JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Laboratuvarımız iyi hücre fonksiyonu üzerinde doku sertliği modüle etkilerini anlamak için DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojeller, dinamik bir hidrojel sistemi geliştirdi. İşte, bu hidrojeller hazırlamak için şemaları, açıklamaları ve protokolleri sağlamak.

Özet

Mechanobiology hücre morfolojisi ve fonksiyonunu yönetmenlik fiziksel ipuçlarının kritik bir rol hitap yükselen bir bilimsel alandır. Doku sertlik hastalığı, geliştirme ve yaralanmaya bağlı olarak düzenlemesi nedeniyle Örneğin, hücre fonksiyonu üzerindeki doku elastikliği etkisi mechanobiology araştırmalar için önemli bir alan. Hücreler kaplama kez sertliğini değiştirmeyecektir Statik doku taklit malzeme veya malzemeler, ağırlıklı olarak hücre fonksiyonları üzerine doku sertliğinin etkilerini araştırmak için kullanılır. Statik çalışmalarda toplanan bilgileri değerli iken, bu çalışmalar in vivo hücresel mikroçevresinin dinamik doğasının göstergesi değildir. Daha iyi hücre fonksiyonu üzerinde dinamik sertlik etkilerini gidermek için, bir DNA-çapraz bağlı poliakrilamid hidrojel sistemi (DNA jeller) geliştirdi. Diğer alt-tabakalar, dinamik farklı olarak, DNA, jeller, azaltmak veya uyaran olmadan imal edildikten sonra sertlikteki artış yeteneğine sahiptir. DNA, jeller, DNA crossl oluşmaktadırBir poliakrilamid omurga içine polimerleşir mürekkepler. Ekleme ve tek sarmallı DNA sağlama ile çapraz bağ çıkarma uzamsal, zamansal ve jel elastikiyet döner bir kontrol sağlar. Biz DNA jel elastisite dinamik modülasyonu fibroblast ve nöron davranışı etkilediğini önceki raporlarda göstermiştir. Bu raporda ve video, hazırlık DNA jeller üzerinde DNA jel çapraz mekanizmaları ve adım adım talimatları tanımlayan bir şematik sağlar.

Giriş

Statik ve dinamik yüzeylerde hücre fonksiyonu üzerinde doku esnekliği veya sertliğinin etkilerini incelemek için geliştirilen biyomalzeme iki kategori vardır. Statik yüzeyler onlar hücreleri kaplama ve / veya bir kez imal sonra fiziksel özelliklerini değiştirmek mümkün değildir. Poliakrilamid (PA) jeller mechanobiology araştırmalar 5,17 için sentez edilmiştir ilk iki boyutlu, statik maddelerdir. PA jeller çok yönlü, ucuz, hazırlanması kolay, ve elastik modülünün geniş bir yelpazesi ile imal edilebilir. Bu teknik avantajları PA yaygın olarak uygulanan bir alt tabaka jelleri yapmak, statik yüzeyler in vivo hücre dışı matriks (ECM) ve çevresindeki hücresel çevrenin dinamik doğasının göstergesi değildir. Örneğin, ECM yaralanma, gelişme ya da hastalığın bir sonucu olarak sertlik değişiklikleri maruz kalır. Dinamik alt-tabakalar, bu nedenle mechanobiology çalışmalarda doku taklit eden tabaka model olarak tercih edilir 22,24,25.

Çok sayıda doğal, sentetik, iki boyutlu, üç boyutlu, statik ve dinamik sertlik biyomateryaller doku 1,3,6,16,23,26 taklit etmek için geliştirilmiştir. Bazı dinamik yüzeyler mekanik özelliklerinin 2,4,7,8,12,15,16 değiştirmek için ısı, UV, elektrik akımını, iyonları ve pH değişiklikleri gerektiren, ancak bu uyaranların hidrojelin biyo-uygulama kısıtlayabilirsiniz. DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojeller (DNA, jeller) dinamik bir iki boyutlu esnek substratlardır. DNA çapraz ortama tek bağlı DNA (ssDNA) eklenerek DNA jel sertliğinin, zamansal mekansal ve geri dönüşümlü modülasyonu için izin vermek veya 9-11,13,14,18,21 tampon. Uyaranlara elastikiyet modülasyonu için uygulanır belirtilen dinamik jeller farklı olarak, DNA jeller elastiklik değiştirilmesi için uygulanan ssDNA'nın difüzyon dayanır. Bu nedenle, hücrelerin büyüdüğü üst jel yüzeyi, o oran için modüle edilmiş birinci alanıf esnekliği modülasyon jel kalınlığına bağlıdır.

