Quem é Quem? Métodos não-invasivos para Individualmente Sexo e Mark altriciais Chicks

Resumo

Este protocolo fornece um conjunto conveniente de métodos, que permite extremamente rápido, fácil, não-invasivo, confiável e de baixo custo, a determinação do sexo molecular de aves e sua não-invasivo, rápido, seguro e facilmente reconhecível marcando logo após a eclosão. É necessária apenas a manipulação limitado de pintos. Esta caixa de ferramentas conveniente de métodos cumpre totalmente com as diretrizes-RRR.

Resumo

Muitos experimentos exigem determinação precoce do sexo do filho, bem como início de marcação de recém-nascidos para o reconhecimento individual. De acordo com as diretrizes de bem-estar animal, devem ser preferidos sempre que aplicável técnicas não invasivas. Em nosso grupo, nós trabalhamos em diferentes espécies de pássaros da canção no laboratório e no campo, e aplicar com êxito métodos não-invasivos para sexo e individualmente marcar pintos. Este trabalho apresenta uma abrangente ferramenta de caixa não-invasiva. Sexagem aves antes da expressão de características sexuais secundárias exige a coleta de material de suporte de DNA para PCR. Nós estabelecemos um método rápido e fácil para as aves do sexo de qualquer idade (pós eclosão) por extração de DNA a partir de zaragatoas bucais. Os resultados podem ser obtidos em 3 horas. Por baixo do bico penas marcação indivíduo são cortados em padrões específicos que permitam identificar rapidamente dentro da ordem de eclosão. Este conjunto de métodos é facilmente aplicável em um laboratório padrão equipada e especialmente adequado para trabalhandog no campo como nenhum equipamento especial é necessário para a amostragem e armazenamento. Manipulação de pintos é minimizado e técnicas de marcação e sexagem não são invasivos apoiando assim o RRR-princípio de diretrizes de bem-estar animal.

Introdução

O reconhecimento individual, sexagem e genotipagem são pré-requisitos fundamentais em uma variedade de estudos experimentais. Obtenção de material com DNA e marcação assuntos de forma inequívoca (mesmo em tenra idade) deve ter um impacto mínimo sobre a fisiologia, comportamento e sobrevivência. Sempre que possível, os procedimentos invasivos deve ser evitada de acordo com o princípio da RRR ^1.

Os métodos não-invasivos não são apenas benéfico para o animal, mas também pode melhorar os dados obtidos como os animais são menos afetadas pelos tratamentos.

Nas aves, sexagem de DNA pode ser executada em uma série de materiais obtidos não invasiva como excrementos ^{2, 3,4} ou penas zaragatoas bucais ^3,5,9. Independentemente do estado e idade swabs bucais do sujeito são o método de escolha para a sexagem das aves, porque são fáceis de executar, raramente falham e manuseio é curto.

Até agora, o DNA de swabs bucaisou foi extraído com kits disponíveis no mercado ^3,6 ou demoradas protocolos de extração de DNA padrão ^3,6-8. Kits não são apenas um pouco caro, mas os protocolos podem impor desafios para o trabalho de campo. Alguns detalhes do procedimento, por exemplo, de secagem e de incubação de amostras, não são práticos na área. Especialmente em um ambiente onde protocolos experimentais requerem tratamento dependente sexo já a partir de alguns minutos após a eclosão, há exortar por um método rápido, não-invasivo, confiável e fácil de obter resultados.

Do outro lado da taxa aviária uma caixa de ferramentas considerável para os indivíduos de marcação foi desenvolvido ^10. A grande variedade de técnicas disponíveis explica a variedade de objetivos de pesquisa, espécies e orçamentos. No entanto, a marcação das pequenas filhotes confrontou pesquisadores com desafios adicionais. Em algumas espécies (por exemplo, passerines) pintos são demasiado pequena para aplicar bandas de perna e requerem métodos alternativos, quenão alteram o comportamento de pais e filhos. Enquanto a consciência e interesse em melhorar o bem-estar e técnicas em estudos de campo e de laboratório animais está crescendo, o uso de técnicas não-invasivas é fortemente encorajado e preferencial.

