Kim kimdir? Non-invaziv yöntemler Bireysel Seks ve Mark altricial Civcivler

Özet

Bu protokol son derece hızlı, kolay, non-invaziv, güvenilir ve düşük maliyetli sağlayan yöntemlerin uygun bir dizi, kuşların moleküler cinsiyet tayini ve non-invaziv, hızlı, güvenli ve kolayca tanınabilir kısa yumurtadan çıktıktan sonra işaretleme sağlar. Civcivlerin sadece sınırlı bir işleme gerek yoktur. Yöntemlerden Bu kullanışlı araç RRR-kurallarına tamamen uygundur.

Özet

Birçok deneyler erken yavrusunun seks belirlenmesi yanı sıra erken bireysel tanınması için yenidoğanların işaretleme gerektirir. Uygulanabilir olduğunda hayvan refahı kurallarına göre, non-invaziv teknikler tercih edilmelidir. Bizim grupta, biz laboratuvarda ve alanda şarkı kuşların farklı türler üzerinde çalışmak ve başarılı seks için non-invaziv yöntemler uygulanır ve ayrı ayrı civciv işaretleyin. Bu kağıt kapsamlı bir non-invaziv alet kutusu sunar. Kuş cinsiyet tayini önce ikincil cinsel özelliklerinin ifadesi için PCR için DNA-içeren malzemenin toplanmasını gerektirir. Biz bukkal sürüntü DNA ayıklamak herhangi bir yaşta (sonrası kuluçka) cinsiyeti kuşlar için hızlı ve kolay bir yöntem kurmuştur. Sonuçlar, 3 saat içinde elde edilebilir. Bireysel işaretleme civcivin aşağı tüyleri kuluçka düzen içinde hızlı tanımlanmasına izin veren özel desenler kesilmiş için. Yöntemler Bu set, standart donanımlı bir laboratuvarda kolaylıkla uygulanabilir ve çalışıyorsun için uygundurözel bir donanım olarak alanında g numune alma ve depolama için gereklidir. Civcivlerin taşınması minimize ve işaretleme ve sexing teknikleri böylece hayvan refahı kurallar RRR-prensibini destekleyen non-invaziv olmasıdır.

Giriş

Bireysel tanıma, cinsiyet tayini ve genotiplendirme deneysel çalışmaların çeşitli temel şartlardır. DNA taşıyan malzemenin elde edilmesi ve (hatta erken yaşta) açıkça konular işaretleme fizyoloji, davranış ve yaşam üzerinde çok az etkiye sahip olmalıdır. Mümkün olduğunda, invazif prosedürler RRR prensibine ^{1 'e} göre kaçınılmalıdır.

Non-invazif yöntemler sadece hayvan için faydalı değil, aynı zamanda daha az hayvan tedavi etkilenen olarak elde edilen verileri geliştirmek olabilir.

Kuşlarda, DNA cinsiyet tayini pisliği ^2, tüy ^3,4 veya bukkal bezlerden ^3,5,9 non-invazif elde edilebilen malzemeler bir dizi üzerinde gerçekleştirilebilir. Onlar yapmak kolay, çünkü ne olursa olsun kişinin durumu ve yaşı yanak bezlerden kuş cinsiyet tayini için tercih edilen yöntem nadiren başarısız ve işleme kısa, vardır.

Bukkal sürüntü Şimdiye kadar, DNAya da ticari olarak temin edilebilir kitler ^3,6 veya zaman, standart DNA ekstre etme protokolleri ^3,6-8 alıcı ile ekstre edilmiştir. Kitler sadece oldukça pahalı, ancak bunların protokolleri alan çalışması için zorluklar getirebilir. Bazı usul bilgilerini, örneğin kurutma ve numune inkübasyonu, alanında pratik değildir. Özellikle deneysel protokolleri gibi erken bir kaç dakika sonrası kuluçka gibi seks bağımlı tedavi gerektiren bir ortamda, sonuçlar elde etmek için hızlı, non-invaziv, güvenilir ve kolay bir yöntem için teşvik var.

Kuş takson karşısında işaretleme kişiler için önemli bir araç ¹⁰ geliştirilmiştir. Mevcut tekniklerin geniş bir dizi araştırma hedefleri, türlerin ve bütçelerin çeşitli hesapları. Ancak, küçük yavrumuz işaretleme ek zorluklar araştırmacıların karşı karşıya gelmiştir. Bazı türlerde (örneğin ötücü) Civcivler bacak bantları uygulamak için çok küçük ve alternatif yöntemler, gerektirenebeveyn-çocuk davranışını değiştirmez. Bilinci ve hayvan refahı ve saha ve laboratuvar çalışmalarında tekniklerini geliştirmeye ilgi büyüyor gibi, non-invaziv tekniklerin kullanımı önemle teşvik ve tercih edilmektedir.