DNA, jeller, ancak bis-akrilamid çapraz bağlar DNA (Şekil 1) oluşan çapraz bağlar ile değiştirilir, bir poliakrilamid omurgaya sahip olmasıyla da Pensilvanya jel meslektaşları benzerdir. İki ssDNA'larının (SA1; ve SA2) jel DNA çapraz bağ oluşturan bir çapraz bağlayıcı kordon (L2) ile hibridize olur. SA1 ve SA2 hem PA ağına etkili katılması için 5'ucunda bir akridit modifikasyon içeren ayrı diziye sahiptir. Jeller, SA1 ve SA2 hazırlanması için ayrı ayrı bir PA omurgasına polimerize edilir, ve daha sonra polimerize SA1; ve SA2 karıştırılır. L2, çapraz bağlayıcı, ve SA1 SA2, karışıma ilave edilir. L2 baz sekansı, her iki SA1, ve SA2 dizilerine tamamlayıcı olan ve L2, DNA çapraz bağlar oluşturulması için SA1 artı SA2 ile melezleşir. Başlangıç, DNA jel elastikiyet L2 konsantrasyonları ve çapraz bağlama (Tablo 1 tarafından belirlenir ve 2). SA1 ve SA2 (% 100 jelleri olarak adlandırılır), L2 ile% 100 çapraz bağlanmış olduğundan L2 SA1 ve SA2 eşit olarak stokiyometrik miktarlarda ihtiva eden DNA jeller en sert jellerdir. Bu nedenle daha düşük bir çapraz bağlanma, DNA yüzdesi ve L2 sonucu daha düşük konsantrasyonlarda, daha yumuşak jeller DNA. (% 50 jel olarak belirlenmiştir)% 50 gibi düşük bir çapraz bağlanmış jeller, 9-11 inşa edilmiştir.

figure-introduction-3424
Şekil 1. çapraz bağlama ve DNA jel uncrosslinking şematik 9-11,13,14,18,21 Adım 1:. SA1, (kırmızı) ve SA2 (mavi) tek tek poliakrilamid omurga (siyah) polimerize edilir. Polimerizasyondan sonra SA1 ve SA2 polimerize çözeltiler karıştırılır. Adım 2: L2 (yeşil) ilave edildi ve jel ilave bağlar oluşturduğu SA1 artı SA2 ile hibridize edilir. Adım 3: R2, t ile hibridizeO L2 Toehold. Adım 4: R2'nin Toehold hibridizasyon SA1 ve SA2 gelen L2 unzipping iter.

PA jellerin aksine, DNA, jeller katılaştıran ve sentez sonrasında yumuşatır. Bu nedenle, DNA, jel üzerinde yetiştirilen hücreler, dinamik sıkılık değişikliklere tabi tutulabilir. Hücre-yapışkan jel sertleştirilmesi için, L2 çapraz bağların yüzdesini arttırmak için düşük bir yüzde jellerin kültür ortamına ilave edilebilir. Hücre-yapışkan jel yumuşatmak için, L2 çapraz bağların 10,13,21 yüzdesini azaltmak için çıkarılabilir. L2 ve L2 SA1 SA2 (Tablo 1) için uncrosslink izin vermek için 3 'ucunda bir ek Toehold dizisine sahiptir. L2 çıkarılması R2'nin adı verilen bir dönüş telin hibridizasyonu ile gerçekleştirilir. R2, L2 tam uzunlukta tamamlayıcı olan ve L2 toehold ilk hibridize olur. Toehold melezleştirme çapraz bağ ortadan kaldırır ve jel sertliği azaltır ve SA1 SA2 gelen L2 unzipping, iter.

Bu raporda vetalimatlar sertleştirme ve DNA jel yumuşatıcı hazırlanması için sağlanmış olan adım adım video. % 100 ve% 80 jel preparasyonlar tarif edilmesine rağmen, bu protokol için diğer başlangıç ​​ve son çapraz bağlanmış yüzdeleri DNA jeller oluşturmak için uygun olabilir. Genel olarak,% 100 ve% 80 jel, hazırlanan cam kapak slipleri üzerinde hareketsiz kılınmış, fonksiyonalize ve hücreleri ile tohumlanmıştır. L2% 80 jellerin ortama ilave edilir ve R2,% 100 jeller, kaplama sonrası 48 saat arasında ortama ilave edilir. R2 ortama eklenmesi, çapraz bağlı% 80 ile% 100 jelleri yumuşatır ise ortama L2 ek olarak,% 100 çapraz bağlanmış jel% 80 sertleşir. Kasıldı jeller 80 →% 100 jeller olarak belirlenmiş ve yumuşatılmış jeller metinde 80 → 100 olarak% jelleri belirlenir. Kontrol ya da statik jeller, ssDNA için Ts oluşan ya da% 100 ve% 80 jeller başka bir dizi teslim edilir. Esnekliği modüle takip eden iki gün, en az sonra, hücreler işlenmiş ve analiz edilebilir.

DNA çapraz bağ Bazlar arasında Sıra (Toehold) Modifikasyon Erime sıcaklığı (Tm, ° C) Yorumlar
5 '→ 3'
Tasarım 1 SA1 10 GKRY SKK TTG C 5 'akridit 34,9
SA2 10 GTC AGA ATG bir 5 'akridit 23.6
L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G KTHY CAC TTG 56 Bir 10 bp Toehold dizisi dahildir.
R2 30 CAA GTG TAG CGK ACC TTT JGK TCA GAA TGA R2, L2 tamamlayıcıdır
Tasarım 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'akridit 46,9
SA2 14 GTT TTK CAA TCA GA 5 'akridit 40.2
L2 40 TCT GAT TGG GAA AC GTC KTHY TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 Bir 12 bp sekansı Toehold dahildir.
R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65.9 R2, L2 tamamlayıcıdır
Design, 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GKRY ATG TC 5 'akridit 55
SA2 20 CAT GTT TAG GGA CGA CTG GA 5 'akridit 56.6
L2 40 TTK AGT CGT CCC TAA DHA TG G AKA TTG CAT ACA SKK CCG T 68.8 Toehold dahil değildir.
Kontrol Kontrol 20-40 AAA AAA (vb) veya
TTT TTT (vb)

