A Tam Cilt Hata Modeli Biyomateryallerin vaskülarizasyonunu değerlendirin<em&gt; In Vivo</em

Özet

Vaskülarizasyon başarılı doku mühendisliği yaklaşımları anahtarıdır. Bu nedenle, güvenilir teknolojileri doku yapıları vasküler ağların gelişimini değerlendirmek için gereklidir. Burada görselleştirmek ve in vivo damarlanmayı ölçmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem mevcut.

Özet

Yetersiz vaskülarizasyon doku mühendisliği yapılarının klinik başarısını sınırlayan önemli faktörlerden biri olarak kabul edilir. Vaskülarizasyonu geliştirmeye yönelik yeni stratejiler değerlendirmek için güvenilir yöntemler görünür biyo-yapay iskeleler yeni kan damarlarının büyümesini olarak yapmak ve sonuçlarını ölçmek için gereklidir. Yıl geçmiş çift üzerinde, bizim grup transilüminasyon ile kan damarlarının doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan dijital segmentasyon yoluyla nicelikleme imkanı sağlayan tam bir cilt defekti modelini tanıttı. Bu modelde, bir cerrahi farelerin arka tam cilt bozuklukları oluşturur ve test edilen malzeme ile değiştirir. Moleküller veya ilgi duyulan hücrelerin de potansiyel etkisini incelemek için bu tür malzemelerin dahil edilebilir. Kişinin kendi seçtikleri bir gözlem süresinden sonra, malzeme değerlendirme için Eksplante edilir. İkili yaralar inci iç karşılaştırmalar yapma imkanı sağlamakde çalışma için gerekli hayvan sayısını azaltılması gibi bireyler arasında etkilerini en aza indirmek. Diğer yaklaşımlar karşılaştırıldığında, bizim yöntem basit, güvenilir ve maliyet etkin analizi sunar. Biz farklı biyomalzeme ve biyo-aktivasyon yaklaşımların vaskülarizasyonunu sınarken yüksek çözünürlüklü tarama gerçekleştirmek için bir rutin araç olarak bu modeli hayata geçirdik.

Giriş

Son yıllarda, doku mühendisliği, vücudun kendi hücrelerine ¹ ile doku defektleri değiştirmek için yeni bir tedavi seçeneği açtı. Doku rejenerasyonu fizyolojik sürecini desteklemek amacıyla, iskeleleri yara yatağından hücrelerin büyümesine ve kusur ^2,3 geri yükleyebilirsiniz bir senaryo sağlayan bir biyobozunur yapı olarak tasarlanmıştır.

Yetersiz vaskülarizasyon biyosentetik iskeleler ⁴ klinik atılım da tutar, ana engel olarak kabul edilir. Hücre büyümesinin ile, besin ve oksijen artar ve malzeme vaskülarizasyonu için talep gerekli olur. Yetersiz veya gecikmiş damarlanma nedenle doku mühendisliği ürünlerinin ⁵ merkez kangrene neden olabilir. Ek olarak, kan damarları, bağışıklık yetkin hücrelerin sağlamak ve yenileyici alanında metabolik kalıntılarını çıkarın. Yüksek enfeksiyon oranları ve düşük rejenerasyon yalnızcaamaçlayan doku mühendisliği gözlenen yetersiz kan perfüzyon sonuçları, bazı iskeleleri ^6,7 vaskülarizasyonunu artırarak önlenecekse.

Biyomalzemenin kendisi ve iskele mikro anahtar rolü üzerinde damarlanma odak geliştirmeyi hedefliyoruz Çeşitli stratejiler. ^8,9 restore edilecek şekilde (yeniden), rejenerasyon tamir den iyileşme sürecini değişen birine yakın fizyolojik özelliklere sahip bir doku üreten yeni yaklaşımlar geliştirmeye yoğun araştırma çabaları vardır. Kendi rejeneratif potansiyeli açısından incelenmiştir ve değerlendirildi biyomalzemeler kollajen, fibrin, kitosan ve aljinat ^10,11 dahil. Bu biyomalzemeler kullanılan ve doku decellularization, kendini montaj, hızlı prototipleme gibi farklı stratejiler kullanarak yeni iskeleler inşa ve ¹² electrospinning için omurga olarak kombine edilebilir. Gelişmiş içinde içinvücudun kendi kendini yenileme kapasitesi ance, iskeleleri bioactivated edilebilir. Rekombinant anjiyojenik büyümenin birleştirilmesi gibi faktörlere ¹⁴ şifreleyen ¹³ veya gen vektörleri iskele vaskülarizasyonunu artırdığı gösterilmiştir faktörleri. Kök hücrelerin kullanımı yaygın olarak mezenkimal stromal hücreleri ve endotelyal progenitör hücreler, en dikkat ^15,16 kazanmıştır damarlanmasını artırmak için umut verici bir strateji olarak gösterilmiştir. Diğer yaklaşımlar transplantasyon ¹⁷ öncesinde prefabrik damar ağları içeren yapıları inşa etmek için çalışırlar. Yoğun iskele tasarım çabaları ve onların biyo-aktivasyon rağmen, hiçbir strateji masif yanık yaralanmalarında dermal değiştirmeleri hariç, klinik olarak anlamlı düzeyde vaskülarizasyonunu geliştirilmiş ve var, klinik rutin içine bulasıcı malzemelerin çevirisi sadece tereddütle ¹⁸ gerçekleşiyor .

