מי הוא מי? שיטות לא פולשנית בנפרד כדי סקס ואפרוחים חובשי קן מארק

Summary

פרוטוקול זה מספק ערכה נוחה של שיטות, אשר מאפשרת מהיר מאוד, קל, לא פולשנית, אמין ובעלות נמוכה, נחישות מולקולרית מין של ציפורים ולא פולשנית מהירה, בטוח וקלה לזיהוי לסימונם, זמן קצר לאחר הבקיעה. רק טיפול מוגבל של אפרוחים נדרש. ארגז כלים נוחים זה של שיטות תואם לחלוטין עם RRR-ההנחיות.

Abstract

ניסויים רבים דורשים נחישות מוקדמת של המין של הצאצאים, כמו גם מוקדם סימון של יילודים לזיהוי פרט. על פי הנחיות לרווחת בעלי החיים, יש להעדיף טכניקות לא פולשנית בכל פעם שישימה. בקבוצה שלנו, אנחנו עובדים על מינים שונים של ציפורים שיר במעבדה ובשדה, ואנחנו מיישמים בהצלחה בשיטות שאינן פולשנית למין ובנפרד לסמן אפרוחים. מאמר זה מציג ארגז כלים לא פולשנית מקיף. זיהוי מין ציפורים לפני הביטוי של תכונות מיניות משניים דורש איסוף חומר DNA נושא עבור ה-PCR. הקמנו שיטה מהירה וקלה לציפורים ממין בכל גיל (לאחר בקיעה) על ידי מיצוי DNA ממטליות buccal. ניתן להשיג תוצאות בתוך 3 שעות. לנוצות במורד של חומוס סימון בודד הם גזומים בדפוסים מסוימים המאפשרים זיהוי מהיר בתוך סדר הבקיעה. זו קבוצה של שיטות היא ישימה בקלות במעבדה סטנדרטית מאובזרת ומתאים במיוחד לעובדg בתחום כללא ציוד מיוחד הנדרש לדגימה ואחסון. טיפול באפרוחים הוא ממוזער וטכניקות לסימון וזיהוי מין הן לא פולשנית וכך תומכות RRR-העיקרון של קווים מנחים לרווחת בעלי החיים.

Introduction

הכרת פרט, זיהוי מין באמצעים וגנוטיפ הם תנאים מוקדמים בסיסיים במגוון רחב של מחקרים ניסיוניים. השגת חומר נושאות דנ"א וסימון נושאים באופן חד משמעי (גם בגיל צעיר) צריכה להיות השפעה מינימאלית על פיזיולוגיה, התנהגות והישרדות. במידת האפשר, יש להימנע מפרוצדורות פולשניות על פי עיקרון RRR ^1.

שיטות לא פולשנית אינן מועילות רק לבעלי החיים אלא גם עשויה לשפר את הנתונים המתקבלים כחיות מושפעות פחות מהטיפולים.

בציפורים, זיהוי מין באמצעי DNA יכולים להתבצע על מספר חומרים בר השגה הלא פולשני כגללים ^2, נוצות ^3,4 או מטליות buccal ^3,5,9. ללא קשר למטליות buccal המצב וגיל של הנבדק הן שיטת בחירה של זיהוי מין באמצעי עופות, כי הם קלים לביצוע, רק לעתים נדירות מצליחות והטיפול הוא קצר.

עד כה, ה-DNA ממטליות buccalהופק גם עם ערכות זמינות מסחרי ^3,6 או זמן רב פרוטוקולי מיצוי DNA סטנדרטיים ^3,6-8. ערכות הן לא רק יקרות למדי, אבל בפרוטוקולים שלהם יכולים להטיל אתגרים לעבודת שטח. כמה פרטים פרוצדורליים, כגון ייבוש ודגירה של דגימות, אינם מעשיים בתחום. במיוחד בסביבה שבי פרוטוקולי ניסוי דורשים טיפול תלוי מין ממוקדם ככל שלאחר דקות ספורות בקיעה, יש דחף לשיטה מהירה, לא פולשנית, אמינה וקלה להשגת תוצאות.

מעבר למיני עופות ארגז כלים משמעותיים ליחידים לציון פותחו ^10. המגוון הרחב של הטכניקות זמינות חשבונות עבור מגוון רחב של מטרות מחקר, מינים ותקציבים. עם זאת, סימון גוזלים קטנים התמודד חוקרים עם אתגרים נוספים. בכמה מיני אפרוחים (למשל passerines) הם קטנים מדי כדי להחיל להקות רגל ודורשים שיטות חלופיות, אשראינו משנה הורה לצאצאי התנהגות. כמודעות ועניין בשיפור רווחת בעלי חיים וטכניקות במחקרי שדה ומעבדה גדלה, השימוש בטכניקות לא פולשנית הוא מומלץ מאוד ועדיף.