Hücresel ve mekanik çalışmalar d birkaç kullanmıştır. SsDNA'ya 9-11,13,14,18,21 Tablo 1. Taban dizileriifferent çapraz tasarımları statik ve dinamik mekanik özellikleri bir dizi DNA jeller oluşturmak için. Çapraz tasarım ile modüle edilmiş parametreler baz dizisi ve dizi uzunluğu veya çapraz uzunlukta. Kalın ve italik yazı tipi SA1 ve L2 arasındaki sırasıyla SA2'nin ve L2 arasındaki baz eşleşmesinin göstermektedir.

Tasarım
1 2 3
Akrilamid Konsantrasyon (%) 10 10 10 4
SA1 artı L2 hibridize SA2 (% çapraz bağlanmış) 50 80 100 50 80 100 100 100
Esneklik (kPa ± SEM ortalama) 6.6 ± 0.6 17.1 ± 0.8 29.8 ± 2.5 5.85 ± 0.62 12.67 ± 1.33 22.88 ± 2.77 25.2 ± 0.5 10.4 ± 0.6

Tablo 2. DNA, jel 9-11,13,14,18,21. Akrilamid konsantrasyonunun, çapraz yüzdesi ve çapraz uzunluğun Young modülü (E), DNA jellere de modüle edilebilir. Tasarımlar 1, 2 ve 3, sırasıyla, 20, 28 ve 40 bp'lik bir çapraz uzunluklara sahiptir. Tüm tasarımlar için% 100 jeller jel elastikiyeti etkilemez çapraz uzunluğunu gösteren benzer modülüne sahiptir. Bununla birlikte, akrilamid konsantrasyonunun değişiklikler DNA jel esnekliğini değiştirir.

Protokol

Not: hücre işleme jel hazırlama tüm protokol altı gün en az sürer. Jel hazırlanması için tahmini süresi 8 saat artı bir O / N kuluçka olduğunu. Jel immobilizasyon ve DNA tavlama için tahmini süre 8 saat artı bir O / N durulama adımdır. Jel fonksiyonlandırmalar için tahmini süre 2 saattir. Hücre kaplama ve büyümesi için Zaman kültür tipine ve uygulamaya bağlıdır, ancak dört gün en az gereklidir.

DNA Jellerinin 1. Hazırlık

NOT: Üç ayrı aşamada DNA jeller hazırlayın. İlk olarak, tek bir PA omurgasına SA1 ve SA2 ssDNA polimerize. Bu çözümler SA1 polimerize çözeltisi ve SA2 polimerize çözelti sırasıyla denir (§1.1). İkincisi, çapraz bağlayıcı, geri dönüşümlü iplikçik ve kontrol ssDNA'larının çözülür. Liyofilize L2 ssDNA (çapraz bağlayıcı madde) içinde çözülür. Bu çözelti,% 100 L2 olarak adlandırılır ve% 100 jelleri (§1.2) imal etmek için kullanılır. 100% L2 çözeltisi bir kısım seyreltin% 80. Bu çözelti,% 80 L2 olarak adlandırılır ve% 80 jel imal etmek için kullanılır. §4 kullanmak liyofilize R2 (geri dönüşümlü iplik) ve kontrol ssDNA'yı çözülür. Sırasıyla% 100 ve% 80 için jeller oluşturmak üzere 10: 6 (L2 SA1: SA2) Üçüncü 10 oranında polimerize SA1 çözeltisi SA2 polimerize çözeltisi ve% 100 ya da% 80 L2 çözeltisi karıştırılır. (§1.3).

SA1 ve SA2 Polimerleşerek Çözümleri 1. Hazırlık

  1. Seçip Tablolar 1 ve 2 arasından uygun SA1 SA2, L2 ve R2, baz dizilerini sipariş. Baz sekansları dizi uzunluğu ve daha önceki raporlarda 9-11,13,14 olarak optimize edilmiştir.
  2. Tüm solüsyon formülasyonları (Tablo 3-4) hesaplayın. NOT: Sorun giderme amacıyla Titizlikle belge hesaplamaları. Excel şablonu yapımı önerilmektedir ve DNA jel hazırlanması için tekrar tekrar kullanılabilir. (Tasarım 2 için tablolamamn bir örnek için Tablo 3 ve 4 bakınızTablo 1 ve 2). Tablo 4'te belirtilen miktarlar, bu protokol boyunca kullanılacaktır, ancak miktarlar liyofilize ssDNA her bir kısım ile değişecektir.
Çözüm Çözüm Hazır Konsantrasyon SA1 veya SA2 polimerize çözelti içindeki stok solüsyon yüzdesi (h / h) SA1 veya SA2 Polimerleşerek Çözümü Çözüm Final Konsantrasyon
Akrilamid (No-bisakrilamid) % 40 25 % 10
SA1 veya SA2 çözüm 100% 60 % 60
TBE tamponu 10x 10 1x
TEMED % 20 2.5 % 0.50
APS % 2 2.5 % 0.05

