Une peau pleine de défauts modèle pour évaluer la vascularisation des biomatériaux<em&gt; In Vivo</em

Résumé

La vascularisation est la clé pour les approches en ingénierie tissulaire succès. Par conséquent, des technologies fiables sont nécessaires pour évaluer le développement des réseaux vasculaires dans les tissus-constructions. Nous présentons ici une méthode simple et efficace de visualiser et de quantifier la vascularisation in vivo.

Résumé

Vascularisation insuffisante est considéré comme l'un des facteurs principaux limitant le succès clinique de constructions du génie tissulaire. Afin d'évaluer de nouvelles stratégies visant à améliorer la vascularisation, méthodes fiables sont nécessaires pour rendre le dans la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins dans les échafaudages de bio-artificiel visibles et quantifier les résultats. Au cours des deux dernières années, notre groupe a mis en place un modèle de défaut de peau complet qui permet la visualisation directe des vaisseaux sanguins par transillumination et offre la possibilité de quantification par la segmentation numérique. Dans ce modèle, on crée chirurgicalement défauts complets de la peau dans le dos de souris et les remplace par du matériau testé. Molécules ou cellules d'intérêt peuvent aussi être incorporés dans ces matières à étudier leur effet potentiel. Après un temps d'observation de son choix un, les matériaux sont explantées pour l'évaluation. Blessures bilatéraux prévoient la possibilité de faire des comparaisons internes eà minimiser les artefacts entre les individus ainsi que de diminuer le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. En comparaison à d'autres approches, notre méthode offre une analyse simple, fiable et rentable. Nous avons mis en place ce modèle comme un outil de routine pour effectuer le criblage à haute résolution lors du test de la vascularisation de différents biomatériaux et les approches bio-activation.

Introduction

Dans les dernières décennies, l'ingénierie tissulaire a ouvert une nouvelle option thérapeutique pour remplacer défauts des tissus avec les propres cellules de l'organisme ^1. Afin de soutenir le processus physiologique de la régénération des tissus, des échafaudages sont conçus comme une structure biodégradable, qui fournit un scénario où les cellules du lit de la plaie peuvent se développer et de rétablir le défaut ^2,3.

Vascularisation insuffisante est considéré comme le principal obstacle qui freine la percée clinique d'échafaudages bioartificiel ^4. Avec la croissance de cellules, la demande de nutriments et d'oxygène augmente et la vascularisation de la matière devient indispensable. Vascularisation insuffisante ou tardive peut donc conduire à une nécrose centrale de produits de l'ingénierie tissulaire ^5. De plus, les vaisseaux sanguins fournissent des cellules immunocompétentes et enlever les résidus métaboliques dans la zone de régénération. Des taux d'infection élevés et une faible régénération ne sontquelques-unes des conséquences de l'insuffisance perfusion sanguine observés dans l'ingénierie tissulaire, qui visent à être évités par l'augmentation de la vascularisation des échafaudages ^6,7.

Plusieurs stratégies visant à améliorer la vascularisation accent sur le rôle clé du biomatériau lui-même et la microstructure de l'échafaud. Il ya des efforts intensifs de recherche pour développer de nouvelles approches en déplaçant le processus de guérison de la réparation de la régénération, de ce fait (re) produire un tissu avec des propriétés physiologiques les plus proches de celui qui doit être restaurées ^8,9. Biomatériaux qui ont été étudiés et évalués en ce qui concerne leur potentiel de régénération inclus collagène, fibrine, le chitosane et l'alginate ^10,11. Ces biomatériaux peuvent être utilisés et combinés comme une épine dorsale pour la construction de nouveaux échafaudages en utilisant différentes stratégies telles que décellularisation de tissus, auto-assemblage, prototypage rapide et électrofilature ^12. Pour ENHment propre capacité de régénération de l'organisme, les échafaudages peuvent être bioactivé. L'incorporation de croissance angiogénique recombinant facteurs ¹³ ou génétiques des vecteurs codant pour des facteurs tels ¹⁴ a montré pour améliorer la vascularisation de l'échafaud. L'utilisation de cellules souches a été largement démontré être une stratégie prometteuse pour améliorer la vascularisation, où les cellules stromales et les cellules mésenchymateuses progénitrices endothéliales ont obtenu la plus grande attention ^15,16. D'autres approches tentent de construire des constructions qui contiennent des réseaux de vaisseaux préfabriqués avant la transplantation ^17. Malgré des efforts intensifs dans la conception de l'échafaudage et de leur bio-activation, pas de stratégie a amélioré la vascularisation au niveau cliniquement significative et, à l'exception des remplacements dermiques dans les brûlures massives, la traduction des documents issus du génie génétique dans la routine clinique n'est déroule hésitant ¹⁸ .

