עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Summary

כלי דם הוא מפתח לגישות בהנדסת רקמות מוצלחת. לכן, טכנולוגיות אמינות נדרשות כדי להעריך את ההתפתחות של רשתות כלי דם ברקמות מבנים. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, יעיל וחסכונית כדי לחזות ולכמת כלי דם בגוף חי.

Abstract

כלי דם בלתי מספקים נחשב לאחד הגורמים העיקריים המגבילים את ההצלחה הקלינית של מבני רקמות מהונדסות. על מנת להעריך אסטרטגיות חדשות שמטרתם לשפר את כלי הדם, שיטות אמינות נדרשות לבצע בצמיחה של כלי דם חדשים לתוך פיגומים ביו המלאכותי לעין ולכמת את התוצאות. במהלך השנים של השנים האחרונות, הקבוצה שלנו הציגה מודל פגם עור מלא המאפשר ההדמיה הישירה של כלי דם על ידי שקוף ומספק את האפשרות של כימות באמצעות פילוח דיגיטלי. במודל זה, אחד בניתוח יוצר פגמי עור מלאים בחלק האחורי של עכברים ומחליף אותם עם החומר שנבדק. יכולים גם להיות משולבים מולקולות או תאים של עניין בחומרים כאלה כדי ללמוד ההשפעה הפוטנציאלית שלהם. לאחר זמן תצפית של בחירה של האדם עצמו, חומרי explanted להערכה. פצעים דו צדדיים לספק את האפשרות של ביצוע השוואות פנימיות הבלמזער חפצים בין אנשים, כמו גם של הפחתת מספר בעלי החיים הדרושים למחקר. בהשוואה לגישות אחרות, השיטה שלנו מציעה ניתוח פשוט, אמין וחסכוני. אנחנו צריכים ליישם את המודל הזה ככלי שגרתי לביצוע הקרנה ברזולוציה גבוהה בעת בדיקת כלי דם של חומרים ביולוגיים שונים וגישות ביו הפעלה.

Introduction

בעשורים האחרונים, הנדסת רקמות נפתחה אופציה טיפולית חדשה שתחליף את מומי רקמה עם תאים של הגוף עצמו ^1. על מנת לתמוך בתהליך הפיזיולוגי של התחדשות רקמות, פיגומים מעוצבים כמבנה מתכלה, המספק תרחיש שבו תאים מהמיטה הפצע יכולים לגדול ולשחזר את הפגם ^2,3.

כלי דם בלתי מספקים נחשב למכשול העיקרי, אשר מחזיק בגב פריצת הדרך הקלינית של פיגומי bioartificial ^4. עם ingrowth של תאים, הביקוש לחומרים מזינים וחמצן עליות וכלי דם של החומר הופך להיות חיוני. כלי דם בלתי מספקים או מתעכבים ולכן יכולים להוביל לנימק של מוצרי רקמות מהונדסות ⁵ מרכזי. בנוסף, כלי דם מספקים לתאים המוסמכים חיסוניים ולהסיר את שאריות חילוף חומרים באזור ההתחדשות. שיעורי זיהום גבוהים והתחדשות נמוכה הם רקחלק מההשלכות של זלוף דם בלתי מספק נצפו בהנדסת רקמות, המיועדות להיות נמנע על ידי הגדלת כלי הדם של הפיגומים ^6,7.

כמה אסטרטגיות שמטרתם לשפר את מיקוד כלי דם על עצם את תפקיד המפתח של החומר הביולוגי עצמו ומייקרו של הפיגום. יש מאמצי מחקר אינטנסיביים לפיתוח גישות חדשות בהעברת תהליך הריפוי מתיקון להתחדשות, ובכך (מחדש) יצירת רקמה עם המאפיינים הפיסיולוגיים הקרובים ביותר לאחד כדי להיות משוחזר ^8,9. Biomaterials שנחקרו והוערכו בכל הקשור לפוטנציאל ההתחדשות שלהם כלול קולגן, פיברין, chitosan ^ו10,11 אלגינט. ניתן להשתמש בחומרים ביולוגיים אלה ושילוב כעמוד השדרה לבניית פיגומים חדשים תוך שימוש באסטרטגיות שונות כגון decellularization רקמה, הרכבה עצמית, דיגום מהיר וelectrospinning ^12. כדי enhאהה יכולת ההתחדשות של הגוף עצמו, יכולים להיות bioactivated פיגומים. השילוב של צמיחת angiogenic רקומביננטי גורמי ¹³ או גן וקטורי קידוד לגורמים כגון ¹⁴ הראו כדי לשפר את כלי הדם של הפיגום. השימוש בתאי גזע הוכח באופן נרחב כדי להיות אסטרטגיה מבטיחה לשפר את כלי הדם, שבו תאי סטרומה mesenchymal ובתאי האנדותל צברו את מירב תשומת הלב ^15,16. גישות אחרות מנסות לבנות מבנים המכילים רשתות כלי טרומיות לפני ההשתלה ^17. למרות מאמצים אינטנסיביים בעיצוב פיגום ביו ההפעלה שלהם, אין אסטרטגיה השתפרה כלי דם ברמה משמעותית מבחינה קלינית ו, למעט תחליפי עורי בפציעות לשרוף מסיביות, התרגום של חומרים מהונדסים לשגרה הקלינית מתרחש רק בהיסוס ¹⁸ .