Tablo 3. SA1 veya SA2 polimerize imalatı çözümler için çözümler yüzdesi. İlk sütun, DNA jeller formüle için çözümlerini gösterir. İkinci kolon, bu çözümlerin stok konsantrasyonlarını gösterir. Üçüncü sütun SA1 veya SA2, polimerleştirilmiş çözeltiler içinde stok çözeltileri yüzdesini gösterir (h / h). Son sütun SA1, SA2 Çözeltilerin ve nihai konsantrasyonlar yansıtır.

ssDNA'ya çözümleri (§1.1)
Çözüm Bileşenleri
Çözüm Hazır Konsantrasyon Nihai Çözüm Konsantrasyon Hesaplama Tutar ekle Yorumlar
SA1 çözüm Liyofilize SA1 ssDNA'nın 320.7 nmol 3.00 mM 320.7 nmol / 3.00 nmol ul -1 = 107 ul Liyofilize ssDNA'ya TE tampon 107 ul SA1 çözüm SA1 polimerize çözümün% 60'dır.
107 ul / 0.600 = 178 ul
178 ul SA1 polimerize çözeltisi (Tablo 3) toplam miktarıdır.
SA2 çözüm Liyofilize SA2 ssDNA'nın 324,4 nmol 3.00 mM 324,4 nmol / ul 3.00 nmol -1 = 108 ul Liyofilize ssDNA'ya TE tamponu 108 ul SA2 çözüm SA2 polimerize çözümün% 60'dır.
108 ul / 0.600 = 180 ul
180 ul SA2 polimerize çözeltisi (Tablo 3) toplam miktarıdır.
100% L2 çözeltisi Liyofilize L2 ssDNA'nın 657.4 nmol 3.00 mM 657,4 nmol / ul 3.00 nmol -1 = 219 ul Liyofilize ssDNA'ya TE tamponu 219 ul % 80 L2 çözeltisine% 100 L2 bir kısım seyreltin
% 80 çözelti, L2 100% L2 ssDNA'nın 80 ul 80% - 100% L2 çözeltisi 80 ul TE tampon maddesi, 20 ul
Kontrol çözümü Liyofilize 332.6 nmol poli T ya da ssDNA 3.00 mM 332,6 nmol / ul 3.00 nmol -1 = 111 ul Liyofilize ssDNA'ya TE tamponu 111 ul
R2 çözüm R2, liyofilize ssDNA'nın 193.8 nmol 3.00 mM 193,8 nmol / ul 3.00 nmol -1 = 64.6 ul Liyofilize ssDNA'ya TE tamponu 64.6 ul
Polimerize çözümleri (§1.2)
SA1 polimerize çözüm % 40 akrilamid % 10 178 ul x 0,25 = 44.5 ul 45 ul (Yukarıda ve Tablo 3'e bakınız) 178 ul toplam hacmine dayalı olarak akrilamid, TBE, APS ve TEMED miktarını hesaplayın.
10x TBE 1x 178 ul x 0,10 = 17,8 ul 18 ul
% 100 SA1 çözüm % 60 - 107 ul SA1 çözeltisi SA1 polimerize çözeltisinin% 60 (yukarıda ve Tablo 3).
% 2 APS % 0.05 178 ul x 0.025 = 4.45 ul 4,5 ul Ekleyin ve TEMED eklemeden önce APS karıştırın.
% 20 TEMED % 0.50 178 ul x 0.025 = 4.45 ul 4,5 ul
SA2 polimerize çözüm % 40 akrilamid % 10 180 ul x 0,25 = 45 ul 45 ul (Yukarıda ve Tablo 3'e bakınız) 180 ul toplam hacmine dayalı olarak akrilamid, TBE, APS ve TEMED miktarını hesaplayın.
10x TBE 1x 180 ul x 0,10 = 18 ul 18 ul
% 100 SA2 çözüm % 60 - 108 ul SA2 çözeltisi SA2 polimerize çözeltisinin% 60 (yukarıda ve Tablo 3).
% 2 APS % 0.05 180 ul x 0.025 = 4.5 ul 4,5 ul Ekleyin ve eklemeden önce APS mix TEMED
% 20 TEMED % 0.50 180 ul x 0.025 = 4.5 ul 4,5 ul
Jel çözümleri (§1.3)
Jel% 100 çözelti % 100 SA1 polimerize çözüm 10 parça - 10 ul Aşağıdaki SA1 ile% 100 jeller kime: SA2, L2 oranı, 10: 10: 6.
% 100 SA2 polimerize solKatkı 10 parça - 10 ul
100% L2 çözeltisi 6 parça - 6 ul
Jel% 80 çözelti % 100 SA1 polimerize çözüm 10 parça - 10 ul Aşağıdaki SA1 ile% 80 jeller kime: SA2: L2 oranı, 10: 10: 6.
100% SA2 polimerize çözeltisi 10 parça - 10 ul
% 80 çözelti, L2 6 parça - 6 ul
Dinamik jelleri (§3-4)
80 →% 100 jel % 80 jel % 100 gel Hesaplama 1: Kültür ortamı içine 100% L2 çözeltisi 1 ul Hesaplamalar kapak slipleri üzerinde 20 ul jel sahip dayanmaktadır. İlk olarak, jel ul içine 20 ul% 100 L2 çözeltisi parçalar dönüştürün. İkinci olarak, çapraz bağlanma ek bir% 20 için gerekli olan% 100 L2 çözeltisi (ul) miktarını hesaplayın. Jel% 100 L2 çözüm bu miktar ekleyin.
(20 ul / 26 ölçü) 6 birim = 4.6 ul x
Hesaplama 2:
5 ul 0.2 x = 1 ul
100 →% 80 jel % 100 jel % 80 jel Hesaplama 1: Kültür ortamı içine 100% R2'nin çözeltisi 1 ul Hesaplamalar kapak slipleri üzerinde 20 ul jel sahip dayanmaktadır. İlk olarak, t dönüştürmekul jel içine 20 ul% 100 L2 çözeltisi diye parçalar. İkincisi,% 20 jel oluşturmak için kaldırılması gereken% 100 L2 çözeltisi (ul) miktarını hesaplamak. Jel R2 çözümü bu miktar ekleyin.
(20 ul / 26 ölçü) 6 birim = 4.6 ul x
Hesaplama 2:
5 ul 0.2 x = 1 ul
% 100 jel (Kontrol) % 100 jel % 100 jel - Kültür ortamı içine kontrol solüsyonu 1 ul Kontrol solüsyonu miktarı R2'nin çözeltisi miktarı ilave eşdeğerdir.
% 80 jel (Kontrol) % 80 jel % 80 jel - Kültür ortamı içine kontrol solüsyonu 1 ul Kontrol solüsyonu miktarı L2 çözeltisi ilave% 100 miktarına eşdeğerdir.

