Кто есть кто? Неинвазивные методы, чтобы Индивидуально Секс и Все птенцовых Chicks

Резюме

Этот протокол обеспечивает удобный набор методов, который позволяет очень быстро, легко, неинвазивный, надежный и недорогой, определение молекулярной секс птиц и их неинвазивный, быстрый, безопасный и легко узнаваемы маркировки вскоре после вылупления. Только ограничивается обработка цыплят требуется. Эта удобная панель инструментов методов соответствует полностью с RRR-принципов.

Аннотация

Многие эксперименты требуют раннего определения пола потомства, а также в начале маркировки новорожденных для индивидуального признания. Согласно требованиям организаций защиты животных, неинвазивные методы, следует отдать предпочтение, когда это применимо. В нашей группе, мы работаем на разных видов певчих птиц в лаборатории и на местах, и мы успешно применять неинвазивные методы к сексу и индивидуально пометить птенцов. Эта статья представляет собой всеобъемлющий неинвазивный окна инструментов. Определение пола птиц до выражения вторичных половых признаков требует сбора ДНК-содержащего материала для ПЦР. Мы создали быстрый и простой способ, чтобы секс птиц любого возраста (после вылупления) путем извлечения ДНК из щечной тампоны. Результаты могут быть получены в течение 3 часов. Для пуховые перья Индивидуальная маркировка птенца отделаны в конкретных моделей, позволяющих быстро идентифицировать в рамках того штриховки. Этот набор методов легко применимы в стандартном оборудованы лаборатории и особенно подходит для работаюг в области как без специального оборудования не требуется для отбора проб и хранения. Обработка цыплят сводится к минимуму и маркировки и определения пола методы неинвазивной тем самым поддерживая RRR-принцип принципов защиты животных.

Введение

Индивидуальный признание, определение пола и генотипирование фундаментальные предпосылки в различных экспериментальных исследований. Получение ДНК материала подшипника и маркировка предметов однозначно (даже в раннем возрасте) должны иметь минимальное воздействие на физиологии, поведения и выживания. Когда это возможно, инвазивные процедуры следует избегать в соответствии с принципом RRR ^1.

Неинвазивные методы являются не только полезно для животного, но и может улучшить полученные данные, как животные менее подвержены влиянию лечения.

У птиц, определение пола ДНК может быть выполнена на ряде неинвазивно, получаемых материалов, как помет, перья ^{2 3,4} или щечной тампоны ^3,5,9. Независимо от состояния и возраста щечной тампоны субъекта являются методом выбора для птичьего определения пола, потому что они легко выполнить, редко не и обращение коротка.

До сих пор, ДНК из щечной тампоныбыл либо экстрагируют коммерчески доступных наборов ^3,6 или времени стандартные протоколы выделения ДНК ^3,6-8. Комплекты не только довольно дорогие, но их протоколы могут наложить проблем для работы на местах. Некоторые процедурные детали, например, сушка и инкубации образцов, не практичны в этой области. Особенно в условиях, когда экспериментальные протоколы требуют секс зависимой лечение от уже в течение нескольких минут после вылупления, есть стремление к быстрой, неинвазивной, надежный и простой метод получения результатов.

Через птичьего таксонов значительная инструментов для маркировки лиц была разработана ^10. Широкий спектр доступных технологий приходится на различных научно-исследовательских целей, видов и бюджетов. Тем не менее, маркировки стрелкового птенцов столкнулась исследователям дополнительные проблемы. У некоторых видов (например, воробьиные) птенцов слишком малы, чтобы применить полосы ног и требуют альтернативных методов, которыене изменяют поведение родителей и потомства. Как осведомленности и заинтересованности в улучшении благосостояния и методы в полевых и лабораторных исследований животных растет, использование неинвазивных методов настоятельно рекомендуется и предпочтительнее.

Этот протокол обеспечивает неинвазивный, быстрый, легко узнаваемый и постоянный метод индивидуально отметить очень молодых птенцов перед нанесением полос ног осуществимо. Этот метод маркировки вводится на одном из самых важных видов птиц лабораторный образец, в Zebra Finch (Taeniopygia Guttata) ^11-13. Протокол соответствует всем ранее опубликованных задач для отдельных маркировки методов ¹⁰ и уже успешно применяется ^14,15.

протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с законодательством Германии для защиты животных (TierSchG).

1. Подготовка реагентов и расходных материалов

1. Подготовьте 5% (м / м) Chelex-100 решение в молекулярной класса воде. Подготовка аликвоты 200 мкл в стандартных реакционных 1,5 мл пробирки. Поскольку смола Chelex выпадает в осадок быстро из суспензии необходимо повторно гомогенизируют суспензию непрерывно во время приготовления аликвот. Желательно, чтобы подготовить 50 мл или более в одну партию, и держать подвеска гомогенизируют с использованием магнитной мешалки. Решение Chelex могут быть сохранены в течение многих лет в условиях окружающей среды.
2. Вырезать куски ватмана с шириной меньше ширины клюва птицы, чтобы быть проверены. Длина бумаги зависит от метода, чтобы взять образец:
   1. Использование щипцов, часть должна быть достаточно длинной, чтобы создать условия для сбора образца без щипцов вставляют в клюв птицы. КакГрубая оценка, на длину клюва 0,5 см кусок бумаги с длиной 1 см должна быть тонкой.
   2. Если не с помощью щипцов, часть должна быть больше, но жесткость кусок все равно должны позволить выборку эпителиальных клеток.
3. Подготовьте аликвоты ПЦР премикса для каждого образца для анализа. Для ПЦР в общем объеме 25 мкл смесь содержит 0,18 мМ дНТФ, 2 мМ MgCl _2, 70 мМ Трис-HCl, 17,25 мМ сульфат аммония, 0,1% Tween-20, 0,32 мкМ праймер Р2 (TCTGCATCGCTAAATCCTTT), 0,32 мкМ P8 праймер (CTCCCAAGGATGAGRAAYTG) ¹⁶ и 2 единицы Taq полимеразы. Домашнее Taq полимеразы ¹⁷ может быть использован. Чтобы разрешить добавление максимального количества ДНК-раствором, 6 мкл премикс, могут быть получены и хранили при -20 ° С в течение нескольких недель.

