 과학 분야이다. 조직 경화 질병, 개발 및 부상으로 변조하기 때문에 예를 들어, 세포 기능에 조직 탄성 효과는 제어 공학 연구의 중요한 영역이다. 세포가 일단 도금 강성을 변경할 수없는 고정 조직 모방 재료, 또는 재료는 주로 세포의 기능에 대한 조직의 강성의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 정적 스터디에서 수집 된 정보는 가치가 있지만, 이러한 연구는 생체 내에서 세포 미세 환경의 동적 특성을 나타내는 것은 아닙니다. 더 세포 기능에 동적 강성의 영향을 해결하기 위해, 우리는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔 시스템 (DNA 젤)을 개발 하였다. 다른 동적 기판과 달리, DNA 겔이 감소 또는 자극없이 제조 후 강성도를 증가시키는 능력을 가지고있다. DNA 젤은 DNA의 crossl 구성폴리 아크릴 아미드 백본으로 중합 잉크. 추가 및 단일 가닥 DNA의 전달을 통해 가교를 제거하는 것은 시간, 공간, 겔 탄성 가역 제어 할 수 있습니다. 우리는 DNA 젤 탄성 동적 변조 섬유 아세포와 신경 세포의 행동에 영향을 미치는 것을 이전 보고서에 표시했다. 이 보고서와 비디오에서 우리는 준비 DNA 젤에서 DNA 겔 가교 메커니즘과 단계별 지침을 설명하는 회로도를 제공한다.

서문

정적 및 동적 기질은 세포의 기능에 조직 탄성 또는 강성의 영향을 연구하기 위해 개발 된 생체 물질의 두 가지 범주이다. 정적 기판은 세포가 도금 및 / 또는 일단 제작 된 후 물리적 속성을 변경할 수 없습니다. 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔은 제어 공학 조사 5,17 위해 합성했다 제 이차원 정적 기판이었다. PA 젤은 다용도, 저렴, 쉽게 준비하고, 탄성 계수의 넓은 범위로 제조 될 수있다. 이 기술의 장점은 PA가 일반적으로 적용 기판 젤하게하지만, 정적 기판은 생체 내에서 세포 외 기질 (ECM) 및 주변 세포 환경의 동적 특성을 나타내는 것은 아닙니다. 예를 들면, ECM은 상해, 현상, 또는 질병의 결과로서 강성 변화를 겪는다. 동적 기판 따라서 제어 공학 연구에서 조직을 흉내 낸 기판 모델로 선호 22,24,25.

수많은 합성은 자연적인, 이차원, 삼차원, 정적 및 동적 생체 재료는 티슈 1,3,6,16,23,26 강성을 모방하기 위해 개발되어왔다. 몇몇 기판들은 동적 기계적 특성을 변경 2,4,7,8,12,15,16 열, UV, 전류, 이온, 및 pH 변화를 필요로하지만, 이들 자극은 하이드로 겔의 생체 응용을 제한 할 수있다. DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔 (DNA 젤)은 동적 이차원 탄성 기판이다. DNA의 가교는 미디어에 단일 가닥 DNA (ssDNA를)의 첨가에 의한 DNA 젤 강성, 시간, 공간, 가역적 변조 허용하거나 9-11,13,14,18,21 버퍼. 자극이 탄성 변조 적용되는 상기 동적 젤과는 달리, DNA 젤은 탄성의 변화에​​ 대한 적용 ssDNA의의 확산에 의존하고 있습니다. 따라서 세포가 성장 상부 겔 표면은, 속도 오 때문에 변조 된 첫 번째 영역은F 탄성 변조 겔 두께에 의존한다.

DNA 젤 그러나 비스 아크릴 아미드 가교는 DNA (그림 1)으로 구성 가교로 대체됩니다, 그들은 폴리 아크릴 아미드 백본을 가지고 그 자신의 PA 젤 대응과 유사하다. 두 ssDNAs (SA1 및 SA2)가 겔의 가교 결합 된 DNA를 만드는 가교제 스트랜드 (L2)와 함께 혼성화. SA1과 SA2는 모두 PA 네트워크에 효과적으로 통합하기위한 5 '끝에 Acrydite 수정을 포함하는 별개의 시퀀스를 가지고있다. 젤, SA1과 SA2의 준비를위한 개별적으로 PA 백본으로 중합하고, 그 후, 중합 SA1과 SA2 함께 혼합된다. L2, 가교제는, SA1 및 SA2 혼합물에 첨가된다. L2의 염기 서열을 모두 SA1과 SA2에 상보적인 서열이며, L2는 DNA의 가교 결합을 형성하기 위해 플러스 SA1 SA2와 혼성화. 초기, DNA 젤 탄력성 L2 농도 및 가교 (표 1 모두에 의해 결정된다 및 2). SA1과 SA2가 (100 % 젤로 지정) L2에 의해 백퍼센트 가교 때문에 L2, SA1, SA2와 동등한 화학 양 론적 양을 포함하는 DNA 젤은 뻣뻣한 젤입니다. 따라서 낮은 DNA 가교의 비율과, L2에서 결과의 낮은 농도, 부드러운 DNA 젤. (50 % 젤로 지정) 50 % 가교 낮은 젤은 9-11를 구성하고있다.