Tablo DNA jel hazırlanması için, 4. Örnek hesaplamaları. Sahte numaraları 80,% 100% hazırlanması 100 → 80,% 80 ve% 100 → jeller için hesaplamalar tasvir etmek için sağlanmıştır. DNA jeller Tablo 1 Tasarım 2 bulunmaktadır.

  1. 15 saniye boyunca 2000 x g'de santrifüje liyofilize SA1, ssDNA, tüm ssDNA şişenin dibinde olduğundan emin olmak için. NOT: SA1 çözümün doğru konsantrasyonu DNA jel sentezi için önemlidir.
  2. Şişeye (Tablo 3-4) 1x Tris-EDTA içinde 107 ul, pH 8.0, tampon (TE tamponu) ilave edilerek 3 mM SA1 çözeltisi hazırlayın.
  3. SsDNA, pelet 5 dakika boyunca 70 ° C kadar ya da TE tamponu içinde ısı SA1, tamamen çözülür. Not: Isıtma sıcaklığı DNA, tek bükümlü bir halde olmasını sağlamak için, erime sıcaklığı (Tm) 5 ° C olmalıdır.
  4. % 40 akrilamid ve 1 ekleyerek SA1 polimerizasyon çözeltisi hazırlayın0 x Tris-borat-EDTA belirtilen yüzdelerde (TBE) tamponu (Tablo 3). Bu örnekte, çözelti SA1, 107 ul (Tablo 4) için, sırasıyla, 45 ve 18 ul ekle.
  5. 3 dakika azot gazı ile gazı giderilmekte ve karıştırma işleminin kolaylaştırılması için. Çözelti içine, azot gaz kaynağına bağlı bir P200 ucu takın ve yavaşça azot gazı çözelti içinden geçmesine izin verir. Sıçramasını önlemek için gaz çıkarma SA1 çözeltisine önce su içinde azot gazı akış hızı kontrol edin.
  6. Çözüm toplamak için 2.000 x g'de 15 saniye santrifüj.
  7. Jel polimerizasyonu başlatmak için% 2 amonyum persülfat (APS, Masalar 3-4) 4,5 ul ekleyin.
  8. Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
  9. Homojen polimerizasyon için çözüm toplamak için 2.000 x g'de 15 saniye santrifüj.
  10. Polimerizasyonu katalize% 20 tetrametilendiaminin (TEMED, Masalar 3-4) 4,5 ul ekleyin.
  11. Tüpü ters çevirinkarıştırmak için birkaç kez.
  12. Homojen polimerizasyon için çözüm toplamak için 2.000 x g'de 15 saniye santrifüj.
  13. 3-5 dakika boyunca nitrojen gazı ile gazı giderilmekte polimerizasyonun tamamlanacağı verilir ve reaksiyona girmemiş monomerlerin en aza indirir.
  14. Polimerizasyonu tamamlamak üzere oda sıcaklığında 10 dakika süre ile çözelti inkübe edin. NOT: Bu çözüm sa1 polimerize çözümü denir.
  15. Tekrar liyofilize SA2 ssDNA ile 1.1.3-1.1.16 adımları ama akrilamid 45, 18, ​​4.5 ve 4.5 ul, TBE APS ve TEMED SA2 çözeltisi (Tablo 3-4) sırasıyla, 108 ul. NOT: SA1 ve SA2 polimerize çözümleri bir aya kadar 4 ° C'de saklanabilir.