Este protocolo fornece um método não-invasivo, rápido e facilmente reconhecível e persistente para marcar individualmente muito jovens filhotes antes de aplicar bandas de perna é viável. Este método de marcação é introduzido em uma das espécies de aves modelo de laboratório mais importantes, a Zebra Finch (Taeniopygia guttata) ^11-13. O protocolo em conformidade com todos os objectivos previamente publicados para as técnicas de marcação individuais ¹⁰ e já foi aplicada com êxito ^14,15.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a lei alemã para a protecção dos animais (TierSchG).

1. Preparação de reagentes e consumíveis

1. Prepare a 5% (w / w) de Chelex-100 em solução de água de grau molecular. Preparar alíquotas de 200 ul em tubos de reacção de 1,5 ml de padrão. Como a resina Chelex precipita rapidamente a partir da suspensão, é necessário re-homogeneizar a suspensão constante durante a preparação das aliquotas. É aconselhável preparar 50 ml ou mais de uma só vez e manter a suspensão homogeneizada usando um agitador magnético. A solução de Chelex pode ser armazenado durante anos em condições ambientais.
2. Cortar pedaços de papel Whatman com uma largura menor do que a largura do bico de pássaros a serem testados. O comprimento do papel depende do método de levar a amostra:
   1. Utilizando uma pinça, a peça deve ser suficientemente longo para permitir a coleta de amostras sem a pinça sendo inseridos no bico da ave. Comoestimativa aproximada, para um comprimento de 0,5 cm bico um pedaço de papel com o comprimento de 1 cm deve ser fino.
   2. Se não, utilizando um fórceps, a peça deve ser maior, mas a rigidez da peça deve ainda permitir que a amostragem de células epiteliais.
3. Prepare uma alíquota da PCR pré-mistura para cada amostra a ser analisada. Para a técnica de PCR num volume total de 25 ul da mistura de dNTPs 0,18 mM contém, 2 mM de MgCl _2, 70 mM Tris-HCl, sulfato de amónio 17,25 mM, 0,1% de Tween-20, 0,32 uM de iniciadores P2 (TCTGCATCGCTAAATCCTTT), P8 0,32 fiM iniciador com polimerase (CTCCCAAGGATGAGRAAYTG) ¹⁶ e 2 unidades de Taq. Caseiro Taq polimerase ¹⁷ pode ser usado. Para permitir a adição da quantidade máxima de solução de ADN, uma pré-mistura de 6 uL pode ser preparada e armazenada a -20 ° C durante várias semanas.

2. Coleta de Amostras

O uso de luvas não é essencial para a determinação do sexo das aves como os iniciadores de PCR não pode hibridar com o ADN humano. Paraoutros fins de genotipagem pode ser aconselhável.

1. Capture a ave de interesse e gentilmente segure-o numa mão, por exemplo, com o "aperto de campainha ^'18. Certifique-se de não apertar o pássaro.
2. Segure um pedaço de papel Whatman com uma pinça e passe-o várias vezes em toda a parte interna das bochechas, da língua e da coana. Normalmente as amostras são obtidas em menos de 30 segundos.
   1. Animais adultos: dependendo da espécie, pode ser difícil conseguir o pássaro para abrir seu bico. Normalmente tocar no lado do bico e aplicando uma ligeira pressão vai trabalhar.
   2. Filhotes: Amostragem de filhotes ou filhotes é especialmente fácil, utilizando esta técnica, como o seu comportamento implorando proporciona fácil acesso ao interior do bico. Pode até ser possível obter a amostra sem manuseá-los em tudo, como eles prontamente implorar por exemplo, quando seu ninho é aberto.
3. Imediatamente armazenar o papel em uma preparados contai tubo de reaçãoning 200 ul de 5% (w / w) de Chelex-100 da solução.

Se você também pretende / precisa marcar os filhotes, faça-o agora, como descrito na seção 6.

3. Armazenamento de Amostras Antes de DNA Extraction

1. Se trabalham no laboratório, amostras armazenar a -20 ° C. Se isso não for possível ou difícil (por exemplo, no campo) armazenar as amostras à temperatura ambiente.
2. As amostras podem ser armazenadas durante mais de três anos, a temperaturas variando desde a temperatura ambiente até -20 ° C.