figure-introduction-1799
도 1 DNA 겔 가교 uncrosslinking 개략적 9-11,13,14,18,21 1 단계 :. SA1 (적색)과 SA2 (청색)은 개별적으로 폴리 아크릴 아미드 백본 (흑)로 중합된다. 중합 후, SA1과 SA2 중합 솔루션은 함께 혼합. 단계 2 : L2 (녹색)을 첨가하고, 겔의 가교 결합을 형성하기 위해 플러스 SA1 SA2와 혼성화된다. 3 단계 : R2는 t으로 하이브 리다그는 L2의 발붙일. 4 단계 : R2의 발붙일 하이브리드는 SA1과 SA2에서 L2의 압축 풀기를 추진한다.

PA 젤과는 달리, DNA 젤은 완고하고 합성 한 후 부드럽게. 이러한 이유로, DNA 겔상에서 성장한 세포를 동적 강성도 변화를 실시 할 수있다. 세포 접착 성 겔 완고, L2는 가교 결합의 비율을 증가시키기 위해 낮은 퍼센트 겔 배양 배지에 첨가 될 수있다. 세포 접착 성 젤을 부드럽게하기 위해, L2는 가교 10,13,21의 비율을 감소 제거 할 수 있습니다. L2는 L2가 SA1과 SA2 (표 1)에서 uncrosslink 할 수 있도록 3 '끝에 추가 발붙일 순서가 있습니다. L2를 제거하여 R2라고 반전 가닥의 혼성화에 의해 달성된다. R2는 L2의 전체 길이에 상보과 L2의 발붙일와 제 혼성화. 발붙일 하이브리드는 가교을 제거하고 겔 강성을 감소 SA1과 SA2에서 L2의 압축 풀기를 추진한다.

이 보고서에서와지시 보강 및 DNA 젤 연화의 제조에 제공되는 단계별 비디오. 100 % 및 80 % 겔 제제가 기재되어 있지만,이 프로토콜은 다른 초기 및 최종 가교 백분율 DNA 겔을 만들 맞추어 질 수있다. 일반적으로, 100 % 및 80 % 겔은, 제조되는 유리 커버 슬립 상에 고정화 된, 작용 및 세포 시드. L2는 80 %의 겔 매체에 첨가하고 R2가 100 % 겔, 도금 후 48 시간의 매체에 첨가된다. 미디어 R2의 첨가는 가교 결합 된 80 % 100 % 겔을 부드럽게하는 반면 매체 L2의 첨가는 가교 결합 된 100 % ~ 80 % 겔을 경화된다. 보강 된 겔은 80 → 100 % 젤로 지정되어 연화 겔은 텍스트의 80 → 100 % 젤 지정되어 있습니다. 제어 또는 정적 젤, ssDNA를 들어 TS 구성된 또는 100 %와 80 %의 젤의 또 다른 세트에 전달된다. 탄성 변조 다음 두 최소 일 후, 세포를 처리 및 분석 할 수있다.

DNA의 가교 기지 # 시퀀스 (발붙일) 수정 녹는 온도 (T m의 ° C) 댓글
5 '→ 3'
디자인 한 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'Acrydite 34.9
SA2 10 GTC AGA ATG 5 'Acrydite 23.6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 10 염기쌍으로 발 시퀀스가​​ 포함되어 있습니다.
R2 30 CAA GTG의 TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2는 L2에 상보
디자인이 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'Acrydite 46.​​9
SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 12 bp의 순서 발붙일 곳이 포함되어 있습니다.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG 65.9 R2는 L2에 상보
사이트 디자인N 세 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'Acrydite 55
SA2 20 CAT GCT의 TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56.6
L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 발붙일는 포함되어 있지 않습니다.
제어 제어 20 ~ 40 AAA AAA (등) 또는
TTT TTT (등)

셀룰러 및 기계 연구 라 여러 가지 사용했다. ssDNA를 9-11,13,14,18,21 표 1 염기 서열ifferent 가교 디자인은 정적 및 동적 기계적 특성의 범위 DNA 젤을 생성합니다. 가교 디자인 변조 파라미터는 기본 시퀀스와 시퀀스 길이 또는 가교 길이이다. 굵게 및 기울임 꼴 글꼴은 SA1과 L2 사이에 각각 SA2와 L2 사이의 염기쌍을 보여줍니다.