L'une des raisons pour lesquelles la vascularisationde constructions de tissu artificiel est encore un problème non résolu, est la difficulté d'évaluer le succès des nouvelles technologies dans les approches in vivo. Bien que des expériences in vitro peuvent fournir des indications importantes sur le potentiel de la vascularisation des échafaudages, des modèles animaux appropriés sont nécessaires pour étudier les paramètres clés tels que la biocompatibilité du matériau, la sécurité et l'efficacité du traitement et, d'une importance particulière, la vascularisation du tissu construire. Par conséquent, des outils fiables de visualiser et de quantifier les réseaux de vaisseaux sanguins in vivo sont essentiels.

Dans cette étude, nous présentons une méthode simple et fiable qui permet la visualisation et la quantification du réseau vasculaire à l'intérieur des échafaudages explantées. Cette méthode est basée sur la transillumination de tissus et de segmentation numérique. Etant donné que cette méthode est non invasif, il permet d'autres analyses moléculaires et histologiques de la matière cible.

Protocole

1 Préparation des échafaudages

1. Générer des échantillons des échafaudages en utilisant 12 mm de poinçons de biopsie.
2. Pour introduire des molécules bioactives ou des cellules dans l'échafaud, égoutter les échafaudages en les pressant doucement avec une gaze stérile. Puis réhydrater les échafaudages en ajoutant 160 ul d'une solution contenant des molécules ou des cellules d'intérêt bioactifs. Double-vérifier le succès de bioactivation avec des cellules par des tests métaboliques tels que le MTT dosages.
3. Si nécessaire, fixer les composés ou les cellules à tester à l'intérieur de l'échafaudage, en les délivrant, par exemple dans une solution de fibrine-thrombine ou un hydrogel, de nouveau à travers la réhydratation de la manière décrite dans l'étape 1.2.
   REMARQUE: Cette étape peut être utile lorsque des composés ou des cellules ne s'attachent pas mécaniquement à la matière. On peut aussi contrôler la dynamique de libération des composés ..
4. Préparer les mailles titanisés, qui seront placés sous chaque échafaudage dans chaque groupe d'expérience et de contrôle, par cutting des morceaux en forme de tour, à environ 14 mm de diamètre.
   REMARQUE: La maille titanisé fonctionne comme une frontière physique requis pour délimiter le tissu régénéré à partir du lit de la plaie.

2. Animaux

1. Avant la mise en œuvre du modèle présenté, consulter les lois de protection des animaux correspondants et obtenir la permission des autorités locales. Dans ce travail, toutes les expériences ont été effectuées avec des souris, selon l'actuelle loi sur la protection des animaux allemand et approuvés par le gouvernement du district de Haute-Bavière (Oberbayern Regierung von).
2. Choisissez avec soin l'animal et de la souche. Bien que le modèle de souris a été établi, il peut être converti en d'autres animaux courants, tels que des rats, des lapins ou des cochons.
3. Dans le cas où vous travaillez avec des animaux à fourrure, de se raser le dos des animaux avant l'implantation des échafaudages.
   NOTE: Ce travail utilise des souris de 6 à 8 semaines d'âge avec un poids corporel compris entre 20 g et 25 g, mais différents âges et body poids peuvent également être utilisés.

3. anesthésie

1. Mener l'opération dans des conditions stériles. Afin de maintenir la température normale du corps de l'animal, utilisant une surface de chauffage.
2. Avant l'anesthésie par inhalation les animaux reçoivent buprénorphine à une dose de 0,05-0,1 mg / kg de poids corporel, voie sous-cutanée toutes les 8 heures.
3. Placez l'animal sous anesthésie par inhalation (isoflurane) ou appliquer des procédures standard équivalent. Confirmez l'anesthésie soit en pressant doucement les orteils de l'animal ou par une pincée de peau.
4. Pour éviter exsiccoses, injecter 0,5 ml de solution saline physiologique par voie sous cutanée, au début de l'opération.

4. excision de la peau

1. Placez l'animal dans une position couchée et marquer la ligne médiane du dos de la souris avec un stylo à pointe fine permanent (figure 1A).
2. Définir la zone d'excision. Placez les défauts dans la zone indiquée dans Figure 1C. Notez que si les défauts sont placés trop caudale, les animaux sont plus enclins à enlever les pansements et les échafaudages.
3. Créer ronde défauts bilatéraux en utilisant un 10 mm biopsie poinçon (figure 1B). Le poinçon doit être soigneusement forcé contre la peau et ne doit pas être utilisé pour couper complètement à travers la peau, mais pour délimiter la zone d'excision (Figures 1C et 1E).
4. Soulevez délicatement la peau marquée avec une pince et inciser le long du cercle marqué avec des ciseaux chirurgicaux fines (figure 1F). En cas de saignement, comprimer soigneusement avec de la gaze stérile. Une description étape par étape de l'excision est représenté sur la figure 1.
   NOTE: Le défaut est créé avec un poinçon plus petit que celui de la génération des échafaudages, pour compenser l'élargissement du défaut dû à l'élasticité de la peau.

5. Échafaudages Implantation

1. Pour faire de la place pour le titanisé maille, de prolonger la séparation de la peau et du tissu sous-jacent aux frontières plaies pour 2-4 mm (figure 2A).
2. Placez le titanisés engrener dans le défaut directement sur ​​le lit de la plaie et dans les bords de la plaie (Figures 2A et B).
3. Lieu échafaudages directement sur le maillage.
4. Suturer les échafaudages sur les bords de la plaie adjacentes de 4 à 6 nœuds simples, laissant les bords un peu plus de l'échafaud (figure 2C).
   REMARQUE: Évitez l'utilisation de sutures biodégradables.
5. Suturer une plaie pansement transparent au-dessus des défauts de protéger l'échafaudage, tout en permettant la surveillance de la zone de la plaie (Figure 2D).

6 Soins postopératoires

1. Gardez une souris par cage pour éviter la manipulation mutuelle de la vinaigrette et les échafaudages.
2. Évaluer l'état général de l'animal sur une base quotidienne en observant l'activité motrice, le poids corporel, des signes de douleur, de la toléranceà la vinaigrette et l'auto-mutilation. Surveiller également la surface de la plaie pour un saignement, des signes locaux et systémiques de l'infection et de la position du pansement.
3. Afin de minimiser la douleur de l'animal, l'injection buprénorphine par jour à une dose de 0,05 à 0,1 mg de / kg de poids corporel ou d'un médicament analgésique équivalente.
4. Si la souris enlève ou endommage le pansement, remplacer ou remettre en place sous anesthésie.