פרוטוקול זה מספק שיטה לא פולשנית, מהירה, קל לזיהוי ומתמשכת לציון גוזלים צעירים מאוד אינדיבידואלי לפני יישום להקות רגל אינו ריאלי. שיטת סימון זו הציגה באחד מיני מודל מעבדת עופות החשובים ביותר, הזברה פינק (guttata Taeniopygia) ^11-13. הפרוטוקול עומד בכל המטרות שפורסמו בעבר לטכניקות סימון בודד ¹⁰ וכבר הוחל ^14,15 בהצלחה.

Protocol

כל הנהלים בוצעו בעמידה בחוק הגרמני להגנה על בעלי חיים (TierSchG).

1. הכנה של חומרים כימיים ומתכלה

1. הכן במי כיתה מולקולרית Chelex-100 5% (w / w) פתרון. הכן aliquots של 200 μl בצינורות תגובת 1.5 מיליליטר סטנדרטיים. כמו שרף Chelex משקעים מהר מההשעיה יש צורך מחדש homogenize ההשעיה במהלך תקופת ההכנה של aliquots כל הזמן. זה רצוי להכין 50 מיליליטר או יותר בצרור אחד ולשמור על ההשעיה הומוגני באמצעות בוחש מגנטי. פתרון Chelex יכול להיות מאוחסן במשך שנים בתנאי הסביבה.
2. חותכים חתיכות של נייר Whatman עם רוחב קטן יותר מאשר רוחב המקור של ציפור להיבדק. אורכו של הנייר תלוי בשיטה לקחת המדגם:
   1. בעזרת מלקחיים, החתיכה צריכה להיות ארוכה מספיק כדי לאפשר איסוף דגימה בלי המלקחיים להיות מוכנסים לתוך המקור של ציפור. בתורהערכה גסה, לאורך מקור של 0.5 סנטימטר פיסת נייר עם האורך של 1 סנטימטר צריכה להיות בסדר.
   2. אם לא משתמש במלקחיים, החתיכה צריכה להיות ארוכה יותר, אך את הנוקשות של פיסה עדיין צריכה לאפשר דגימה של תאי האפיתל.
3. הכן aliquot אחד premix PCR עבור כל דגימה להיות מנותחים. עבור ה-PCR בנפח כולל של 25 μl התערובת מכילה 0.18 מ"מ dNTPs, 2 מ"מ MgCl _2, 70 מ"מ טריס-HCl, אמוניום סולפט 17.25 מ"מ, 0.1% (TCTGCATCGCTAAATCCTTT), P8 0.32 מיקרומטר Tween-20, פריימר P2 0.32 מיקרומטר פריימר פולימראז תקי (CTCCCAAGGATGAGRAAYTG) ¹⁶ ו -2 יחידות. ניתן להשתמש פולימראז תקי תוצרת בית ^17. כדי לאפשר תוספת של הסכום המקסימאלי של ה-DNA פתרון, premix 6 μl יכולה להיות מוכנה ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.

2. אוסף דוגמאות

לבישת כפפות אינה חיונית לקביעת מין עופות כprimers PCR לא יכול לחשל את ה-DNA האנושי. עבורמטרות גנוטיפ אחרות זה יכול להיות מומלץ.

1. ללכוד את ציפור של עניין ובעדינות להחזיק אותו ביד לדוגמא, אחד עם "אחיזתו של הצלצול ^'18. ודא שלא לסחוט את ציפור.
2. להחזיק פיסת נייר Whatman עם מלקחיים ולסחוב אותה כמה פעמים על פני החלק הפנימי של הלחיים, הלשון וchoana. בדרך כלל דגימות מתקבלות בתוך פחות מ 30 שניות.
   1. בעלי חיים מבוגרים: בהתאם למין זה עלול להיות קשה כדי לקבל את ציפור לפתוח את מקורו. בדרך כלל מלגעת בצד של המקור והפעלת לחץ עדין יעבוד.
   2. גוזלים: דגימה מגוזלים או גוזלים היא קלה במיוחד שימוש בטכניקה זו, כהתנהגות מתחננת מספקת גישה קלה לחלק הפנימי של המקור. זה יכול להיות אפילו להסיג לך את המדגם ללא טיפול בהם בכלל, כפי שהם בקלות להתחנן למשל, כאשר nestbox נפתח.
3. מייד לאחסן את הנייר בcontai צינור תגובה מוכןנינג 200 μl של 5% (w / w) Chelex-100 פתרון.

אם גם אתם מתכוונים / צריכים לסמן את הגוזלים, לעשות זאת עכשיו כאמור בסעיף 6.