디자인
1 이 3
아크릴 아미드 농도 (%) 10 10 10 4
SA1 플러스 L2에 하이브리드 SA2 (% 가교) 50 80 100 50 80 100 100 100
<강한> 탄성 (kPa의, ± SEM을 의미) 6.6 ± 0.6 17.1 ± 0.8 29.8 ± 2.5 5.85 ± 0.62 12.67 ± 1.33 22.88 ± 2.77 25.2 ± 0.5 10.4 ± 0.6

표 2 DNA 젤 9-11,13,14,18,21. 아크릴 아마이드 농도 비율 가교 결합 및 가교 길이의 영률 (E)의 DNA 젤에서 변조 될 수있다. 디자인 1, 2, 3은 각각 20, 28, 및 40 bp의 길이가 가교. 모든 설계를위한 100 % 젤은 젤 탄력에 영향을주지 않습니다 가교 길이를 나타내는 유사한 계수가있다. 하지만, 아크릴 아마이드 농도 변화는 DNA 겔 탄성을 변경.

프로토콜

참고 : 셀 처리 젤 준비에서 전체 프로토콜은 육일의 최소 소요됩니다. 젤 준비를위한 예상 시간은 8 시간 플러스 O / N 배양이다. 젤 고정 및 DNA 어닐링에 대한 예상 시간은 8 시간 플러스 O / N은 ​​헹굼 단계입니다. 젤 작용에 대한 예상 시간은 2 시간이다. 셀 도금 및 성장을위한 시간은 문화 유형 및 응용 프로그램에 의존하지만, 사일의 최소 필요합니다.

DNA 젤의 1 준비

참고 : 세 가지 단계로 DNA 젤을 준비합니다. 첫째, 개별적으로 PA 백본에 SA1과 SA2 ssDNA를 중합. 이러한 솔루션은 SA1 중합 용액 중합 SA2 솔루션, 각각라고 (§1.1). 둘째, 가교제, 가역적 가닥 및 제어 ssDNAs을 녹인다. 동결 건조 된 L2 ssDNA를 (가교제)을 녹인다. 이것은 L2 용액 100 %라고하고 100 % 겔 (§1.2)를 제조하는데 사용된다. 백퍼센트 L2 용액의 분취 량을 희석80 %. 이것은 L2 용액 80 %라고하고 80 % 겔을 제조하는데 사용된다. §4에 사용하는 동결 건조 R2 (양면 가닥) 및 제어 ssDNA를 녹인다. 각각 100 % 및 80 % 겔을 형성하기 위해 10 : 6 (L2 SA1 : SA2) 제 10의 비율로 중합 용액보기 SA1, SA2 중합 용액을, 100 % 또는 80 % L2 용액을 혼합한다. (§1.3).

SA1과 SA2 중합 된 솔루션의 1 준비

  1. 선택하고 표 1 및 표 2에서 적절한 SA1, SA2, L2, R2 및 염기 서열을 주문한다. 염기 서열과 서열의 길이는 이전의 보고서 9-11,13,14 최적화 하였다.
  2. 모든 솔루션 제제 (표 3-4)를 계산합니다. 참고 : 문제 해결을 위해 꼼꼼하게 문서 계산. 엑셀 템플릿의 건설을 권장하고 DNA 젤 준비를 위해 반복적으로 사용할 수 있습니다. (디자인이에 대한 집계의 예는 표 3과 4를 참조하십시오표 1 및 표 2). 표 4에 지정된 볼륨이 프로토콜에서 사용되지만 볼륨은 동결 건조 된 ssDNA의 모든 분취 량에 따라 달라집니다.
솔루션 솔루션의 재고 농도 SA1 또는 SA2 중합 된 솔루션의 원액의 비율 (V / V) SA1 또는 SA2 중합 된 솔루션의 솔루션의 최종 농도
아크릴 아미드 (노 비스 아크릴 아미드 없음) 40 % 25 10 %
SA1 또는 SA2 솔루션 백퍼센트 60 60 %
TBE 버퍼 10 배 10 1 배
TEMED 20 % 2.5 0.50 %
APS 2 % 2.5 0.05 %

표 3. SA1 또는 SA2 중합 된 솔루션을 제조하기위한 솔루션의 백분율. 첫 번째 열은 DNA 젤을 공식화에 대한 솔루션을 보여줍니다. 두 번째 열은 이러한 솔루션의 주식 농도를 보여줍니다. 세 번째 열은 SA1 또는 SA2 중합 솔루션의 주식 솔루션의 비율을 보여줍니다 (v / v)로. 마지막 열은 SA1과 SA2 솔루션의 최종 농도를 반영한​​다.