אחת הסיבות לכך שכלי דםשל מבני רקמות מלאכותיים עדיין היא בעיה בלתי פתורה, הוא הקושי להעריך את ההצלחה של טכנולוגיות חדשות בin vivo גישות. למרות שניסויים במבחנה עשויים לספק תובנות חשובות של פוטנציאל כלי הדם של פיגומים, מודלים של בעלי החיים מתאימים נדרשים ללמוד פרמטרים מרכזיים כגון ההתאמה הביולוגית של החומר, את הבטיחות ויעילות של הטיפול ו, בעלת חשיבות מיוחדת, כלי הדם של הרקמות לבנות. לכן, כלים אמין לחזות ולכמת רשתות כלי דם בגוף חי הן חיוניים.

במחקר זה אנו מציגים שיטה פשוטה ואמינה המאפשרת הדמיה וכימות של רשת כלי הדם בתוך פיגומי explanted. שיטה זו מבוססת על שקוף רקמה ופילוח דיגיטלי. מאחר ושיטה זו אינה פולשני, היא מאפשרת ניתוחים מולקולריים והיסטולוגית נוספים של חומר היעד.

Protocol

.1 הכנת פיגומים

1. צור דגימות של הפיגומים באמצעות 12 מ"מ אגרופים ביופסיה.
2. להציג את המולקולות ביו או תאים לפיגום, לנקז את הפיגומים על ידי בעדינות לוחץ אותם עם גזה סטרילית. ואז רעננות הפיגומים על ידי הוספת 160 μl של תמיסה המכילה מולקולות או תאים של העניין ביו. בדוק היטב את ההצלחה של bioactivation עם תאים באמצעות מבחני חילוף חומרים כגון מבחני MTT.
3. במידת צורך, לתקן את התרכובות או תאים להיבדק בתוך הפיגום על ידי מתן אותם, למשל בפתרון הפיברין-תרומבין או הידרוג'ל, שוב דרך להחזרת נוזלים כמתואר בשלב 1.2.
   הערה: שלב זה יכול להיות של מועיל כאשר תרכובות או תאים אינן מכאנית לצרף לחומר. אפשר גם לשלוט בדינמיקת שחרורו של התרכובות ..
4. הכן את רשתות titanized, שתוצבנה תחת כל פיגום בכל קבוצת ניסוי ובקרה, על ידי חיתוךחתיכות גרם החוצה בצורה עגולה, כ 14 מ"מ קוטר.
   הערה: רשת titanized עובדת כגבול פיזי הנדרש כדי לתחום הרקמה מחדש מהמיטה הפצע.

2 בעלי חיים

1. לפני היישום של המודל שהוצג, להתייעץ חוקי הגנה על בעלי חיים המתאימים ולקבל אישור מהרשויות המקומיות. בעבודה זו, כל הניסויים בוצעו עם עכברים, על פי מעשה רווחת בעלי החיים הגרמני הנוכחי ואושרו על ידי ממשלת מחוז בוואריה העליונה (Regierung פון Oberbayern).
2. לבחור בזהירות את בעלי החיים ומתח. למרות שהמודל הוקם לעכברים, זה יכול להיות מתורגם לבעלי חיים נפוצים אחרים, כגון חולדות, ארנבות או חזירים.
3. במקרה שאתה עובד עם בעלי חיים פרווה, לגלח את הגב של בעלי החיים לפני ההשתלה של הפיגומים.
   הערה: עבודה זו משתמשת בעכברים של 6 עד 8 שבועות של גיל עם משקל גוף בין 20 גרם ו25 גרם, בגילים שונים אך וbיכולות לשמש גם משקולות ody.

