Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales<em&gt; En Vivo</em

Resumen

La vascularización es clave para enfoques en la ingeniería de tejidos éxito. Por lo tanto, se requieren tecnologías fiables para evaluar el desarrollo de las redes vasculares en los tejidos-construcciones. Aquí presentamos un método simple y rentable para visualizar y cuantificar la vascularización in vivo.

Resumen

Vascularización insuficiente se considera que es uno de los principales factores que limitan el éxito clínico de construcciones de ingeniería tisular. Con el fin de evaluar nuevas estrategias encaminadas a mejorar la vascularización, se requieren métodos confiables para hacer la en-el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en los andamios visibles bioartificiales y cuantificar los resultados. En el último par de años, nuestro grupo ha introducido un modelo de defecto de la piel completa que permite la visualización directa de los vasos sanguíneos mediante transiluminación y ofrece la posibilidad de cuantificación a través de la segmentación digital. En este modelo, se crea quirúrgicamente defectos completos de la piel en la parte posterior de los ratones y las sustituye por el material ensayado. Moléculas o células de interés también se pueden incorporar en tales materiales para estudiar su efecto potencial. Después de un tiempo de observación de la propia elección de uno, los materiales se explantaron para su evaluación. Heridas bilaterales ofrecen la posibilidad de hacer comparaciones internas ªa minimizar los artefactos entre los individuos, así como de reducir el número de animales necesarios para el estudio. En comparación con otros enfoques, nuestro método ofrece un análisis simple, fiable y rentable. Hemos aplicado este modelo como una herramienta rutinaria para llevar a cabo el cribado de alta resolución cuando se prueba la vascularización de diferentes biomateriales y enfoques bio-activación.

Introducción

En las últimas décadas, la ingeniería de tejidos ha abierto una nueva opción terapéutica para reemplazar defectos de tejidos con células del propio cuerpo ^1. Con el fin de apoyar el proceso fisiológico de la regeneración de tejidos, andamios están diseñados como una estructura biodegradable, que proporciona un escenario en el que las células de la lecho de la herida pueden crecer y restaurar el defecto de ^2,3.

Vascularización insuficiente se considera que es el principal obstáculo, que retiene el avance clínico de andamios bioartificiales ^4. Con el crecimiento hacia el interior de las células, la demanda de nutrientes y oxígeno aumenta y vascularización del material se convierte en esencial. Por lo tanto, la vascularización insuficiente o tardía puede llevar a necrosis central de productos de ingeniería tisular ^5. Además, los vasos sanguíneos proporcionan células inmunocompetentes y eliminar los residuos metabólicos en la zona de regeneración. Las tasas de infección altas y bajas de regeneración son sóloalgunas de las consecuencias de la perfusión insuficiente de sangre observados en la ingeniería de tejidos, que tienen por objeto que se estén produciendo por el aumento de la vascularización de los andamios de ^6,7.

Varias estrategias encaminadas a mejorar la vascularización foco en el papel clave de la propia biomaterial y la microestructura del andamio. Hay esfuerzos de investigación intensiva para desarrollar nuevos enfoques en el cambio del proceso de curación de la reparación a la regeneración, por lo tanto (re) generar un tejido con las propiedades fisiológicas más cercanas a la de ser restaurados ^8,9. Biomateriales que fueron estudiados y evaluados en cuanto a su potencial de regeneración incluyen colágeno, fibrina, quitosano y alginato ^10,11. Estos biomateriales se pueden utilizar y combinar como columna vertebral para la construcción de nuevos andamios utilizando diferentes estrategias como descelularización tejido, auto-ensamblaje, prototipado rápido y electrospinning ^12. Con el fin de ENHAnce propia capacidad de regeneración del cuerpo, los andamios se pueden bioactivados. La incorporación de factores de crecimiento angiogénico recombinante o gen ¹³ vectores que codifican para tales factores ¹⁴ ha demostrado mejorar la vascularización del andamio. El uso de células madre se ha demostrado ampliamente ser una estrategia prometedora para mejorar la vascularización, donde las células estromales mesenquimales y células progenitoras endoteliales han ganado la mayor atención ^15,16. Otros enfoques intentan construir construcciones que contienen redes de vasos prefabricados antes del trasplante ^17. A pesar de los intensos esfuerzos en el diseño de andamio y su bio-activación, ninguna estrategia ha mejorado la vascularización en un nivel clínicamente significativo y, con la excepción de los reemplazos dérmicos en las lesiones por quemaduras masivas, la traducción de los materiales de bioingeniería en la rutina clínica sólo está teniendo lugar vacilante ¹⁸ .

Una de las razones por las que la vascularizaciónde construcciones de tejidos artificiales sigue siendo un problema sin resolver, es la dificultad para evaluar el éxito de las nuevas tecnologías en los enfoques in vivo. Aunque los experimentos in vitro pueden proporcionar importantes conocimientos sobre el potencial de la vascularización de los andamios, se requieren modelos animales apropiados para estudiar los parámetros clave tales como la biocompatibilidad del material, la seguridad y eficacia del tratamiento y, de particular importancia, la vascularización del tejido construir. Por lo tanto, herramientas fiables para visualizar y cuantificar redes de vasos sanguíneos in vivo son esenciales.