ssDNA의 솔루션 (§1.1)
솔루션 구성 요소
솔루션 주식 농도 최종 용액 농도 계산 금액 추가하는 방법 댓글
SA1 솔루션 동결 건조 SA1 ssDNA를의 320.7 nmol의 3.00 밀리미터 320.7 nmol의 / 3.00 nmol의 μL -1 = 107 μL ssDNA를 동결 건조하여 TE 완충액 107 μL SA1 SA1 용액 중합 용액은 60 %이다.
107 μL은 / 0.600 = 178 μL
178 μL SA1은 용액 중합 (표 3)의 총 부피이다.
SA2 솔루션 동결 건조 SA2 ssDNA를의 324.4 nmol의 3.00 밀리미터 324.4 nmol의 / 3.00 nmol의 μL -1 = 108 μL ssDNA를 동결 건조하여 TE 완충액 108 μL SA2 SA2 용액 중합 용액은 60 %이다.
108 μL은 / 0.600 = 180 μL
180 μL SA2는 중합 용액 (표 3)의 총 부피이다.
백퍼센트 L2 솔루션 동결 건조 된 L2 ssDNA를의 657.4 nmol의 3.00 밀리미터 657.4 nmol의 / 3.00 nmol의 μL -1 = 219 μL ssDNA를 동결 건조하여 TE 완충액 219 μL 80 % L2 솔루션으로 100 % L2의 분취 량을 희석
80 % L2 솔루션 백퍼센트 L2 ssDNA를 80 μL 80 % - 100 % L2 용액 80 μL로 TE 완충액 20 μL
제어 솔루션 동결 건조의 332.6 nmol의 폴리 T 또는 ssDNA를 3.00 밀리미터 332.6 nmol의 / 3.00 nmol의 μL -1 = 111 μL ssDNA를 동결 건조하여 TE 완충액 111 μL
R2 솔루션 동결 건조 R2 ssDNA를의 193.8 nmol의 3.00 밀리미터 193.8 nmol의 / 3.00 nmol의 μL -1 = 64.6 μL ssDNA를 동결 건조하여 TE 완충액 64.6 μL
중합 된 솔루션 (§1.2)
SA1 중합 솔루션 40 % 아크릴 10 % 178 μL는 X 0.25 = 44.5 μL 45 μL (상기 표 3 참조) 178 ㎕의 총 부피에 기초하여 아크릴 아미드, TBE, APS와 TEMED의 양을 계산한다.
10 배 TBE 1 배 178 μL는 X 0.10 = 17.8 μL 18 μL
100 % 용액 SA1 60 % - 107 μL SA1 용액 SA1 중합 용액의 60 %이다 (상기 표 3 참조).
2 % APS 0.05 % 178 μL은 X 0.025 = 4.45 μL 4.5 ㎕의 추가 TEMED를 추가하기 전에 APS를 섞는다.
20 % TEMED 0.50 % 178 μL은 X 0.025 = 4.45 μL 4.5 ㎕의
SA2 중합 솔루션 40 % 아크릴 10 % 180 ㎕의 X 0.25 = 45 μL 45 μL (상기 표 3 참조) 180 ㎕의 총 부피에 기초하여 아크릴 아미드, TBE, APS와 TEMED의 양을 계산한다.
10 배 TBE 1 배 180 ㎕의 X 0.10 = 18 μL 18 μL
100 % 용액 SA2 60 % - 108 μL SA2 용액 SA2 중합 용액의 60 %이다 (상기 표 3 참조).
2 % APS 0.05 % 180 μL은 X 0.025 = 4.5 ㎕의 4.5 ㎕의 추가를 추가하기 전에 APS를 혼합 TEMED
20 % TEMED 0.50 % 180 μL은 X 0.025 = 4.5 ㎕의 4.5 ㎕의
젤 솔루션 (§1.3)
백퍼센트 젤 솔루션 백퍼센트 SA1 중합 솔루션 10 부 - 10 μL 다음 SA1과 백퍼센트 젤 작성 : SA2 : L2 비율 10 : 10 : 6.
백퍼센트 SA2 중합 졸의 ution 10 부 - 10 μL
백퍼센트 L2 솔루션 6 부품 - 6 μL
80 % 젤 솔루션 백퍼센트 SA1 중합 솔루션 10 부 - 10 μL 다음 SA1으로 80 % 젤을 작성 : SA2 : L2 비율 10 : 10 : 6.
백퍼센트 SA2 중합 솔루션 10 부 - 10 μL
80 % L2 솔루션 6 부품 - 6 μL
동적 젤 (§3-4)
80 → 100 % 젤 80 % 젤 백퍼센트 GE의리터 계산 1 : 배양액에 100 % L2 용액 1 μL 계산은 커버 슬립에 20 μL 젤을 갖는 기준으로합니다. 먼저 μL로 겔 20 μL에 100 % L2 용액의 일부를 변환한다. 둘째로, 가교 결합의 20 % 추가에 필요한 100 % L2 용액 (μL)에 금액을 계산한다. 젤 백퍼센트 L2 솔루션이 금액을 추가합니다.
(20 μL은 / 26 부) 6 부품 = 4.6 μl를 X
계산이 :
5 μL X 0.2 = 1 μL
100 → 80 % 젤 100 % 젤 80 % 젤 계산 1 : 배양액에 100 % R2 용액 1 μL 계산은 커버 슬립에 20 μL 젤을 갖는 기준으로합니다. 첫째, t 변환μL로 겔 20 μL의 100 % 용액 L2 그 부품. 둘째로, 20 %의 겔을 구성하기 위해 제거 될 필요가 100 % L2 용액 (μL)에 금액을 계산한다. 젤 R2 솔루션이 금액을 추가합니다.
(20 μL은 / 26 부) 6 부품 = 4.6 μl를 X
계산이 :
5 μL X 0.2 = 1 μL
백퍼센트 젤 (제어) 100 % 젤 100 % 젤 - 문화 미디어로 제어 솔루션의 1 μL 제어 솔루션의 금액 R2 솔루션의 양을 추가하는 것과 동일합니다.
80 % 겔 (컨트롤) 80 % 젤 80 % 젤 - 문화 미디어로 제어 솔루션의 1 μL 대조 용액의 양은 L2 용액을 첨가 100 %의 양과 동일하다.