4. Extração de DNA

1. Se a amostra for congelado, descongele-o em temperatura ambiente.
2. Certifique-se de que a folha de papel é no fundo do tubo mergulhado na solução de Chelex-100.
3. Incubar as amostras durante 15 min a 56 ° C.
4. Brevemente Vortex e girar o conteúdo do tubo.
5. Incubar as amostras durante 8 minutos a 100 ° C.
6. Gire as amostras a 15.000 xg por 3 min.
7. Use as supernatant para genotipagem subseqüente.

5. Molecular Determinação do Sexo

1. Prepare um tubo PCR com 6 premix mL por amostra, mais dois tubos adicionais para o negativo (obrigatório) e controle positivo (opcional). Para a determinação do sexo de rotina incluem uma amostra a partir da última sexagem sucesso como um controlo positivo.
2. Adicionar 19 mL do sobrenadante a partir da extracção de ADN para a pré-mistura de PCR. Certifique-se de pipeta da superfície da solução para evitar a transição de contas Chelex. Isto é crucial, como Chelex é um permutador de catiões e, assim, inibe severamente todas as reacções enzimáticas.
3. Executar o seguinte programa de PCR: A incubação a 94 ° C durante 3 min, 45 ciclos cada um com um passo de fusão de 30 seg 94 ° C, seguido por um passo de emparelhamento de 30 segundos a 55 ° C, seguido por um passo de alongamento de 45 segundos a 72 ° C. Em uma etapa final perseguição fora, as reacções são incubadas durante 5 min a 72 ° C.
4. Prepare uma TBE padrão de 2% ou TAE agaro si em gel para separar os produtos de PCR.
5. Execute o gel de agarose com configurações adequadas de tensão.
6. Visualize as bandas sob luz UV e tirar uma foto. Certifique-se que as duas bandas nas amostras provenientes de fêmeas são bem separados.
7. Distinguir masculino a partir de amostras do sexo feminino pela presença de um dois (feminino) bandas (masculino) ou.

6. Marcação Filhotes

1. Verifique ninhos para pintos recém-nascidos em um apropriado cronograma para a espécie / estudo (por exemplo, verificações diárias no período da manhã são aconselhados como a maioria dos filhotes nascem em seguida).
2. Corte as penas para baixo de cada garota dentro de um ninho em um local característica diferente. Em tentilhões-zebra tufos de penas crescer em quatro áreas característicos e distintos em todo o corpo (Figura 4A) do filhote. Para cada pinto cortar uma área (Figura 4B). Se houver mais de quatro filhotes dentro de um ninho, os quatro 'haircuts' exclusivos podem ser combinados.

ove_content "> Para tentilhões-zebra: Aplicar anilhas em dez dias após a eclosão, quando estabelece penas tornam-se difíceis de detectar e tamanho filhote permite tocar.

Resultados

Cotonetes bucais podem ser usadas para obter DNA para a determinação do sexo em uma variedade de aves pequenas

Foram coletadas amostras de Passarinhos da zebra (Taeniopygia guttata, 99 indivíduos, idade 0 dias - 5 anos), Canárias (Serinus canaria), Bengalese Passarinhos (Lonchura striata), rouxinóis (Luscinia megarhynchos), Great Tits (Parus major) e melros (Turdus merula) (para todas as outras espécies: tamanho da amostra 1-3, d...

Discussão

Sexagem de zaragatoas bucais utilizando Chelex mostrou um alto índice de sucesso. Para baixo penas de corte do hatchling permitiu a diferenciação entre filhotes até que a perna bandas era possível.

Extração Chelex-DNA a partir de zaragatoas bucais rendeu DNA suficiente para realizar com êxito a sexagem molecular. A determinação do sexo foi de 100% correta, conforme validado pela plumagem dimorfismo sexual. A taxa de sucesso relatado aqui é significativamente maior do que a taxa re...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman 3MM Chromatography paper	e.g. Fisher Scientific	No.:3030-153
Chelex 100 Resin	Biorad	#143-2832
Taq polymerase	addgene	http://www.addgene.org/25712/
leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2.5 mm)	Horst Stengel Sohn