Bu protokol tek bacak bantları uygulamadan önce çok genç yavrumuz işaretlemek için bir non-invaziv, hızlı kolayca tanınabilir ve kalıcı yöntem sağlar mümkündür. Bu işaretleme yöntemi en önemli kuş laboratuar model türlerinden biri, Zebra Finch (canlıdır Taeniopygia guttata) ^11-13 tanıtıldı. Bu protokol tek işaretleme teknikleri ¹⁰ için daha önce yayınlanan hedefleri her uygundur ve daha önce başarılı bir şekilde ^14,15 uygulanmıştır.

Protokol

Tüm işlemler hayvan koruma (TierSchG) için Alman yasalarına uygun olarak yapılmıştır.

Reaktifler ve Sarf 1. Hazırlanması

1. Moleküler sınıf su içinde% 5 (a / a) Chelex-100 çözeltisi hazırlayın. Standart 1.5 ml'lik tepkime tüpleri içinde 200 ul alikotları hazırlayın. Chelex reçine süspansiyondan hızla çökelir olarak, alikotları hazırlanması sırasında sürekli olarak yeniden homojenize süspansiyon için gereklidir. Bu, bir toplu 50 ml ya da daha fazla hazırlamak ve manyetik bir karıştırıcı kullanılarak homojenize süspansiyon tutmak için tavsiye bulunuyor. Chelex Çözelti, ortam şartlarında yıl boyunca saklanabilir.
2. Test edilecek olan kuşun gaga genişliğinden daha küçük bir genişliğe sahip Whatman kağıt parçaları kesin. Kağıdın uzunluğu örnek almak için yönteme bağlıdır:
   1. Forseps kullanılarak, parça kuşun gaga sokulmaksızın forseps olmadan örnek toplama işlemini sağlamak için yeterince uzun olmalıdır. Askaba bir tahmin, 0.5 cm'lik bir gaga uzunluğu boyunca 1 cm uzunluğundaki bir kağıt parçası ince olmalıdır.
   2. Forseps kullanarak değil ise, parça daha uzun olması gerekir, ancak parçanın sertliği yine de epitel hücrelerinin örnekleme izin vermelidir.
3. Analiz edilecek her bir örnek için PCR ön-karışımın bir kısım hazırlayın. 25 ul bir toplam hacim içinde bir PCR için, karışım 0.18 mM dNTP, 2 mM _MgCl2, 70 mM Tris-HCI, 17.25 mM amonyum sülfat,% 0.1 Tween-20, 0.32 uM P2 primer (TCTGCATCGCTAAATCCTTT), 0.32 uM P8 içerir primer (CTCCCAAGGATGAGRAAYTG) ¹⁶ ve 2 birim Taq polimerazi. Ev yapımı Taq polimeraz ¹⁷ kullanılabilir. DNA-çözeltisi azami miktarının ilave edilmesini sağlamak için, bir ön-karışım, 6 ul birkaç hafta içinde hazırlanır ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

2.. Örnek Toplama

Eldivenleri giyerek, PCR primerleri, insan DNA tavlanacak değil gibi kuş cinsiyet tespiti için gerekli değildir. IçinDiğer genotiplendirme amaçlar bu tavsiye olabilir.

1. Ilgi kuş yakalama ve yavaşça 'ringer kavrama' ¹⁸ ile bir yandan örneğin tutun. Kuş sıkmak için değil emin olun.
2. Forseps ile Whatman bir parça kağıt tutun ve yanaklar, dil ve kohananın iç çapında bunu birkaç kez kuvvetlice vurun. Genellikle numuneleri en az 30 saniye içinde elde edilir.
   1. Yetişkin hayvanlar: türe bağlı olarak bu gagasını açmak için kuş almak zor olabilir. Genellikle gaga yan dokunmadan ve nazik bir basınç uygulayarak çalışır.
   2. Yavrusu: yavru veya nestlings gelen Örnekleme kendi yalvarıyor davranışları gaga iç kolay erişim sağladığı gibi, bu tekniği kullanarak özellikle kolaydır. Onların nestbox açıldığında onlar kolayca örneğin dilenmek gibi Hatta hiç ellemeden olmadan numunesi elde etmek mümkün olabilir.
3. Hemen hazırlanmış bir reaksiyon tüpü contai kağıdı saklayın% 5 lama 200 ul (a / a) Chelex-100 çözeltisi.

Ayrıca / düşünüyorsanız 6. bölümde anlatıldığı gibi şimdi bunu yapmak, civciv işaretlemek gerekir.