2. Отбор проб

Надев перчатки не является необходимым для птичьего определения пола как ПЦР праймеры не могут отжигать в ДНК человека. Длядругих целей генотипирования было бы целесообразно.

1. Захват птицу интереса и мягко держать его в одной руке, например, с «захватом Рингера ^'18. Убедитесь, что не выжать птицу.
2. Держите кусок ватмана с пинцетом и проведите его несколько раз по внутренней стороне щеки, языка и хоаны. Обычно образцы получены в течение менее чем 30 секунд.
   1. Взрослые животные: в зависимости от вида это может быть трудно получить птицу, чтобы открыть свой клюв. Обычно прикасаясь к поверхности клюва и слегка надавливая будет работать.
   2. Птенцы: Отбор проб из птенцов или птенцами особенно легко с помощью этой техники, так как их просить поведение обеспечивает легкий доступ к внутренней части клюва. Это может быть даже можно получить образец без обработки их вообще, так как они легко просить, например, когда их гнездовой ящик открыт.
3. Сразу хранить бумагу в подготовленном Contai реакционную трубкунин 200 мкл 5% (м / м) Chelex-100 решение.

Если вы также намерены / нужно пометить птенцов, сделайте это сейчас, как описано в разделе 6.

3. Хранение образцов Перед ДНК Добыча

1. Если работающие в лаборатории, хранить образцы при -20 ° С Если это невозможно или трудно (например, в области) хранить образцы при температуре окружающей среды.
2. Образцы могут храниться в течение более 3 лет при температурах в диапазоне от комнатной температуры до -20 ° С.

4. ДНК Добыча

1. Если образец замораживают, оттаивают при комнатной температуре.
2. Убедитесь, что лист бумаги находится на нижней части трубки, погруженной в раствор Chelex-100.
3. Инкубируйте образцы в течение 15 мин при 56 ° С
4. Vortex кратко и спином вниз содержание трубки.
5. Инкубируйте образцы в течение 8 мин при 100 ° С
6. Спин образцов при 15000 мкг в течение 3 мин.
7. Используйте секupernatant для последующего генотипирования.

Молекулярная Определение Секс 5.

1. Подготовьте ПЦР-пробирку с 6 мкл премикса на образце плюс два дополнительных труб для отрицательной (обязательно) и положительный контроль (опция). Для определения рутинного секса включают образец из последнего успешного определения пола в качестве положительного контроля.
2. Добавить 19 мкл супернатанта от экстракции ДНК к предварительной смеси ПЦР. Убедитесь, что пипетки от поверхности раствора, чтобы избежать уноса из бисера Chelex. Это очень важно, так как Chelex является катионообменник и, таким образом, резко тормозит все ферментативные реакции.
3. Выполните следующую программу ПЦР инкубации при 94 ° С в течение 3 мин, 45 циклов каждый с шагом 30 сек плавления 94 ° С, за которым следует стадии отжига 30 сек при 55 ° С, с последующим удлинением шаге 45 сек при 72 ° С. В заключительном Chase выходной шаге Реакционные смеси инкубируют в течение 5 мин при 72 ° С
4. Подготовьте 2% стандартный КЭ или TAE AGARO себе гель для разделения продуктов ПЦР.
5. Запустите агарозный гель с соответствующими параметрами напряжения.
6. Визуализация полосы в УФ-свете и сделать снимок. Убедитесь, что две полосы в образцах, происходящих из самок хорошо разделены.
7. Различают мужчина от женских образцов наличием одного (мужчина) или двух (розетка) диапазонах.

6. Маркировка Птенцы

1. Проверьте гнезда для только что вылупившихся цыплят по расписанию, соответствующим видам / учебы (например, ежедневные проверки по утрам рекомендуется, поскольку большинство цыплят люк в то время).
2. Отрежьте вниз перья каждого птенца в гнезде в другом характерном месте. В зебры зябликов пучки падения растут на четырех характерных и различных районах по всей птенец в тело (рис. 4, а). Для каждого цыпленка разрезать одну область (рис. 4б). Если есть более чем в четыре цыплят в течение одного гнезда, уникальные четыре "стрижки" могут быть объединены.

ove_content "> Для зебры зябликов: Применить полосы ног на десять дней после вылупления, когда пуховые перья становятся трудно обнаружить и птенец размер позволяет звонить.

Результаты

Щечной тампоны могут быть использованы для получения ДНК для определения пола в различных мелких птиц

Образцы были собраны от Zebra зябликах (Taeniopygia Guttata, 99 лиц, возрастных 0 дней - 5 лет), Канарейки (Serinus Канария), бенгальские Финчес (Lonchura полосатое), Соловьев

Обсуждение

Определение пола из щечной тампоны с использованием Chelex показали чрезвычайно высокий уровень успеха. Пуховые перья резки Детеныш позволила дифференцировать птенцов, пока нога полосы не удалось.

Добыча Chelex-ДНК из щечной тампоны дали достаточно ДНК для успешного выполн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman 3MM Chromatography paper	e.g. Fisher Scientific	No.:3030-153
Chelex 100 Resin	Biorad	#143-2832
Taq polymerase	addgene	http://www.addgene.org/25712/
leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2.5 mm)	Horst Stengel Sohn