L2, R2, ve Kontrol Çözümleri 2. Hazırlık

  1. R2, liyofilize ssDNA ile adımları tekrarlayın 1.1.3-1.1.5 ancak TE tamponu (Tablo 4), 64.4 ul ekleyin.
  2. TE tamponu 111 ul (Tablo 4 liyofilize kontrol ssDNA'ya ile 1.1.3-1.1.5 adımları tekrarlayın fakat eklemek ).
  3. Liyofilize L2 ssDNA'ya ile 1.1.3-1.1.5 adımları tekrarlayın fakat TE tamponu (Tablo 4) 219 ul ekleyin. NOT: Bu% 100 L2 çözümdür. SA1 ve SA2 polimerize çözümleri (bkz §1.3)% 100 çapraz bağlı DNA jel (% 100 jel) oluşturacak% 100 L2 solüsyonu eklenerek SA1 SA2 ve L2 stokiyometridışı eşdeğer olacaktır çünkü.
  4. 100% L2 çözeltisi 80 ul (Tablo 4) 1x TE tamponu 20 ul eklenmesi ile% 80 ile% 100 L2 çözeltisi bir kısım seyreltin. NOT: Bu çözüm% 80 L2 çözümdür. SA1 ve SA2'nin sadece% 80 L2 çapraz bağlanmış olacak çünkü SA1 ve SA2 polimerize çözümleri (bkz §1.3)% 80 çapraz bağlı DNA jel (% 80 jel) oluşturacak 80% L2 çözümü ekleme. Çözümler bir aya kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir.

Jel Çözümleri 3. hazırlanması

  1. Isı SA1 ve çözelti viskozitesi kadar 70 ° C'de polimerize SA2 çözeltiler (yaklaşık 1 dakika) azalır. 80 ° sıcaklığını yükseltmekÇözelti hala pipet fazla yapışkan olduğu durumlarda ° C.
  2. 10 ul veya 10 ul SA1, polimerize çözeltisinin 10 parça veya SA2 polimerize çözeltisi (Tablo 4) ve 10 ölçü ilave edin. NOT: SA1 ve SA2 polimerize çözümleri pipet son derece ağdalı ve zordur. Konsantrasyonları jel oluşumu için kritik olduğundan, bu noktadan itibaren pozitif deplasmanlı pipet kullanın ya da diğer aktarma teknikleri için tartışma bakın. Ayrıca, birden çok, küçük parçalar (> 20 ul) yerine tek, büyük hacimli pipet.
  3. , Birlikte (70 ° C'de 15 sn için) ısıtma alternatif ve 1 dakikalık bir toplam (bir pipet ucu ile 15 saniye) karıştırma ile karıştırın ve SA1, SA2 polimerize çözümleri.
  4. % 100 jel (Tablo 4) oluşturmak için 6 ul% 100 veya L2 çözeltisi 6 birim ekleyin.
  5. Alternatif ısıtma ve aşama 1.3.3 tarif edildiği gibi karıştırılarak karıştırın.
  6. Uygun tavlama sıcaklığında 1 saat (35 ° C) ısı jeli. Hesaplamak, birdüşük erime sıcaklığı (Tablo 1), ssDNA dizisinden 5 ° C sıcaklığına çıkarılarak nnealing.
  7. 60 mm Petri kabı içine 100% jel pipetle.
  8. DNA çapraz oda sıcaklığında 4 saat boyunca inkübe edilerek rehybridize jel ile devam etmesini sağlar.
  9. PBS, kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden ve oda sıcaklığında O / N inkübe ile kapak jeli. NOT: Jeller yaklaşık 3 kat daha başlangıç ​​hacmine şişer. Buna ek olarak, jel jellerin dışına dağılacaktır tampon ve fazla akrilamid ile dengeye olacaktır. PBS Kalsiyum ve magnezyum DNA hibridizasyonu stabilize ve (toubleshooting jel patlamasını Tartışma) patlama jel önlemek.
  10. Petri kabı kalan tamponu çıkarın.
  11. % 80 jeller imal etmek, tekrar 1.3.1-1.3.10 adımları ama% 80 L2 çözeltisi ile adım 1.3.4% 100 L2 çözüm değiştirin. En fazla bir ay boyunca 4 ° C 'de% 100 ve% 80 jel saklayın. NOT: 80% ve 100% jeller arasındaki sıkılığı farklar, fiziksel ayırt edilebilir.

    12. Camına 2. Jel İmmobilizasyonu

    NOT: cam kapak slipleri üzerine 100 veya% 80% jeller alikolarını hareketsiz (Şekil 2).