Nedenlerinden biri damarlanmaYapay doku yapıları, hala çözülmemiş bir sorundur in vivo yaklaşımlar yeni teknolojilerin başarısını değerlendirmek için zorluk olduğunu. In vitro deneyler iskelelerinin vaskülarizasyon potansiyelinin ilgili önemli bilgiler sağlayabilir, ancak uygun hayvan modelleri, bu tür malzeme biyolojik uyumluluk, özel bir önem güvenlik ve etkinlik tedavi ve, doku vaskülarizasyonu gibi başlıca parametreleri incelemek için gereklidir inşa. Bu nedenle, güvenilir araçlar görselleştirmek ve damar ağları in vivo esastır ölçmek için.

Bu çalışmada biz Eksplante iskeleleri içindeki damar ağı görselleştirme ve kantifizasyonunu basit ve güvenilir bir yöntem mevcut. Bu yöntem, doku transillüminasyon ve dijital segmentasyon dayanmaktadır. Bu yöntem, non-invazif olduğu için, hedef maddenin daha fazla moleküler ve histolojik analizler sağlar.

Protokol

İskelelerin 1. Hazırlık

1. 12 mm biyopsi yumruklar kullanarak iskelelerinin örnekleri oluşturun.
2. , Darağacında içine biyoaktif molekülleri veya hücreleri tanıtmak nazikçe steril bir gazlı bez ile onları sıkarak iskeleleri tahliye etmek. Daha sonra biyolojik olarak aktif moleküllerin ya da ilgi hücreleri içeren bir çözeltinin 160 ul ilave edilerek rehidrate iskeleleri. Çift-kontrol gibi MTT Tahliller gibi metabolik deneyleri yoluyla hücreleri ile biyoaktivasyonunun başarısını.
3. Eğer gerekli ise aşama 1.2 'de tarif edildiği gibi, rehidrasyon boyunca yine bir fibrin-trombin çözeltisi ya da bir hidrojel içinde, örneğin bunları sağlayarak bileşikler ya da hücreler bir yapı iskeleti içine test edilecek sabitleyin.
   NOT: bileşikleri veya hücrelerin mekanik malzeme eklemek değilsiniz Bu adım yardımcı olabilir. Bir de bileşiklerin serbest dinamiklerini kontrol edebilir ..
4. Kestirme tarafından, her deney ve kontrol grubundaki her iskele altına alınacaktır titanized kafesleri, hazırlayıngr üzerinden yuvarlak şekilli parçalar, çapı yaklaşık 14 mm.
   NOT: titanized örgü yara yatağından rejenere doku sınırlandırmak için gerekli fiziksel bir sınır olarak çalışmaktadır.

2. Hayvanlar

1. Sunulan modelin uygulanmasından önce, ilgili hayvan koruma yasaları danışmak ve yerel yetkililerden izin almak. Bu çalışmada, bütün deneyler mevcut Alman hayvan refahı Kanuna göre, fareler ile yapıldı ve Yukarı Bavyera Bölge Hükümeti (Regierung von Oberbayern) tarafından onaylanmıştır.
2. Dikkatle hayvan ve gerginlik seçin. Modeli fareler için kurulmuş olmasa da bu, sıçanlar, tavşanlar, domuzlar ya da diğer yaygın olarak hayvanlar için tercüme edilebilir.
3. Eğer kürklü hayvanlar ile çalışıyoruz durumda, iskelelerinin implantasyon öncesi hayvanların sırtını traş.
   NOT: Bu çalışma 20 g ve 25 g, ancak farklı yaş ve b arasında bir vücut ağırlığı ile yaşları 6 ila 8 haftalık fareler kullanırody ağırlıkları da kullanılabilir.

3. Anestezi

1. Steril koşullar altında operasyon gerçekleştiirlmesidir. Hayvanın normal vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi amacıyla, bir sıcak tutma mat kullanın.
2. Anestezi Enhalatif önce hayvan / kg vücut ağırlığı 0.05-0.1 mg, deri altına her 8 saat arasında bir dozda Buprenorphin alır.
3. Inhalatif anestezi (Isoflurane) altında hayvan koyun veya eşdeğer standart prosedürleri uygulamak. Yavaşça hayvanın ayak sıkarak veya bir deri tutam yoluyla yada anestezi onaylayın.
4. , Exsiccosis önlemek işlemin başında 0.5 ml fizyolojik tuzlu su çözeltisi deri altından enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir.

Cilt 4. eksizyonu

1. Yüzükoyun pozisyonda hayvan koyun ve ince bir ucu kalıcı kalem (Şekil 1A) ile fare arka orta hat işaretleyin.
2. Eksizyon alanını tanımlayın. Fig gösterilen bölgede kusurları yerleştirin1C yeniden. Kusurları çok kaudalden konursa, hayvanlar sosları ve iskeleleri kaldırmak için daha eğilimli olduğunu unutmayın.
3. 10 mm biyopsi yumruk (Şekil 1B) ile bilateral kusurları yuvarlak oluşturun. Delgi dikkatli bir şekilde deriye karşı zorlanır edilmesi ve deri yoluyla tamamen kesmek için, ancak eksizyon alanı (Şekil 1C ve 1E) tanımlamak için kullanılmamalıdır.
4. Forseps ile yavaşça belirgin cilt kaldırın ve ince cerrahi makas (Şekil 1F) kullanarak işaretli daire boyunca insizyon. Kanama durumunda, dikkatli bir şekilde, steril bir gazlı bez ile sıkıştırır. Eksizyon bir adım-adım açıklaması Şekil 1'de gösterilmiştir.
   NOT: arıza nedeniyle cilt elastikiyeti defekt genişlemesini telafi etmek, iskeleleri oluşturmak için daha küçük bir yumruk ile oluşturulur.

5. İskele İmplantasyon

1. Tita için yer yapmak içinrin, mesh, 2-4 mm (Şekil 2A) için yara sınırlarda deri ve altta uzanan doku ayrılmasını uzanır.
2. Doğrudan yara yatak ve yara kenarlarının (Şekil 2A ve B) altında defekt içine örgü titanized yerleştirin.
3. Yer doğrudan ağ üzeri iskeleleri.
4. Hafif yapı iskeletinin (Şekil 2C) üzerine bir kenarın bırakılmayacağı, 4-6 tek mili ile bitişik yara kenarlarına iskeleleri dikin.
   NOT: biyobozunur sütür kullanmaktan kaçının.
5. Yara alanına (Şekil 2D) izlenmesini izin verirken skafoldun korumak için kusurlar üzerinde şeffaf bir yara pansuman dikin.

6. Ameliyat Sonrası Bakım

1. Soyunma ve iskelelerinin karşılıklı manipülasyon önlemek için kafes başına bir fare tutmak.
2. Gözlemleyerek motor aktivite, vücut ağırlığı, ağrı işaretleri, tolerans ile günlük olarak hayvanın genel durumunu değerlendirirpansuman ve otomatik kurcalanmaları. Ayrıca kanama, lokal ve sistemik enfeksiyon belirtileri ve soyunma pozisyon için yara alanı izlemek.
3. Hayvanın ağrı en aza indirmek için, 0.05-0.1 mg / kg vücut ağırlığı ya da eşdeğer bir analjezik ilaç dozunda günlük Buprenorphin enjekte edilir.
4. Fare yara pansuman kaldırır ya da zarar verirse, değiştirmek veya anestezi altında takın.

İskele 7. Ötanazi ve Eksplantasyonu

1. İstenen zaman noktalarında, pentobarbital (150 mg / kg) aşırı dozda alınması ile hayvanlar kurban.
2. Iskeleler ve olası (Şekil 3A) ve arka fare deri kadar içermelidir kalıcı bir kalem ile deri eksizyon sitesi işaretleyin.
3. Makas veya neşter bir çift ile işaretlenmiş çizgiler boyunca cildi İnsizyon. (Künt hazırlık yoluyla altta yatan doku, Fi iskeleler ve titanized örgü dahil tüm cilt, AyırGüre 3B).
4. Petri kabı uzattı Eksplante doku yerleştirin (Şekil 3C ve D)

Vasküler Network 8. Görselleştirme ve

1. Transillumination:
   1. Beyaz ışık (100 Watt standart ampul) güçlü bir kaynağı üzerinde bir Petri kabı monte edilerek, bir transillüminasyonu aygıtını kurun.
   2. Dijital fotoğraf elde etmek için transilluminator üzerinde bir dijital kamera düzeltmek.
   3. Ters transillüminasyon cihazın üzerine Petri tabağına numuneler.
   4. Normal deri eşit büyüklükte alanları yanı sıra makro modunda tam iskelelerinin fotoğraf çekmek. Daha fazla dijital analiz için TIFF formatında görüntüleri depolamak.
   5. , Başka biyokimyasal ve histolojik analizi için doku kaydedin.
2. Dijital segmentasyon ve miktar:
   1. Fr elde edilebilir VesSeg-Aracı yazılımı indirin ve yükleyin: görevli ee http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
   2. VesSeg-Tool yazılımı ile resmi açın.
   3. Dijital analiz (Seç → Görüntü) için yapı iskelesi kapsadığı görüntünün alanını seçin.
   4. Seçeneğini "Histeri eşikleme" (Hesapla damar artırılması → Top-Hat dönüşüm → Görüntü → Gemi geliştirme filtre → Histeri eşiklendirme) kullanın gemilerin kontrastını artırmak için.
   5. Damar haritası (Görüntü → Gemi geliştirme filtre → Histeri eşikleme → Eşik sınırları) içinde segmentasyonu ile devam edin. Ilk eşik ("Gemi kapsama"), bu yüzden bile uzaktan gemi gibi her piksel, geminin olarak etiketlenmiş olacaktır seçin. Özellikle damar benzeri damarlarda etiketli edilecek böylece sadece bu pikselleri ikinci eşik ("Arka kapsama") seçin.
   6. Olmayan yakalanan gemiler eklemek ve genellikle tüyleri ve dikiş gibi uzun ve ince, damar benzeri yapılar olan ortak yalancı pozitif yapıları ortadan kaldırmak için manuel otomatik segmentasyon teklifi edin.
   7. Gemilerin uzunluğu ve (İkili görüntü istatistiği → Görüntü → Görüntü istatistik) gemiler tarafından kapsanan toplam alanını hesaplayın.
      NOT: damar uzunluklarının hesaplanması için, elde edilen damar harita kaplar ²⁰ bir piksel genişliğinde hatlarına incelmiş.
3. Yerli dokuya% 100 bir değer atanması, iskeleler gibi aynı parametreleri altında yerli deri alanını analiz eder ve o değere iskele ilgilidir. Beyaz piksellerin yüzdesini normal dokuda% 60 ve% 30 iskele ise, örneğin, bu iskeletin% 50 vaskülarizasyonun temsil eder. Not: Beyaz gemiler kapsama iskelesi etrafında bir kare alana atanır. Beyaz piksel kapsama yükünüzün sayısını ayarlayındairenin alanı kare (4 x ^R2) önemli ölçüde daha küçük (π x ^R2) olduğu dering.

Sonuçlar

Güvenilir bir ikili tam bir cilt defekti cilt çalışmada (Şekil 2) altında biyomalzeme ile değiştirilebilir fare (Şekil 1) oluşturulabilir. Burada önemli bir komplikasyon enfeksiyon ya da yabancı cisim reaksiyonu, ne de makroskopik bulgular sırasında ya da cerrahi bir prosedür sonra gözlenir. Bir fare kaldırır Nadir durumlarda, bir iskele kaybolur. Yara kasılma (Şekil 3) hiç görülmedi. Doku transillüminasyonu hem yerli doku ve implante iskeleleri ...

Tartışmalar

Biyomalzeme içindeki damarlanma süreçleri incelemek için yeni, güvenilir yöntemlerin geliştirilmesini talep doku mühendisliği yapıları kan perfüzyon geliştirerek başarılı yaklaşımları kurmak için bir ihtiyaç vardır. Ex vivo olarak görülebilir iskele vaskülarizasyon yapmak için yaygın yöntemler bir yüksek çözünürlüklü bir araç sağlar mikroskobu kullanımını içerir. Çoğu durumda olsa da, bu yöntem küçük doku alanlarında analizlerine sınırlı ve pahalı ve zaman al?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	Strain code 088	Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	Fibrin-thrombin solution
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10