7. euthanasie et explantation de l'échafaud

1. A des moments souhaités, sacrifier les animaux par des surdoses de pentobarbital (150 mg / kg).
2. Marquez le site de l'excision de la peau avec un marqueur permanent, qui devrait inclure les échafaudages et autant de la souris peau du dos que possible (figure 3A).
3. Inciser la peau le long des lignes marquées avec une paire de ciseaux ou un scalpel. Détachez l'ensemble de la peau, y compris les échafaudages et le maillage titanisé, à partir du tissu sous-jacent à travers la préparation émoussé (Figure 3B).
4. Placez le tissu explantée étendu sur une boîte de Pétri (figure 3C et D)

8 Visualisation et quantification du réseau vasculaire

1. Transillumination:
   1. Mettre en place un dispositif de radiographie, par le montage d'une boîte de Pétri dessus d'une forte source de lumière blanche (100 Watt ampoule standard).
   2. Correction d'un appareil photo numérique au-dessus du diaphanoscope pour obtenir des images numériques.
   3. Placer les échantillons à l'envers sur la boîte de Pétri sur le dispositif de radiographie.
   4. Prenez des photos des échafaudages complets en mode macro, ainsi que des zones de taille égale de la peau normale. Stocker les images dans un format TIFF pour une analyse plus approfondie numérique.
   5. Enregistrez le tissu pour plus d'analyse biochimique ou histologique.
2. Segmentation numérique et la quantification:
   1. Télécharger et installer le logiciel VesSeg-outil, qui peut être obtenu free frais au: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
   2. Ouvrez l'image avec le logiciel VesSeg-Tool.
   3. Sélectionnez la zone de l'image couverte par l'échafaud pour l'analyse numérique (Image → Select).
   4. Pour augmenter le contraste des vaisseaux utiliser l'option "seuil d'hystérésis" (image → amélioration de navire filtre → Hystérésis seuil → Top-Hat transformation → amélioration de navire Calculer).
   5. Procéder à la segmentation de la carte de la cuve (de frontières image → amélioration de navire filtre → → hystérésis seuil de seuil). Sélectionnez le premier seuil («couverture de navire»), de sorte que chaque pixel, ce qui est encore à distance type vaisseau, sera étiqueté comme navire. Sélectionnez le second seuil ("couverture de base"), de sorte que seuls les pixels qui sont particulièrement type vaisseau sera étiqueté comme navires.
   6. Vérifiez la proposition de segmentation automatique manuellement pour ajouter des navires non capturées et d'éliminer les structures de faux positifs communs, qui sont généralement des structures de navires comme de longues et minces tels que des poils ou des sutures.
   7. Calculer la longueur des navires et la superficie totale couverte par les navires (statistiques image → Image → statistiques d'images binaires).
      REMARQUE: Pour le calcul des navires longueurs, les navires de la carte de navire résultant sont éclaircis à des lignes d'une largeur d'un pixel ^20.
3. Analyser la région natale de la peau sous les mêmes paramètres que les échafaudages, l'attribution d'une valeur de 100% pour le tissu natif et rapporter l'échafaud à cette valeur. Par exemple, si le pourcentage de pixels blancs est de 60% dans le tissu normal et 30% dans l'échafaudage, cela représenterait une vascularisation de 50% de l'échafaud. Remarque: Le vaisseaux couverture des cheveux blancs est affectée à la surface d'un carré autour de l'échafaud. Réglez le nombre de pixels blancs couverture considering que la surface du cercle est sensiblement plus petit (π x R ²⁾ que le carré (4 x R ^2).

Résultats

A défaut fiable pleine peau bilatérale peut être créé chez la souris (Figure 1) où la peau peut être remplacé par un biomatériau à l'étude (Figure 2). Ici, pas de complications majeures sont observées pendant ou après l'intervention chirurgicale, ni signes macroscopiques d'infection ou de réaction à corps étranger. Dans de rares cas, un échafaudage se perd lorsque la souris le supprime. La contraction des plaies n'a jamais été observée (figure...

Discussion

Il est nécessaire d'établir des méthodes efficaces dans l'amélioration de la perfusion sanguine dans les constructions de l'ingénierie tissulaire, qui exige la mise au point de nouvelles méthodes fiables pour étudier les processus de vascularisation dans les biomatériaux. Les méthodes courantes pour faire échafaud vascularisation ex vivo visible comprennent l'utilisation de la microscopie, qui fournit un outil de haute résolution. Dans la plupart des cas, cependant, cette méthode est...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	Strain code 088	Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	Fibrin-thrombin solution
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10