3. אחסון של דגימות לפני הפקת DNA

1. אם עובד במעבדה, דגימות חנות ב -20 ° C. אם זה לא דגימות חנות אפשרי או קשה (למשל בתחום) בטמפרטורות סביבה.
2. דוגמאות יכולות להיות מאוחסנות במשך יותר מ -3 שנים בטמפרטורות הנעות בין טמפרטורת חדר ל-20 ° C.

4. הפקת DNA

1. אם המדגם הוא קפוא, להפשיר אותו בטמפרטורת חדר.
2. ודא שפיסת נייר היא בחלק התחתון של הצינור השקוע בפתרון Chelex-100.
3. דגירה דגימות ל15 דקות ב 56 ° C.
4. וורטקס בקצרה ספין למטה את התוכן של הצינור.
5. דגירה הדגימות במשך 8 דקות ב100 ° C.
6. ספין הדגימות ב 15,000 XG במשך 3 דקות.
7. השתמש ביםupernatant לגנוטיפ שלאחר מכן.

5. קביעת מין מולקולרית

1. הכן אחד צינור PCR עם 6 premix μl לדגימה בתוספת שני צינורות נוספים עבור שלילי שליטה (חובה) וחיובית (אופציונלית). לקביעת מין שגרתית כולל מדגם מזיהוי המין באמצעים המוצלחים האחרונים כביקורת חיובית.
2. הוספת 19 μl של supernatant ממיצוי DNA לpremix ה-PCR. הקפד פיפטה מפני שטח של הפתרון כדי למנוע שריד של חרוזים Chelex. זה חיוני, כמו Chelex הוא מחליף קטיון ולכן קשה מעכבת את כל התגובות אנזימטיות.
3. הפעל את תכנית ה-PCR הבאה: דגירה ב94 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, 45 מחזורים כל אחד עם צעד 30 שניות היתוך 94 מעלות צלזיוס, ואחריו צעד 30 שניות חישול על 55 מעלות צלזיוס, ואחריו צעד התארכות 45 שניות ב72 ° ג בשלב אחרון מרדף כבוי, התגובות שלהם טופחו במשך 5 דקות ב72 ° C.
4. הכן TBE סטנדרטי 2% או agaro טה ג'ל se להפריד את מוצרי ה-PCR.
5. הרץ את הג'ל agarose עם הגדרות מתח מתאימות.
6. דמיינו את הלהקות תחת אור UV ולצלם. ודא שתי הלהקות בדגימות שמקורן בנקבות מופרדות היטב.
7. להבדיל זכר מדגימות נשיות על ידי הנוכחות של אחד (זכר) או שתי להקות (נקבה).

6. סימון גוזלים

1. בדקו קינים לגוזלים שזה עתה בקעו על מתאים לוח זמנים למינים / המחקר (כגון שיקים מדי יום בשעתי הבוקר מומלץ כמו רוב האפרוחים יבקעו לאחר מכן).
2. חותכים את הנוצות למטה של ​​כל אפרוח בתוך קן במיקום אופייני שונה. בזברה פינק קווצות מורדות לצמוח בארבעה תחומים אופייניים ומובהקים על פני (איור 4 א) גופו של הגוזל. עבור כל אפרוח לחתוך תחום אחד (איור 4). אם יש יותר מארבעה אפרוחים בתוך קן אחד, ארבעה "התספורות" הייחודיות ניתן לשלב.

ove_content "> לזברה פינק: למרוח להקות רגל בעשרה ימים שלאחר הבקיעה, כאשר למטה הנוצות להיות קשה לזהות וגודל גוזל מאפשר לצלצל.

תוצאות

מטליות buccal יכולות לשמש כדי להשיג DNA לקביעת מין במגוון רחב של ציפורים קטנות

דגימות נאספו מהזברה פינק (guttata Taeniopygia, 99 אנשים, גיל 0 ימים - 5 שנים), כנריות (קנריה Serinus), Bengalese פינק (striata Lonchura), זמירים (megarhynchos זמיר), שדיים ג?...

Discussion

זיהוי מין ממטליות buccal באמצעות Chelex הראה שיעור הצלחה גבוה מאוד. הנוצות למטה של ​​גוזל חיתוך אפשרו הבחנה בין גוזלים עד פסי רגל היו אפשריים.

חילוץ Chelex-DNA ממטליות buccal הניב מספיק DNA כדי לבצע זיהוי מין באמצעים מולקולריים בהצלחה. קביעת מי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman 3MM Chromatography paper	e.g. Fisher Scientific	No.:3030-153
Chelex 100 Resin	Biorad	#143-2832
Taq polymerase	addgene	http://www.addgene.org/25712/
leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2.5 mm)	Horst Stengel Sohn