    1. Yaklaşık 30 saniye ya da daha az jel pipetle yapışkan olana kadar, 70 ° C'de% 100 jel ısıtın.
    2. Yer cam kapak 70 ° C ısı bloğu üzerine kayıyor ve 1-2 dakika boyunca ısıtmak için izin verir.
    3. Her cam kapak kayma optik yapıştırıcı bir damla ekleyin.
    4. Her bir cam kapak slip (Tablo 4) başlayarak% 100 jeli 20 ul ekle. NOT: 10-30 ul her kapak kayma reçete edilebilir.
    5. Jel erir ve cam kapak kayma yayılmış izin verin. NOT: jel topoloji, hatta erime sonra görünür bir silikonlu cam kapak slip ile jel dümdüz değilse. Bununla birlikte, ilave şişme müteakip aşamalarda oluşur ve jel düzgünsüzlüğe katkıda bulunacaktır.
    6. Bir 24-yuvalı doku kültürü çanağı içine ısıtma bloğu ve bir yerden bir cam ihtiva eden jel çıkarın.
    7. Tekrar 8 ile 2.1-2.6 adımları 0% jel.
    8. Uygun tavlama sıcaklığında (35 ° C) 1 saat boyunca ısı jeller. NOT: Bu jeller kuru olmak için normal olduğunu ve jeller PBS içinde kuluçkaya zaman bu çözülecektir.
    9. 15 dakika boyunca (UV, 365 nm): ultraviyole ışına% 80 ve% 100 içeren jeller plakaları Açığa. NOT: UV ışınlarına maruz kalma aynı anda tutkal tedavileri ve jeller sterilize. UV çapraz bağlama bölme mevcut değilse, jeller, biyolojik güvenlik kabininde donatılmış bir UV ışık altında yerleştirilebilir. UV ışınlarına maruz kalan, jel sterilite korumak için biyolojik güvenlik kabini altında bu protokolün sonraki adımları uygulayın. Ayrıca, bu noktadan itibaren steril çözümleri kullanın.
    10. DNA çapraz 4 saat boyunca oda sıcaklığında rehybridize izin verin.
    11. PBS ekleyin ve O / N 4 ° C'de inkübe edin. NOT: PBS inkübasyon, durular equilibrates ve tekrarlanan ısıtma jeller kurutabilir çünkü yine jeller şişer.

    51323 / 51323fig2highres.jpg "/>
    (Gri) DNA jeller hazırlandıktan sonra jel hareketsizlik ve fonksiyonlandırmalar Şekil 2. şematik., Jeller optik tutkal (yeşil) tarafından cam kapak slipleri (beyaz) bağlıdırlar. Jeller aynı anda tedavi ve UV ışığı ile sterilize edilir. Kabardıktan sonra jeller yaklaşık 1 mm kalınlığındadır. Sonra, jeller (kırmızı kutu hatlarıyla) ile iki aşamalı bir işlemde fonksiyonalize edilir. İlk olarak, sülfo-SANPAH UV ışığına maruz ile jel yüzeylerde akrilamid konjuge edilir. İkinci olarak, jel sülfo-SANPAH sülfo-N-hidroksisüksinimit ester bağlanır ki, kolajen ya da poli-D-lisin ile inkübe edilir. Bu rakam 10 ile modifiye edilmiştir.

    3. Jel fonksiyonlandırmalar

    Not: poliakrilamid jelleri atıl maddeleri (Şekil 2), çünkü DNA jel işlevselleştirme hücre yapışması için gereklidir. Bu bölümde, j eller, iki adımda fonksiyonalize edilir. İlk olarak, N -Sulfosuccinimidyl-6-(4-# 39; azido-2'-nitrofenilamino) heksanoat ya da sülfo-SANPAH kovalent DNA poliakrilamid jellerin omurgasına nitrofenil azid grubunun, fotoliz ile bağlantılı olacaktır. İkinci olarak, kollajen ya da poli-D-lisin olarak birincil aminlerdir jel yüzeyine proteinleri bağlamak için sülfo-SANPAH içindeki sulfo-N-hidroksisukinimid ester eklenecektir.

    1. Bir pipet ile kuyularda tamponu çıkarın ve jel aspire dikkat edin. NOT: jel aspire olasılığını azaltmak için vakum aspirasyon yapmayın.
    2. İsteğe bağlı) Yıkama jeller üç kez oda sıcaklığında 15 dakika boyunca fazla akrilamid monomeri TEMED, ve APS kaldırın.
    3. Her jel kapsayacak sülfo-SANPAH yaklaşık 300 ul ekleyin.
    4. 5 dakika boyunca UV (365 nm) jelleri Açığa.
    5. Sülfo-SANPAH çıkarın.
    6. PBS ile bir kez durulayın jeller aşırı sülfo-SANPAH kaldırmak için.
    7. Tekrarlayın 3,3-3,6 adımları.
    8. 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N, 1 saat boyunca, poli-D-lisin, 0.2 mg / ml, yaklaşık 300 ul jeller inkübe. Not: Alternatif olarak, kollajen tip 1 O / N 4 ° C'de 0.2 mg / ml 'si ile inkübe jeller.
    9. Fazla poli-D-lisin bertaraf etmek için 5 dakika boyunca iki kez PBS ile yıkayın jeller.
    10. Dengelenmeye jelleri, 30 dakika boyunca ortam yaklaşık 300 ul jeller inkübe edin.
    11. Hemen hücreleri kaplama önce ortamı çıkarın.