표 DNA 겔 제조를위한 실시 예 4의 계산. 모의 숫자는 80 %, 100 %의 제조, 100 → 80 %, 80 → 100 % 겔에 대한 계산을 설명하기 위해 제공된다. DNA 젤은 표 1의 디자인이 있습니다.

  1. 15 초 동안 2,000 XG에 원심 분리기, 동결 건조 SA1 ssDNA의 모든 ssDNA를가 유리 병의 하단에 보장합니다. NOTE : SA1 용액의​​ 적정 농도는 DNA 겔 합성에 중요하다.
  2. 유리 병에 (표 3-4) 1 배 트리스-EDTA의 107 μL, 산도 8.0 버퍼 (TE 버퍼)를 추가하여 3 밀리미터 SA1의 솔루션을 준비합니다.
  3. ssDNA를 펠릿 5 분 동안 70 ° C에서 나까지 TE 버퍼에 열 SA1 완전히 용해된다. 참고 : 난방 온도는 DNA가 단일 가닥 상태에 보장하기 위해 용융 온도 (T의 m) 위의 5 ° C 이상이어야한다.
  4. 40 % 아크릴 아미드를 첨가 한 SA1 중합 용액을 준비0X 트리스 - 보레이트-EDTA에 표시된 백분율 (TBE) 완충액 (표 3). 이 예에서, SA1 용액 107 μL (표 4)에 각각 45 및 18 μl를 추가합니다.
  5. 3 분 동안 질소 가스의 혼합 가스를 제거는 용이하게한다. 용액에 질소 가스 공급원에 연결된 P200 팁을 넣고 천천히 질소 가스를 용액을 통해 통과 할 수있다. 튀김을 방지 탈기 SA1 용액 전에 물에 질소 가스의 유량을 테스트한다.
  6. 솔루션을 수집하기 위해 2000 XG에 15 초 동안 원심 분리기.
  7. 겔 중합을 개시하기 위해 2 %의과 황산 암모늄 (APS, 표 3-4)의 4.5 μl를 추가합니다.
  8. 혼합 튜브를 여러 번 반전.
  9. 균일 한 중합 용 솔루션을 수집하기 위해 2000 XG에 15 초 동안 원심 분리기.
  10. 중합을 촉진하기 위해 20 %의 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED, 표 3-4)의 4.5 μl를 추가합니다.
  11. 튜브를 반전여러 번 섞는다.
  12. 균일 한 중합 용 솔루션을 수집하기 위해 2000 XG에 15 초 동안 원심 분리기.
  13. 3-5 분 동안 질소 가스 드가 중합을 완료하고 미 반응 모노머를 최소화한다.
  14. 중합을 완료하기 위해 RT에서 10 분 솔루션을 품어. 참고 :이 솔루션은 SA1에게 중합 된 솔루션이라고합니다.
  15. 반복 동결 건조 SA2 ssDNA를 함께 1.1.3-1.1.16 단계하지만, 아크릴의 45, 18, ​​4.5, 4.5 μl를 추가, TBE, APS와 TEMED, SA2 솔루션 (표 3-4)의 각각 108 μL. 참고 : SA1과 SA2 중합 된 솔루션은 최대 1 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