En este estudio se presenta un método simple y fiable que permite la visualización y cuantificación de la red vascular en el interior andamios explantados. Este método se basa en la transiluminación del tejido y la segmentación digital. Dado que este método no es invasivo, permite nuevos análisis moleculares e histológicas del material objetivo.

Protocolo

1 Preparación de andamios

1. Generar muestras de los andamios utilizando 12 mm punzones biopsia.
2. Para introducir moléculas bioactivas o células en el andamiaje, la fuga de los andamios, apretando suavemente con una gasa estéril. Entonces rehidratar los andamios mediante la adición de 160 l de una solución que contiene las moléculas bioactivas o células de interés. Compruebe el éxito de bioactivación con las células a través de ensayos metabólicos como MTT ensayos.
3. Si es necesario, fijar los compuestos o células a ensayar en el interior del andamio mediante la entrega de ellos, por ejemplo en una solución de fibrina-trombina o un hidrogel, de nuevo a través de la rehidratación como se describe en el paso 1.2.
   NOTA: Este paso puede ser de utilidad cuando los compuestos o células no se adhieren mecánicamente al material. También se puede controlar la dinámica de liberación de los compuestos ..
4. Preparar las mallas titanizado, que serán colocados en cada andamio en cada grupo experimental y el control, por cutting trozos de forma redonda, de aproximadamente 14 mm de diámetro.
   NOTA: La malla titanizado funciona como una frontera física necesaria para delimitar el tejido regenerado del lecho de la herida.

2. Animales

1. Antes de la implementación del modelo presentado, consulte las leyes de protección animal correspondientes y obtener el permiso de las autoridades locales. En este trabajo, todos los experimentos se realizaron con ratones, de acuerdo con la actual ley de bienestar animal alemán y aprobados por el Gobierno del Distrito de la Alta Baviera (Regierung von Oberbayern).
2. Elija cuidadosamente el animal y la tensión. Aunque el modelo se estableció para los ratones, que se puede traducir a otros animales comunes, tales como ratas, conejos o cerdos.
3. Si estás trabajando con animales de pelo, afeitarse la parte posterior de los animales antes de la implantación de los andamios.
   NOTA: Este trabajo utiliza ratones de 6 a 8 semanas de edad con un peso corporal entre 20 gy 25 g, sin embargo diferentes edades y bpesos ody también se pueden utilizar.

3. Anestesia

1. Llevar a cabo la operación en condiciones estériles. Con el fin de mantener la temperatura normal del cuerpo del animal, utilizar una estera de calentamiento.
2. Antes de la inhalación de anestesia a los animales reciben buprenorfina a una dosis de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por vía subcutánea cada 8 horas.
3. Colocar el animal bajo anestesia por inhalación (isoflurano) o aplicar procedimientos estándar equivalentes. Confirme la anestesia, ya sea apretando suavemente los dedos del pie del animal oa través de un pliegue cutáneo.
4. Para evitar exsiccosis, inyectar 0,5 ml por vía subcutánea solución salina fisiológica al comienzo de la operación.

4. La escisión de la piel

1. Colocar el animal en posición prona y marcar la línea media de la espalda del ratón con un bolígrafo de punta fina permanente (Figura 1A).
2. Defina el área de la escisión. Coloca los defectos en el área mostrada en Figure 1C. Tenga en cuenta que si los defectos se colocan demasiado caudal, los animales son más propensos a retirar los apósitos y los andamios.
3. Crear ronda defectos bilaterales usando un punzón de biopsia de 10 mm (Figura 1B). El punzón debe ser cuidadosamente forzado contra la piel y no debe ser utilizado para cortar completamente a través de la piel, pero para delinear el área de la escisión (Figuras 1C y 1E).
4. Levantar suavemente la piel marcada con una pinza y una incisión a lo largo del círculo marcado con unas tijeras quirúrgicas finas (Figura 1F). En caso de hemorragia, comprimir cuidadosamente con una gasa estéril. Una descripción paso a paso de la escisión se muestra en la Figura 1.
   NOTA: El defecto se crea con un punzón más pequeño que el de la generación de los andamios, para compensar la ampliación del defecto debido a la elasticidad de la piel.

5. Andamios Implantación

1. Con el fin de hacer espacio para la titazada malla, extender la separación de la piel y el tejido subyacente en las fronteras de la herida de 2-4 mm (Figura 2A).
2. Coloque el titanizado de malla en el defecto directamente en el lecho de la herida y bajo los bordes de la herida (Figuras 2A y B).
3. Lugar andamios directamente sobre la malla.
4. Suturar los andamios a los bordes de la herida adyacentes con 4 a 6 nudos individuales, dejando los bordes ligeramente en el andamio (Figura 2C).
   NOTA: Evite el uso de suturas biodegradables.
5. Suturar una herida apósito transparente por encima de los defectos para proteger el andamio al tiempo que permite el seguimiento de la zona de la herida (Figura 2D).