    4. Hücre Kültürleme ve Görüntüleme

    NOT: Bu bölümde, biz yumuşama ilgili veya hücre kaplamadan sonra jeller sertleşme ayrıntıları. Ayrıntılı bir hücre kültürü protokol çeşitli nedenlerle sağlanmaz. İlk olarak, çok sayıda hücre tipleri DNA, jeller üzerine yapışır ve her bir hücre tipi, hücre kaplama için araştırmacı tarafından özel ayarlamalar gerektirecektir. İkincisi, standart hücre ve doku kültürü teknikleri, bu deneyler için kullanılan ve sayısız özgün makaleleri, teknik makaleler ve referans kitapları bulunabilir. Özellikle DNA jeller üzerine fibroblastlar ve nöronlar kaplama teknikleri içerebilmektedir bulunabilirlı yayınlar 9-11,19-21.

    1. Plaka hücreleri. Bu maddede belirtilen nöronların veya fibroblast diseksiyonu ve / veya kültürlemenin ilgili protokoller için, aşağıdaki yayınlar 9-11,19-21 birine bakın.
    2. 48 saat sonra en az, jel (Tablo 4) yakın bir kontrol, L2, ya da R2 bir çözeltinin 1 ul pipetleme jel sertliği modüle eder.
      1. Çapraz bağlanmış 100 (% 80 →% 100 jeli) ile% 80 jel sertleştirilmesi için, jel yakın% 100 L2 çözeltisi 1 ul ekleyerek% 80 jeller L2 geri kalan% 20 ekleyin.
      2. Çapraz bağlı% 80 (100% 80 → jeller) ila% 100 den jeller yumuşatmak için, R2, jel yakın% 100 R2'nin çözeltisi 1 ul ekleyerek% 100 jellerinden çapraz bağlarının% 20 kaldırmak ekleyin.
      3. Kontroller için jel yakın kontrol solüsyonu 1 ul ekleyerek% 100 ve% 80 jellerin bir alt kontrol çözeltisinin eşit hacimlerini ekleyin.
    3. Sonra istenilen hücre işleme ve veri analizi yapın48 saat en az.

Sonuçlar

Çalışmalarımızda önce, hücre-ECM etkileşimleri statik uyumlu biyomalzeme veya geri dönüşümsüz ve tek yönlü dinamik yüzeylerde gözlendi. Bu substratlar doğru hücresel mikroçevresinin dinamik doğasını yansıtmıyor. Çalışmalarımız yumuşatılması üzerinde hücre-ECM etkileşimler üzerinde çalışmak ve dinamik biyo materyaller sertleştirmek için bir daha fizyolojik bir model sağlayarak mevcut teknik paradigmaları kaydırır. Daha önce yapılan çalışmalarda, bu jelleri üzerinde çe?...

Tartışmalar

DNA, jellerin özelliği yumuşatmak ya da hücre yapışması olanağına hücre işlevi üzerindeki dinamik doku sertliği rolünü incelemek için ideal bir model haline getirir önce ve sonra sertleştirir. Tüm üç tasarım mekanik ve biyolojik çalışmalarda kullanılmıştır. Bununla birlikte, her üç tasarım çapraz uzunluk DNA jel esneklik (Tablo 2) etki etmediğini gösterir, çeşitli çapraz bağlama yüzdeleri benzer esnekliklere sahiptir. Bunun aksine, akrilamid konsantrasyonunun elas...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar teşekkür etmek istiyorum: Dr Frank Jiang, Dr David Lin, Dr Bernard Yurke ve Dr Uday Chippada DNA jel teknoloji geliştirme katkıları için; Dr Norell Hadzimichalis, Smit Şah, Kimberly Peterman, onların yorum ve bu yazının düzenleme için Robert Arter; Omurilik üzerinde New Jersey Komisyonu Araştırma (Grant # 07A-019-SCR1 NAL) ve New Jersey Nörobilim Enstitüsü (MLP) dahil finansman kaynakları; ve Doku Mühendisliği yayıncılar, Bölüm A izni Şekil 3 yeniden basım izni için Şekil 2 ve 4 ve biyomalzemeleri yeniden yazdırmak için.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ssDNAIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesiumAny brand.
100x Tris-EDTA buffer (TE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		T9285
10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)93290TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solutionFisher Scientific (Pittsburg, PA)BP14021Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)A3678Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)T9281Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12 mm diameter round coverglassFisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		12-545-82
Norland optical adhesive 72Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		NOA72
24-well tissue culture plateAny brand.
Microcentrifuge tubesAny brand.
Sulfo-SANPAHProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com or thermofisher.com		C111 or 22589Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37 °C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)P6407Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type IAffymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		13813Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 x 60 cover glassFisher Scientific (Pittsburg, PA)12-544-G
Positive-displacement pipetteGilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		F148504
Heat blockFisher Scientific (Pittsburg, PA)11-718
UV light sourcePlace gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
ThermometerAny brand.
Nitrogen gasGTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		NI 5.0UH-R

Referanslar

  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
  3. Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
  4. Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
  5. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  6. Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
  7. Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
  8. Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
  9. Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
  10. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
  11. Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
  12. Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
  13. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
  14. Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
  15. Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
  16. Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
  17. Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  18. Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
  19. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
  20. Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
  21. Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
  22. Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
  23. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
  24. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  25. Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
  26. Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 90genel biyom hendislikElastikviskoelastikbis akrilamidy zeysertlikdinamikstatikn ronfibroblastuyumECMmechanobiologyayarlanabilir

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır