Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Zusammenfassung

Vaskularisierung ist der Schlüssel zur erfolgreichen Ansätze in der Gewebezüchtung. Daher werden sichere Technologien erforderlich, um die Entwicklung von Gefäßnetze im Gewebekonstrukte bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung Vaskularisierung in vivo.

Zusammenfassung

Unzureichende Vaskularisierung wird als einer der wichtigsten Faktoren, die den klinischen Erfolg der Tissue-Engineering-Konstrukten sein. Um neue Strategien, die auf die Verbesserung der Gefäß Ziel zu bewerten, werden zuverlässige Methoden erforderlich, um die in-Wachstum von neuen Blutgefäßen in Bio-künstliche Gerüste sichtbar zu machen und zu quantifizieren, die Ergebnisse. In den letzten paar Jahren hat unsere Gruppe eine vollständige Hautdefekt Modell, das die direkte Darstellung von Blutgefäßen ermöglicht durch Durchleuchtung und bietet die Möglichkeit der Quantifizierung durch digitale Segmentierung eingeführt. In diesem Modell chirurgisch schafft eine volle Hautdefekte in den Rücken von Mäusen und ersetzt sie mit dem geprüften Werkstoff. Moleküle oder Zellen von Interesse können in solche Materialien einverleibt werden, um die möglichen Auswirkungen zu untersuchen. Nach einer Beobachtungszeit von der eigenen Wahl werden die Materialien für die Bewertung explantiert. Bilaterale Wunden bieten die Möglichkeit, interne Vergleiche thbei minimieren Artefakte zwischen den Individuen als auch der Verringerung der Anzahl der Tiere, für die Studie benötigt. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, bietet unsere Methode eine einfache, zuverlässige und kostengünstige Analyse. Wir haben dieses Modell als Routinewerkzeug in hoher Auflösung Screening beim Testen von verschiedenen Gefäß Biomaterialien und Bio-Aktivierung durchführen Ansätze implementiert.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten hat sich das Tissue Engineering eine neue therapeutische Option, um Gewebedefekten mit körpereigenen Zellen ersetzen ¹ eröffnet. Um die physiologischen Prozess der Geweberegeneration zu unterstützen, werden als biologisch abbaubare Gerüst-Struktur, die ein Szenario, in dem Zellen aus dem Wundbett wachsen und Wiederherstellen der Defekt ^2,3 kann bietet gestalten.

Unzureichende Vaskularisierung gilt als das Haupthindernis, das die klinischen Durchbruch der bioartifizielle Gerüste ⁴ zurückhält sein. Mit dem Einwachsen von Zellen, wird die Nachfrage nach Nährstoffen und Sauerstoff zu und Gefäß des Materials wesentlich. Unzureichende oder verzögert Gefäß kann daher zu zentralen Nekrose der Tissue-Engineering-Produkte ⁵ führen. Darüber hinaus bieten die Blutgefäße immunkompetenten Zellen und Entfernen der Stoffwechselreste in dem Regenerationsbereich. Hohe Infektionsraten und geringe Regenerations sind nureinige der Folgen unzureichender Durchblutung im Tissue Engineering beobachtet, die ausgerichtet sind, um durch die Erhöhung der Vaskularisierung der Gerüste ^6,7 abgewendet werden.

Mehrere Strategien, die auf die Verbesserung der Vaskularisierung Fokus auf die Schlüsselrolle von dem Biomaterial selbst und der Mikrostruktur des Gerüst zielen. Es gibt intensive Forschungsbemühungen, um neue Ansätze bei der Verlagerung des Heilungsprozesses von der Reparatur, um die Regeneration und damit (wieder), die ein Gewebe mit den engsten physiologischen Objekte, die dem zu entwickeln, die wiederhergestellt werden ^8,9. Biomaterialien, die ihre Regenerationspotential untersucht und bewertet wurden hinsichtlich enthalten Kollagen, Fibrin, Chitosan und Alginat ^10,11. Diese Biomaterialien verwendet und kombiniert als Backbone für den Bau neuer Gerüste mit unterschiedlichen Strategien, wie Gewebe Dezellularisierung, Selbstorganisation, Rapid Prototyping und das Elektro ¹² werden. Um ENHrung der körpereigenen Regenerationsfähigkeit, kann Gerüste bioaktiviert werden. Der Einbau von rekombinanten angiogene Wachstumsfaktoren ¹³ oder Gen-Vektoren kodieren für solche Faktoren ¹⁴ hat gezeigt, dass die Vaskularisierung des Gerüsts zu verbessern. Die Verwendung von Stammzellen wurde weithin gezeigt worden, um eine vielversprechende Strategie, um Gefäß, bei denen mesenchymale Stromazellen und endothelialen Vorläuferzellen haben die meiste Aufmerksamkeit ^15,16 gewonnen zu verbessern. Andere Ansätze versuchen, Konstrukte, die vorgefertigte Gefäßnetze vor der Transplantation ¹⁷ enthalten zu bauen. Trotz intensiver Bemühungen in Gerüst-Design und ihre Bio-Aktivierung hat keine Strategie Vaskularisierung an einer klinisch signifikanten Niveau verbessert und, mit Ausnahme von Hautersatz in massiven Brandverletzungen, ist die Übersetzung von biotechnisch hergestellten Materialien in der klinischen Routine nur zögerlich statt ¹⁸ .

Einer der Gründe, warum die Vaskularisierungder künstlichen Gewebekonstrukten ist immer noch ein ungelöstes Problem ist die Schwierigkeit, den Erfolg der neuen Technologien in der in-vivo-Ansätze zu bewerten. Obwohl in vitro-Experimenten können wichtige Erkenntnisse der Gefäß Potenzial von Gerüsten bieten, werden geeignete Tiermodelle erforderlich, um wichtige Parameter untersuchen, wie die Biokompatibilität des Materials, die Sicherheit und Wirksamkeit der Behandlung und, besonders wichtig, die Vaskularisierung des Gewebes zu konstruieren. Daher zuverlässige Werkzeuge zur Visualisierung und Quantifizierung von Blutgefäßnetze in vivo sind unerlässlich.

In dieser Studie zeigen wir ein einfaches und zuverlässiges Verfahren, das die Visualisierung und Quantifizierung des Gefäßnetzes in explantierten Gerüsten ermöglicht. Diese Methode basiert auf Gewebe und digitale Durchleuchtung Segmentierung. Da dieses Verfahren nicht-invasiv ist, kann er weitere molekulare und histologische Analysen des Targetmaterials.

Protokoll

1. Herstellung der Gerüste

1. Erzeugen Proben der Gerüste durch die Verwendung von 12 mm-Biopsie Schläge.
2. Bioaktive Moleküle oder Zellen einzuführen in das Gerüst, abtropfen lassen die Gerüste durch sanft drückte sie mit einer sterilen Gaze. Dann rehydrieren die Gerüste durch Zugabe von 160 ul einer Lösung, die biologisch aktiven Moleküle oder Zellen von Interesse enthält. Überprüfen Sie den Erfolg der Bioaktivierung mit Zellen durch Stoffwechseltests, wie MTT-Assays.
3. Falls erforderlich, korrigieren die Verbindungen oder Zellen innerhalb des Gerüsts getestet werden durch die Bereitstellung von ihnen, zum Beispiel in einem Fibrin-Thrombin-Lösung oder einem Hydrogel, wieder durch Rehydratation, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
   Hinweis: Dieser Schritt kann hilfreich sein, wenn Verbindungen oder Zellen nicht mechanisch mit dem Material zu befestigen. Man kann auch kontrollieren die Freisetzung Dynamik der Verbindungen ..
4. Bereiten Sie die titanisierten Maschen, die unter jedem Gerüst in jedem Experiment und der Kontrollgruppe gestellt werden, durch cutting aus rund geformte Stücke, etwa 14 mm im Durchmesser.
   HINWEIS: Die titanisierten mesh arbeitet als eine physikalische Grenze erforderlich ist, um das regenerierte Gewebe vom Wundbett zu begrenzen.

2. Tiere

1. Vor der Umsetzung des vorgestellten Modells finden Sie in den entsprechenden Tierschutzgesetze und die Erlaubnis von den örtlichen Behörden. In dieser Arbeit wurden alle Experimente mit Mäusen durchgeführt, nach der aktuellen deutschen Tierschutzgesetz und von der Regierung von Oberbayern (Regierung von Oberbayern) zugelassen.
2. Sorgfältig auswählen, das Tier und Dehnung. Obwohl das Modell bei Mäusen festgestellt, kann es zu den üblichen Tieren, wie Ratten, Kaninchen und Schweinen übersetzt werden.
3. Falls Sie sich mit Pelztiere arbeiten, rasieren die Rücken der Tiere vor der Implantation der Gerüste.
   HINWEIS: Diese Arbeit setzt Mäuse von 6 bis 8 Wochen mit einem Körpergewicht zwischen 20 g und 25 g, jedoch unterschiedlichen Alters und body Gewichten können ebenfalls verwendet werden.

3. Anästhesie

1. Führen Sie die Operation unter sterilen Bedingungen. Um die normale Körpertemperatur des Tieres zu erhalten, verwenden Sie eine Wärmematte.
2. Vor der Anästhesie inhalativ erhalten die Tiere Buprenorphin in einer Dosis von 0,05-0,1 mg / kg Körpergewicht subkutan alle 8 Stunden.
3. Legen Sie das Tier unter inhalativen Anästhesie (Isofluran) oder gleichwertig gelten Standardverfahren. Anästhesie bestätigen entweder durch leichtes Zusammendrücken des Tieres Zehen oder durch eine Haut Prise.
4. Um zu verhindern Exsikkose injizieren 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung subkutan in den Beginn des Betriebs.

4. Exzision der Haut

1. Legen Sie das Tier in Bauchlage und markieren Sie die Mittellinie des Maus ist wieder mit einer feinen Spitze permanenten Stift (Abbildung 1A).
2. Definieren Sie die Exzision Bereich. Legen Sie die Mängel in der in Figu gezeigten Bereichre 1C. Beachten Sie, dass, wenn die Mängel zu kaudal platziert, sind Tiere anfälliger für die Verbände und die Gerüste entfernen.
3. Erstellen bilaterale Defekte mit einem 10 mm-Biopsie Punch (Abbildung 1B). Der Stempel sollte sorgfältig gegen die Haut gedrückt werden und darf nicht verwendet werden, um komplett durch die Haut geschnitten, aber die Exzision Bereich (1C & 1E) abzugrenzen.
4. Vorsichtig heben Sie die markierten Haut mit einer Pinzette und einzuschneiden entlang der markierten Kreis mit feinen chirurgischen Schere (1F). Im Falle von Blutungen, sorgfältig zu komprimieren mit steriler Gaze. Eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Exzision ist in Abbildung 1 dargestellt.
   HINWEIS: Der Defekt wird mit einem kleineren Punch als die für die Erzeugung der Gerüste durch die Elastizität der Haut erstellt, um die Erweiterung der Mangel auszugleichen.

5. Gerüst Implantation

1. Um Platz zu machen für die TitaNetz erfasst, verlängern die Trennung der Haut und des darunterliegenden Gewebes an der Wundränder für 2-4 mm (Abbildung 2A).
2. Legen Sie die titanisierten direkt auf das Wundbett und unter den Wundrändern (2A & B) in den Defekt Netz.
3. Ort Gerüste direkt über das Netz.
4. Naht der Gerüste zu den benachbarten Wundränder mit 4 bis 6 einzelne Knoten, so dass die Kanten leicht über das Gerüst (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von biologisch abbaubaren Nähten.
5. Naht eine transparente Wundverband über die Mängel, das Schafott zu schützen und ermöglicht die Überwachung der Wundfläche (2D).

6. Postoperative Pflege

1. Halten Sie eine Maus pro Käfig zum gegenseitigen Manipulation des Verbandes und Gerüsten abzuwenden.
2. Bewerten Sie die allgemeinen Zustand des Tieres auf einer täglichen Basis durch die Beobachtung der motorischen Aktivität, Körpergewicht, Anzeichen von Schmerzen, Toleranzin die Umkleide und Auto-Verstümmelung. Überwachen auch den Wundbereich zu Blutungen, lokale und systemische Infektionszeichen und der Position des Aufzugs.
3. Um die Schmerzen des Tieres zu minimieren, injizieren Buprenorphin täglich in einer Dosis von 0,05-0,1 mg / kg Körpergewicht oder äquivalente Analgetika.
4. Wenn die Maus entfernt oder Schäden die Wundauflage, ersetzen oder bringen Sie ihn in Narkose.

7. Euthanasie und Explantation des Gerüsts

1. In gewünschten Zeitpunkten, zu opfern, die Tiere durch Überdosis Pentobarbital (150 mg / kg).
2. Markieren Sie die Stelle der Haut Exzision mit einem Permanent-Marker, die die Gerüste und so viel von der Maus wieder Haut wie möglich (3A) umfassen sollte.
3. Inzision der Haut entlang der markierten Linien mit einer Schere oder einem Skalpell. Trennen Sie die gesamte Haut, einschließlich der Gerüste und der titanisierten Masche, von der darunterliegenden Gewebe durch stumpfe Präparation (Figurieren 3B).
4. Platzieren des explantierten Gewebes auf einer Petrischale gestreckt (3C und D)