.3 הרדמה

1. תנהל את הפעילות בתנאים סטריליים. על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף הנורמלית של בעל החיים, להשתמש במחצלת התחממות.
2. לפני inhalative הרדמה בעלי החיים מקבלים Buprenorphin במינון של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, תת עורי כל שעה 8.
3. מניחים את החיה בהרדמה inhalative (Isoflurane) או להחיל נהלי תקן מקבילים. לאשר הרדמה או על ידי לוחץ בעדינות את אצבעות רגליו של בעל החיים או באמצעות צביטת עור.
4. כדי למנוע exsiccosis, להזריק 0.5 תת עורי תמיסת מלח פיסיולוגי מ"ל בתחילת המבצע.

.4 כריתת העור

1. מניחים את החיה במצב שכיבה ולסמן את קו האמצע של הגב של העכבר עם עט קבוע קצה קנס (איור 1 א).
2. הגדר את אזור הכריתה. הנח את הפגמים באזור המוצג בFiguמחדש 1C. שים לב שאם הפגמים ממוקמים גם caudally, בעלי החיים נוטים יותר כדי להסיר את התחבושות ופיגומים.
3. צור עגול פגמים דו צדדיים באמצעות אגרוף ביופסיה 10 מ"מ (איור 1). האגרוף צריך להיות בכפייה בזהירות על העור ואסור להשתמש בו כדי לחתוך לחלוטין דרך העור, אלא להתוות את אזור הכריתה (איורים 1 ג & 1E).
4. הרם בעדינות את העור הניכר עם מלקחיים ולחתוך לאורך המעגל המסומן באמצעות מספריים קנס כירורגית (איור 1F). במקרה של דימום, לדחוס בזהירות עם גזה סטרילית. תיאור צעד אחר צעד של הכריתה מוצג באיור 1.
   הערה: הפגם נוצר עם אגרוף קטן יותר מאשר אחד ליצירת הפיגומים, כדי לפצות הגדלה של הפגם בשל גמישות העור.

.5 פיגום השרשה

1. על מנת לפנות מקום לטיטהnized רשת, להאריך את ההפרדה של עור ורקמה בסיסית בגבולות הפצע ל2-4 מ"מ (איור 2 א).
2. הנח את titanized רשת לפגם באופן ישיר על מיטת הפצע ומתחת לקצות הפצע (איורים 2 א & B).
3. מקום פיגומים ישירות על הרשת.
4. תפר את הפיגומים לקצות פצע הסמוכים עם 4 עד 6 קשרים יחידים, והשאיר את הקצוות מעט מעל הפיגום (איור 2 ג).
   הערה: יש להימנע משימוש בתפרים מתכלים.
5. לתפור פצע שקוף הלבשה מעל הפגמים כדי להגן על הפיגום, ובמקביל לאפשר ניטור של אזור הפצע (איור 2 ד).

.6 לאחר ניתוח טיפול

1. שמור עכבר אחד לכלוב כדי למנוע מניפולציה הדדית של ההלבשה ופיגומים.
2. להעריך את המצב הכללי של בעלי החיים על בסיס יומי על ידי פעילות התבוננות מנוע, משקל גוף, סימנים של כאב, סובלנותלהלבשה ואוטומטית הטלת המום. גם לפקח על אזור הפצע לדימום, מקומי וסימנים מערכתיים של זיהום ואת עמדתו של הרוטב.
3. על מנת למזער את הכאב של בעלי החיים, להזריק Buprenorphin יומי במינון של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף או משככי כאבים שווי ערך.
4. אם העכבר מסיר או נזקי ההלבשה הפצע, להחליף או לצרף אותו בהרדמה.