L2, R2, 및 제어 솔루션의 2 준비

  1. 동결 건조 R2 ssDNA를 가진 단계를 1.1.3-1.1.5 반복하지만, TE 버퍼 (표 4)의 64.4 μl를 추가합니다.
  2. TE 버퍼 111 μL (표 4를 동결 건조 제어 ssDNA를 함께 1.1.3-1.1.5 단계를 반복하지만 추가 ).
  3. 동결 건조 된 L2 ssDNA를 함께 1.1.3-1.1.5 단계를 반복하지만, TE 버퍼 (표 4)의 219 μl를 추가합니다. 참고 :이 백퍼센트 L2 솔루션입니다. SA1과 SA2 중합 솔루션 (참조 §1.3) 백퍼센트 가교 DNA 젤 (100 % 젤)을 형성 할 것이다 100 % L2 솔루션을 추가 SA1, SA2, 그리고 L2는 화학 양 론적으로 동등 때문이다.
  4. 100 % L2 용액 80 μL (표 4)에 1X TE 완충액 20 μl를 첨가하여 80 %로 100 % L2 용액의 분취 액을 희석한다. 참고 :이 솔루션은 80 % L2 솔루션입니다. SA1과 SA2의 단지 80 %가 L2에 가교되기 때문에 SA1과 SA2 중합 솔루션 (참조 §1.3) 80 %의 가교 DNA 젤 (80 % 젤)을 형성한다 80 % L2 솔루션을 추가. 솔루션은 최대 1 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

젤 솔루션의 3 준비

  1. 열 SA1 및 용액 점도 때까지 70 ° C에서 SA2 중합 솔루션 (약 1 분) 감소한다. 80 °에 온도를 올려솔루션은 여전히​​ 피펫에 너무 점성이 경우 C.
  2. 10 μL, 10 μL에 SA1 중합 용액 10 부품 또는 SA2 중합 용액 (표 4)의 열 부분을 추가합니다. 참고 : SA1과 SA2 중합 솔루션은 피펫에 매우 점성 어렵다. 농도는 겔 형성에 매우 중요하기 때문에,이 시점에서 긍정적 인 변위 피펫을 사용하거나 다른 처리 기술에 대한 설명을 참조하십시오. 또한, 여러 개의 작은 분량 씩 (> 20 μL)보다는 하나의 큰 볼륨 피펫.
  3. 함께 (70 ° C에서 15 초) 가열 교류와 한 분의 총 (피펫 팁으로 15 초 동안) 교반을 통해 믹스 SA1과 SA2 중합 된 솔루션을 제공합니다.
  4. 100 % 젤 (표 4)을 형성 6 μL 또는 백퍼센트 L2 솔루션의 여섯 부분을 추가합니다.
  5. 난방을 번갈아 단계 1.3.3에 설명 된대로 교반하여 섞는다.
  6. 최적의 열처리 온도에서 1 시간 (35 ° C)에 대한 열 젤. 계산가장 낮은 용융 온도 (표 1)와 ssDNA의 순서에서 5 ° C를 뺀 온도를 nnealing.
  7. 60-mm 배양 접시에 100 % 겔 피펫.
  8. DNA의 가교는 실온에서 4 시간 동안 젤을 배양하여 rehybridize 계속 할 수 있습니다.
  9. PBS는 칼슘과 마그네슘을 포함하고 RT에서 O / N을 품어와 커버 젤. 참고 : 젤 약 3 배에 해당하는 초기 볼륨을 팽창합니다. 또한, 겔은 겔 바깥으로 확산 될 것이다 버퍼 과잉 아크릴로 평형화한다. PBS에서 칼슘과 마그네슘은 DNA 혼성화를 안정 (toubleshooting 겔 파열에 대한 토론 참조) 파열 젤을 방지 할 수 있습니다.
  10. 페트리 접시에서 남아있는 버퍼를 제거합니다.
  11. 80 % 젤을 제조하기 위해, 반복 1.3.1-1.3.10 단계를하지만, 80 % L2 솔루션 단계 1.3.4에서 백퍼센트 L2 솔루션을 교체합니다. 최대 한 달 동안 4 ° C에서 100 %와 80 % 젤을 저장합니다. 참고 : 80 % 및 100 % 젤 사이의 강성 차이는 물리적으로 구별 할 수 있습니다.

    12. 유리에 2 젤 고정화

    참고 : 유리 커버 전표에 100 % 또는 80 % 젤의 분취 량을 무력화 (그림 2).