6. Cuidado Postoperatorio

1. Mantenga un ratón por jaula para evitar la manipulación mutua del vestidor y andamios.
2. Evaluar el estado general del animal sobre una base diaria por la observación de la actividad del motor, el peso corporal, signos de dolor, la toleranciaal vestidor y auto-mutilación. También supervisar el área de la herida para el sangrado, local y signos sistémicos de infección y la posición del apósito.
3. Con el fin de minimizar el dolor del animal, inyectar buprenorfina diaria en una dosis de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal o la medicación analgésica equivalente.
4. Si el ratón elimina o daña el vendaje de la herida, reemplazar o volver a instalarlo bajo anestesia.

7. Eutanasia y explantación del andamio

1. En los puntos de tiempo deseados, sacrificar los animales por sobredosis de pentobarbital (150 mg / kg).
2. Marque el sitio de escisión de la piel con un marcador permanente, que debe incluir los andamios y la mayor cantidad de ratón de nuevo la piel como sea posible (Figura 3A).
3. Incisión en la piel a lo largo de las líneas marcadas con un par de tijeras o un bisturí. Separar la totalidad de la piel, incluyendo los andamios y la malla titanizado, desde el tejido subyacente a través de la preparación romo (Figura 3B).
4. Coloque el tejido explantado tendido en una placa de Petri (Figura 3C y D)

8. visualización y cuantificación de la Red Vascular

1. Transiluminación:
   1. Configurar un dispositivo de transiluminación, mediante el montaje de una placa de Petri encima de una fuente intensa de luz blanca (100 vatios bombilla estándar).
   2. Fijar una cámara digital por encima del transiluminador para obtener imágenes digitales.
   3. Colocar las muestras en posición invertida sobre la placa de Petri sobre el dispositivo de transiluminación.
   4. Tome fotos de los andamios completos en modo macro, así como de las áreas de igual tamaño de la piel normal. Guarde las imágenes en un formato TIFF para su posterior análisis digital.
   5. Guarde el tejido para su posterior análisis bioquímicos o histológicos.
2. Segmentación digital y cuantificación:
   1. Descargue e instale el software VesSeg-Herramienta, que se puede obtener free de forma gratuita en: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
   2. Abra la imagen con el software VesSeg-Herramienta.
   3. Seleccione el área de la imagen cubierta por el andamio para el análisis digital (imagen → Select).
   4. Para aumentar el contraste de los vasos utilizar la opción "umbral de histéresis" (Imagen → mejora Vessel filtro → Histéresis de umbral → Top-Hat transformación → mejora buque Calcular).
   5. Proceda con la segmentación del mapa buque (las fronteras de imagen → mejora Vessel filtro → → umbral Histéresis de umbral). Seleccione el primer umbral ("cobertura de buques"), por lo que cada píxel, que es ni remotamente buque similar, será etiquetado como recipiente. Seleccione el segundo umbral ("cobertura de fondo"), por lo que sólo aquellos píxeles que son particularmente buque similar será etiquetado como vasos.
   6. Compruebe la propuesta automática segmentación manualmente añadir buques no capturados y eliminar estructuras falsos positivos comunes, que generalmente son largas y delgadas estructuras, como los vasos tales como pelos o suturas.
   7. Calcular la longitud de los vasos y el área total cubierta por los buques (estadísticas de imagen → Imagen → Estadísticas imagen binaria).
      NOTA: Para el cálculo de las longitudes de los vasos, vasos en el mapa buque resultante se adelgazan a las líneas con un ancho de un pixel ^20.
3. Analizar el área de la piel nativa bajo los mismos parámetros que los andamios, la asignación de un valor de 100% para el tejido nativo y se refieren al cadalso a ese valor. Por ejemplo, si el porcentaje de píxeles blancos es 60% en el tejido normal y 30% en el andamio, representaría una vascularización 50% del andamio. Nota: La cobertura vasos blanco se asigna al área de un cuadrado alrededor del andamio. Ajuste el número de píxeles blancos consi coberturaDering que el área del círculo es significativamente menor (π x R ²⁾ que el cuadrado (4 x R ^2).

Resultados

Un defecto de la piel completa bilateral fiable se puede crear en el ratón (Figura 1) donde la piel puede ser reemplazado por un biomaterial en estudio (Figura 2). Aquí, no se observan complicaciones mayores durante o después del procedimiento quirúrgico, ni signos macroscópicos de infección o reacción de cuerpo extraño. En casos raros, un andamio se pierde cuando un ratón elimina. Contracción de la herida que nunca se observó (Figura 3). Transiluminación te...

Discusión

Hay una necesidad de establecer enfoques eficaces en la mejora de la perfusión sanguínea en construcciones de ingeniería tisular, lo que exige el desarrollo de nuevos métodos fiables para estudiar los procesos de vascularización dentro de los biomateriales. Los métodos comunes para hacer visible la vascularización andamio ex vivo incluyen el uso de la microscopía, que proporciona una herramienta de alta resolución. En la mayoría de los casos, sin embargo, este método está limitado al análisis de pe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	Strain code 088	Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	Fibrin-thrombin solution
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10