8. Visualisierung und Quantifizierung der Gefäßnetz

1. Durchleuchtung:
   1. Richten Sie eine Durchleuchtungseinrichtung, durch Montage einer Petrischale über einer starken Weißlichtquelle (100 Watt Standard-Glühlampe).
   2. Fix eine Digitalkamera über dem Transilluminator, um digitale Bilder zu erhalten.
   3. Legen Sie die Proben nach oben auf die Petrischale über die Durchleuchtungseinrichtung.
   4. Machen Sie Fotos von der kompletten Gerüsten im Makro-Modus sowie der gleich große Bereiche der normalen Haut. Speichern Sie die Bilder in einer TIFF-Format zur weiteren digitalen Analyse.
   5. Speichern Sie das Gewebe für die weitere biochemische oder histologische Analyse.
2. Digitale Segmentierung und Quantifizierung:
   1. Download und Installation des VesSeg-Tool-Software, die fr erhalten werden kann,ee Ausgabe bei: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
   2. Öffnen Sie das Bild mit dem VesSeg-Tool.
   3. Wählen Sie den Bereich der durch das Gerüst für die digitale Analyse (Bild → Select) abgedeckt Bild.
   4. Um den Kontrast der Schiffe zu erhöhen verwenden Sie die Option "Hysterese Schwellen" (Bild → Fahrzeug Verstärkungsfilter → Hysterese Schwellen → Top-Hat-Transformation → Berechnen Schiff Enhancement).
   5. Fahren Sie mit der Segmentierung des Schiffes Karte (Bild → Fahrzeug Verstärkungsfilter → Hysterese Schwellen → Schwellwert Grenzen). Wählen Sie die erste Schwelle ("Vessel coverage"), so dass jedes Pixel, was auch nur entfernt gefäßartigen, wird als Schiff bezeichnet werden. Wählen Sie die zweite Schwelle ("Hintergrunddeckung"), so dass nur die Pixel, die besonders gefäßartigen wird als Gefäße beschriftet werden sollen.
   6. Überprüfen Sie die automatische Segmentierung Vorschlag manuell auf nicht-eingefangen Gefäße hinzuzufügen und falsch-positive gemeinsame Strukturen, die in der Regel lange und dünne, gefäßartige Strukturen wie Haare oder Fäden zu beseitigen.
   7. Berechnen Sie die Länge der Schiffe und des Gesamtbereichs von Schiffen bedeckt (Bild → Bilddaten → Binary Bildstatistik).
      HINWEIS: Für die Berechnung der Behälterlängen sind Schiffe im resultierenden Behälter Karte, um Linien mit einer Breite von einem Pixel ²⁰ ausgedünnt.
3. Analysieren Sie den nativen Hautbereich unter den gleichen Parametern wie die Gerüste, die Zuweisung einen Wert von 100% auf die native Gewebe und betreffen das Gerüst auf diesen Wert. Zum Beispiel, wenn der Prozentsatz der weißen Pixel beträgt 60% im Normalgewebe und 30% in dem Gerüst, wäre eine 50% Vaskularisierung des Gerüsts darstellen. Anmerkung: Der weiße Gefäße Abdeckung ist auf den Bereich ein Quadrat um das Gerüst zugeordnet. Stellen Sie die Anzahl der weißen Pixel Abdeckung Considering, dass die Fläche des Kreises ist deutlich kleiner (π x R ²⁾ als das Quadrat (4 x R ^2).

Ergebnisse

Eine zuverlässige bilateralen Vollhautdefekt in der Maus (Abbildung 1), wo die Haut durch ein Biomaterial untersucht (Abbildung 2) ersetzt werden erstellt. Hier werden keine größeren Komplikationen während oder nach dem operativen Eingriff, weder makroskopische Anzeichen einer Infektion oder Fremdkörperreaktion beobachtet. In seltenen Fällen wird ein Gerüst verloren, wenn eine Maus entfernt es. Wundkontraktion wurde nicht beobachtet (Abbildung 3). Gewebedurch erl...

Diskussion

Es besteht die Notwendigkeit, erfolgreiche Ansätze bei der Verbesserung der Durchblutung im Gewebe Konstrukte, die die Entwicklung von neuen zuverlässigen Methoden verlangt, um die Gefäßprozesse in den Biomaterialien zu untersuchen etablieren. Übliche Verfahren zur Herstellung von Gerüst Vaskularisierung ex vivo sichtbar umfassen die Verwendung von Mikroskopie, die eine hochauflösende Werkzeug bietet. In den meisten Fällen jedoch ist dieses Verfahren beschränkt auf die Analyse von kleinen Gewebebereich...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	Strain code 088	Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	Fibrin-thrombin solution
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10