DNA Ekstraksiyon önce Örnekleri 3. Depolama

1. -20 ° C'de laboratuvarda çalışan, mağaza örnekleri Bu ortam sıcaklıklarında mağaza örnekleri mümkün veya (alanında) örneğin zor değilse.
2. Numuneler, oda sıcaklığı ila 20 ° C arasında değişen bir sıcaklıkta en fazla 3 yıl boyunca saklanabilir

4. DNA Ekstraksiyon

1. Numune donmuş ise, oda sıcaklığında çözdürün.
2. Kağıt parçası Chelex-100 çözeltisine batırılmış tüp alt olduğundan emin olun.
3. 56 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin
4. Vortex kısaca ve tüpün içeriğini aşağı doğru döndürün.
5. 100 ° C'de 8 dakika boyunca inkübe edin
6. 3 dakika boyunca 15,000 xg'de örnekleri Spin.
7. S kullanındaha sonra genotipleme için upernatant.

5.. Moleküler Seks Tayini

1. Numune başına 6 ul premiks artı negatif (zorunlu) ve pozitif kontrol (opsiyonel) için iki ek tüpleri ile bir PCR tüpü hazırlayın. Rutin cinsiyet tayini için bir pozitif kontrol olarak son başarılı cinsiyet tayini bir örnek sayılabilir.
2. PCR ön-karışıma DNA ekstraksiyon gelen süpernatan 19 ul ekle. Chelex boncuk taşınmasını önlemek için bir çözüm yüzeyinden pipetle emin olun. Chelex bir katyon değiştirici olduğunu ve bu yüzden ciddi bir şekilde tüm enzimatik reaksiyonları inhibe eder, bu durum çok önemlidir.
3. 3 dakika, 72 ° C de 45 saniye uzama adımı ve ardından 55 ° C de 30 saniye tavlama adımı, ardından 30 saniye erime aşama 94 ° C, 45 döngü her biri için 94 ° C 'de inkübasyon: Aşağıdaki PCR programı çalıştır C. Bir son aşama takip kapalı olarak, reaksiyonlar, 72 ° C'de 5 dakika boyunca kuluçkalanır
4. % 2 standart TBE veya TAE Agaro hazırlayın PCR ürünleri ayırmak için jel se.
5. Uygun voltaj ayarları ile agaroz jel çalıştırın.
6. UV ışık altında bantları görselleştirmek ve bir resim çekin. Kadınlarda kaynaklı örneklerde iki bant iyi ayrılmış olduğundan emin olun.
7. Bir (erkek) ya da iki (kadın) bantların varlığı ile kadın örnekleri erkek ayırt.

6.. Yavrumuz İşaretleme

1. Türler / çalışma için bir zamanlama uygun üzerinde yeni yumurtadan civciv için yuvalarını kontrol edin (en civcivler sonra yumurtadan gibi sabahları örneğin günlük kontroller tavsiye edilir).
2. Farklı karakteristik bir yerde bir yuva içinde her civciv aşağı tüyleri kesin. Zebra ispinoz içinde çıkışlar püskülleri yavru vücut (Şekil 4A) genelinde dört karakteristik ve farklı alanlarda büyür. Her civciv için bir alan (Şekil 4B) kesti. Bir yuvanın içinde dörtten fazla civciv varsa, benzersiz dört 'kesimi' kombine edilebilir.

zebra ispinoz için> "ove_content: aşağı tüyleri algılamak ve yavru boyutu zil verir zor olunca, aşılamadan on gün de bacak bantları uygulayın.

Sonuçlar

Bukkal çubuklar küçük kuş çeşitli seks belirlenmesi için DNA elde etmek için kullanılabilir

, Kanaryalar (Serinus Canaria), Bengalese Finches (Lonchura striatalar), Bülbüller (Luscinia megarhynchos), Büyük Göğüsler (Parus major) ve Karatavuk (Turdus - Numuneler Zebra Finches (5 yıl canlıdır Taeniopygia guttata, 99 bireyler, yaş 0 gün) toplandı merula) (diğer tüm türler için: örneklem büyüklüğü ...

Tartışmalar

Chelex kullanarak bukkal sürüntü sexing son derece yüksek bir başarı oranı gösterdi. Bacak bantlama mümkün oldu kadar kesme yavru aşağı tüyleri nestlings arasındaki farklılaşmayı sağladı.

Bukkal sürüntü Chelex-DNA ekstraksiyon başarıyla moleküler cinsiyet tayini yapmak için yeterli DNA vermiştir. Cinsiyet tayini dimorfik tüyleri tarafından doğrulandığı gibi% 100 doğru idi. Burada bildirilen başarı oranı iki önceki çalışmalarda ^7,9 tarafın...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman 3MM Chromatography paper	e.g. Fisher Scientific	No.:3030-153
Chelex 100 Resin	Biorad	#143-2832
Taq polymerase	addgene	http://www.addgene.org/25712/
leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2.5 mm)	Horst Stengel Sohn