    1. 약 30 초 동안 또는 젤 피펫 덜 점성 때까지 70 ° C에서 100 % 젤을 가열.
    2. 장소 유리 커버는 70 ° C에서 열 블록에 미끄러 져 1 ~ 2 분간 가열 할 수 있습니다.
    3. 각각의 유리 커버 슬립 광학 접착제 한 방울을 추가합니다.
    4. 각각의 유리 커버 슬립 (표 4) 100 % 젤의 20 μl를 추가합니다. 주 : 10 ~ 30 ㎕를 각 커버 슬립에 분배 할 수 있습니다.
    5. 젤이 녹아 유리 커버 슬립에 걸쳐 할 수 있습니다. 참고 : 젤 토폴로지, 심지어 용융 한 후 나타납니다 실리콘이 유리 커버 슬립과 젤을 평평하지 않습니다. 그러나, 추가적인 팽창 후속 단계에서 발생하고 겔 불균일에 기여할 것이다.
    6. 24 웰 조직 배양 접시에 열 블록과 장소에서 유리 함유 젤을 제거합니다.
    7. 반복 8 2.1-2.6 단계 0 % 젤.
    8. 최적의 어닐링 온도 (35 ° C)에서 1 시간 동안 열 젤. 참고 : 젤이 건조 될 때까지 정상이며 젤이 PB​​S에서 배양 할 때이가 해결 될 것입니다.
    9. 15 분 동안 (UV, 365 nm의) 빛을 자외선 80 %와 100 % 젤을 포함하는 판을 노출. NOTE : UV 노광 동시에 접착제를 경화 젤 살균. UV 가교 챔버를 사용할 수없는 경우, 겔은 생물학적 안전 캐비닛에 구비되어 UV 광 아래에 배치 될 수있다. UV 노광 한 후, 겔을 무균 유지 생물학적 안전 캐비넷 아래에서이 프로토콜의 후속 단계를 수행. 또한,이 시점에서 멸균 솔루션을 사용합니다.
    10. DNA의 가교가 4 시간 동안 실온에서 rehybridize 할 수 있습니다.
    11. PBS를 추가하고 O / N 4 ° C에서 배양한다. 참고 : PBS의 배양은, 린스 평형을, 반복 가열 젤을 탈수 할 수 있기 때문에 다시 젤을 부풀.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    (회색) DNA 젤을 제조 한 후 젤 고정 및 작용의 그림 2 도식., 젤 광학 접착제 (녹색)에 의해 유리 커버 슬립 (흰색)에 부착된다. 젤 동시에 경화 및 UV 광에 의해 살균된다. 붓기 후, 젤은 약 1 mm 두께입니다. 다음에, 겔 (빨강 박스 윤곽)이 단계 과정에서 기능화된다. 먼저, 술포 SANPAH은 UV 광 노출에 의해 겔 표면에 아크릴 아미드에 접합된다. 둘째, 겔은 술포 SANPAH에서 설포-N-히드 록시 에스테르에 부착되는, 콜라겐 또는 폴리-D-라이신과 함께 배양된다. 이 그림은 10에서 수정되었습니다.

    3 젤 기능화

    참고 : 폴리 아크릴 아마이드 젤 비활성 물질 (그림 2) 때문에 DNA 젤의 작용은 세포 접착이 필요합니다. 이 섹션에서는, 젤은 두 단계로 작용한다. 첫째, N-6 -Sulfosuccinimidyl (4# 39; -azido-2'-니트로 페닐) 헥사 노 에이트 또는 설포 SANPAH가 공유 DNA 젤의 폴리 아크릴 아미드 백본에 니트로 페닐 아 지드 그룹의 광분해에 의해 연결됩니다. 둘째, 콜라겐 또는 폴리-D-라이신 일차 아민은 겔 표면에 단백질을 부착 술포 SANPAH의 설포 N -hydroxysuccinimide 에스테르에 부착된다.

    1. 피펫으로 우물에서 버퍼를 제거하고 젤을 대기음 않도록주의하십시오. 참고 : 젤을 흡입의 가능성을 줄이기 위해 진공 흡입을 수행하지 마십시오.
    2. 선택 사항) 워시 젤 세 번 실온에서 15 분 동안 초과 아크릴 아마이드 모노머, TEMED 및 APS를 제거합니다.
    3. 각 젤 다루 설포 SANPAH의 약 300 μl를 추가합니다.
    4. 5 분 동안 UV (365 nm의)에 젤을 노출.
    5. 설포 SANPAH를 제거합니다.
    6. 한 번 PBS와 린스 젤 초과 설포 SANPAH를 제거합니다.
    7. 반복 3.3-3.6 단계를 반복합니다.
    8. 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 폴리-D-라이신 0.2 ㎎ / ㎖의 약 300 μL에 젤을 품어. 참고 : 또한, 콜라겐 1 형 O / N 4 ° C에서 0.2 ㎎ / ㎖와 젤을 배양한다.
    9. 과잉 폴리-D-라이신을 제거하기 위해 5 분 동안 PBS로 두 번 젤을 씻으십시오.
    10. 젤 평형을 30 분 동안 미디어의 약 300 μL에 젤을 품어.
    11. 즉시 세포를 도금하기 전에 용지를 제거합니다.