.7 המתת חסד וexplantation של הפיגום

1. בנקודות זמן רצויים, להקריב בעלי החיים על ידי מינון יתר של Pentobarbital (150 מ"ג / קילוגרם).
2. לסמן את האתר של כריתת עור עם סמן קבוע, אשר צריך לכלול את הפיגומים וכמה שיותר את העכבר בחזרה עור כ( איור 3 א) האפשריים.
3. לחתוך את העור לאורך הקווים המסומנים במספריים או סכין מנתחים. לנתק את כל העור, כולל הפיגומים ורשת titanized, מהרקמה הבסיסית דרך הכנה בוטה (Fiתרשים 3 ב).
4. מניחים את רקמת explanted השרועה על צלחת פטרי (איור 3 ג וד)

.8 ויזואליזציה וכימות של רשת כלי הדם

1. שקוף:
   1. הגדרת התקן שקוף, על ידי ההרכבה צלחת פטרי מעל מקור חזק של אור הלבן (100 הנורה סטנדרטית ואט).
   2. תקן את מצלמה דיגיטלית מעל transilluminator להשיג תמונות דיגיטליות.
   3. מניחים את הדגימות במהופך על צלחת פטרי על המכשיר השקוף.
   4. קח את התמונות של הפיגומים מלאים במצב מקרו, כמו גם של אזורים שווים בגודלן של עור רגיל. לאחסן את התמונות בפורמט TIFF לניתוח דיגיטלי נוסף.
   5. שמור את הרקמה לאנליזה ביוכימית או היסטולוגית נוספת.
2. פילוח דיגיטלי וכימות:
   1. הורד והתקן את תוכנת VesSeg-הכלי, אשר ניתן להשיג frEE תשלום ב: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255.
   2. פתח את התמונה עם תוכנת VesSeg-הכלי.
   3. בחר את האזור בתמונה מכוסה על ידי הפיגום לניתוח דיגיטלי (תמונה → בחר).
   4. כדי להגדיל את החדות של כלי להשתמש באפשרות "thresholding Hysteresis" (תמונת מסנן → thresholding Hysteresis → שיפור כלי → Top Hat-שינוי → שיפור כלי חישוב).
   5. להמשיך עם הפילוח של מפת הכלי (גבולות סף → התמונה → מסנן → thresholding Hysteresis שיפור כלי). בחר את הסף הראשון ("כיסוי כלי השיט"), כך שכל פיקסל, וזה אפילו מרחוק כמו כלי-, יופיע תחת כותרת כלי. בחר את הסף השני ("כיסוי רקע"), כך שרק אלה פיקסלים שהם במיוחד יופיעו תחת כותרת כלי כמו ספינה.
   6. בדוק את הצעת הפילוח האוטומטית באופן ידני להוסיף כלי שאינם נתפסו ולחסל את המבנים חיוביים שגויים נפוצים, אשר בדרך כלל הם מבנים כגון שערות או תפרים ארוכים ודקים, כמו כלי.
   7. לחשב את אורכו של כלי השיט והשטח הכולל המכוסה על ידי ספינות (סטטיסטיקת תמונת → התמונה → סטטיסטיקת תמונה בינארי).
      הערה: לחישוב הכלי-האורכים, כלים במפת כלי כתוצאה מכך הם דלילים לקווים ברוחב של פיקסל אחד ^20.
3. לנתח את אזור עור הילידים תחת אותם הפרמטרים כמו הפיגומים, קביעת ערך של 100% לרקמות המקומיות ומתייחס הפיגום לשווי ש. לדוגמא, אם אחוז הפיקסלים הלבנים הוא 60% ברקמה הנורמלית ו30% בפיגום, זה היה מייצג כלי דם 50% מהפיגום. הערה: כיסוי כלי הלבן הצטרף לשטח של ריבוע סביב הפיגום. התאם את מספר consi כיסוי פיקסלים הלבניםדרינג שהשטח של המעגל הוא (R π x ²⁾ הקטן יותר באופן משמעותי מאשר מרובע (4 x R ^2).

תוצאות

פגם עור אמין דו צדדי מלא ניתן ליצור בעכבר (איור 1) שבו העור יכול להיות מוחלף על ידי חומר ביולוגי תחת מחקר (איור 2). כאן, אין סיבוכים עיקריים שנצפו במהלך או לאחר ההליך האופרטיבי, לא סימנים מקרוסקופית של זיהום או תגובת גוף זרה. במקרים נדירים, פיגום הולך לא?...

Discussion

יש צורך בהקמת גישות מוצלחות בשיפור זלוף דם במבני רקמה מהונדסת, הדורש פיתוח שיטות אמינות חדשות ללמוד את תהליכי כלי הדם בתוך החומרים הביולוגיים. שיטות נפוצות להכנת כלי דם פיגום גלוי vivo לשעבר כוללות שימוש במיקרוסקופ, אשר מספק כלי ברזולוציה גבוהה. ברוב המקרים, אם כי,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	Strain code 088	Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	Fibrin-thrombin solution
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10