    (4) 세포 배양 및 이미지

    참고 :이 섹션에서 우리는 연화에 대한 또는 셀 도금 후 젤의 심화 정보를 제공합니다. 상세한 세포 배양 프로토콜은 여러 가지 이유로 제공되지 않는다. 첫째, 다수의 세포 유형은 DNA 젤 상에 부착 할 수 있으며, 각 세포 유형은 세포 도금 연구자 특정 조정을 요구할 것이다. 둘째, 표준 세포 및 조직 배양 기술은 이들 실험에 사용되는 수많은 원저, 기술 문서 및 참고 서적에서 찾을 수있다. 특히 DNA 젤 상에 섬유 아 세포 및 신경 세포를 도금 기술은 previ에서 찾을 수 있습니다OU를 출판물 9-11,19-21.

    1. 플레이트 세포. 이 문서에 언급 된 신경 세포 또는 섬유 아세포의 해부 및 / 또는 배양에 관한 프로토콜의 다음 책 9-11,19-21 중 하나를 참조하십시오.
    2. 48 시간의 최소 한 후, 겔 (표 4)에 가까운 제어, L2, R2 또는 용액 1 ㎕를 피펫 팅하여 겔 강도를 변조한다.
      1. 가교 100 % (80 → 100 % 젤) 80 %에서 젤을 단단하게하기 위해, 젤에 가까운 백퍼센트 L2 용액 1 μl를 추가하여 80 % 젤에 L2의 나머지 20 %를 추가합니다.
      2. 가교 80 % (100 → 80 % 젤) 100 %에서 젤을 부드럽게하기 위해, R2는 젤에 가까운 백퍼센트 R2 솔루션 1 μl를 추가하여 100 % 젤에서 가교의 20 %를 제거하는 추가합니다.
      3. 컨트롤의 경우, 젤에 가까운 제어 솔루션의 1 μl를 추가하여 100 %와 80 % 젤의 하위 집합으로 제어 솔루션의 동일한 볼륨을 추가합니다.
    3. 후 원하는 세포 처리 및 데이터 분석을 수행48 시간의 최소.

결과

우리의 연구에 앞서, 세포 ECM 상호 호환 생체 물질은 정적 또는 동적 비가역 단방향 기판 상에 관찰되었다. 이 기판은 정확하게 세포 미세 환경의 동적 특성을 반영하지 않습니다. 우리의 작업은 연화에 세포 ECM 상호 작용을 공부하고 동적 생체 재료를 보강하기위한 더 많은 생리 학적 모델을 제공함으로써 기존의 기술 패러다임을 이동합니다. 이전 연구에서, 우리는 이러한 젤에 다양한 세포 모?...

토론

DNA 겔의 능력은 연화 시키거나 세포 접착 그들에게 세포 기능의 동적 강성 조직의 역할을 연구하는 이상적인 모델을 만든다 전후 완고. 세가지 설계는 기계적 및 생물학적 연구에 사용되었다. 그러나, 모든 세 개의 디자인 가교 길이는 DNA 겔 탄성 (표 2)에 영향을주지 않는 나타내는 각종 비율로 가교 유사한 탄력성이있다. 대조적으로, 아크릴 아마이드 농도는 탄성에 영향을 미친다. ?...

공개

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 말

저자는 감사의 말씀을 프랭크 박사 지앙 박사 데이비드 린 박사 버나드 Yurke 박사 우다이 Chippada을 DNA 겔 기술을 개발에 대한 자신의 기여에 대한; 박사 노넬 Hadzimichalis, SMIT 샤 킴벌리 피터 맨, 자신의 의견이 원고의 편집 로버트 Arter; 척수에 뉴저지위원회 연구 (그랜트 # 07A-019-SCR1, NAL)와 뉴저지 신경 과학 연구소 (MLP)을 포함하여 자금 출처; 및 조직 공학 출판사, 부품이 권한은 그림 3을 다시 인쇄 할 수있는 권한에 대한 그림 2와 그림 4와 생체 재료를 다시 인쇄 할 수.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ssDNAIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesiumAny brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)93290TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solutionFisher Scientific (Pittsburg, PA)BP14021Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)A3678Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)T9281Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglassFisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		12-545-82
Norland optical adhesive 72Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		NOA72
24-well tissue culture plateAny brand.
Microcentrifuge tubesAny brand.
Sulfo-SANPAHProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		C111 or 22589Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)P6407Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type IAffymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		13813Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glassFisher Scientific (Pittsburg, PA)12-544-G
Positive-displacement pipetteGilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		F148504
Heat blockFisher Scientific (Pittsburg, PA)11-718
UV light sourcePlace gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
ThermometerAny brand.
Nitrogen gasGTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		NI 5.0UH-R

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