Qui est qui? Méthodes non-invasives pour Individuellement sexe et Mark nidicoles poussins

Résumé

Ce protocole fournit un ensemble pratique de méthodes, ce qui permet extrêmement rapide, facile, non invasif, fiable et à faible coût, la détermination du sexe moléculaire des oiseaux et de leur non-invasive, rapide, sécurisé et facilement reconnaissable marquage peu après l'éclosion. Seulement manipulation limitée des poussins est nécessaire. Cette boîte à outils pratique de méthodes est conforme entièrement aux RRR-directives.

Résumé

De nombreuses expériences nécessitent détermination précoce du sexe de la progéniture ainsi que tôt le marquage des nouveau-nés pour la reconnaissance individuelle. Selon les directives de protection des animaux, les techniques non invasives devraient être privilégiées cas échéant. Dans notre groupe, nous travaillons sur différentes espèces d'oiseaux chanteurs dans le laboratoire et sur le terrain, et nous appliquons avec succès des méthodes non invasives pour le sexe et individuellement marquons poussins. Cet article présente une boîte à outil non invasif complet. Sexage des oiseaux avant l'expression de caractères sexuels secondaires nécessite la collecte de matériel ADN portant pour la PCR. Nous avons établi une méthode rapide et facile pour les oiseaux de tout âge (post-éclosion) de sexe par extraction d'ADN à partir d'un frottis buccal. Les résultats peuvent être obtenus dans les 3 heures. Pour les duvet de marquage individuel chiches sont garnis de motifs spécifiques permettant l'identification rapide dans l'ordre d'éclosion. Cet ensemble de méthodes est facilement applicable dans un laboratoire standard équipée et particulièrement adapté pour Working dans le domaine comme aucun équipement spécial n'est requis pour l'échantillonnage et le stockage. Manipulation des poussins est minimisée et le marquage et la détermination du sexe techniques sont non-invasive soutenant ainsi le RRR-principe de directives de protection des animaux.

Introduction

Reconnaissance individuelle, sexage et le génotypage sont des préalables fondamentaux à une série d'études expérimentales. Obtenir du matériel d'appui de l'ADN et le marquage des sujets clairement (même à un âge précoce) devrait avoir un impact minimal sur la physiologie, le comportement et la survie. Chaque fois que possible, des procédures invasives doivent être évitées selon le principe de RRR ^1.

Les méthodes non-invasives ne sont pas seulement bénéfique pour l'animal, mais aussi peut améliorer les données obtenues car les animaux sont moins affectés par les traitements.

Chez les oiseaux, l'ADN sexage peut être effectuée sur un certain nombre de matériaux obtenus de façon non invasive les fientes, les plumes ^{2 3,4} ou frottis buccal ^3,5,9. Indépendamment de la condition et de l'âge des écouvillons buccaux de question sont la méthode de choix pour le sexage aviaire, car ils sont faciles à réaliser, peu sûr et la manipulation est courte.

Jusqu'à présent, l'ADN de prélèvements buccauxa été extrait avec de l'une ou l'autre des kits disponibles dans le commerce ou ^3,6 chronophages protocoles d'extraction d'ADN standards ^3,6-8. Les kits sont non seulement assez cher, mais leurs protocoles peuvent imposer des défis pour le travail de terrain. Certains détails de la procédure, par exemple, le séchage et l'incubation des échantillons, ne sont pas pratiques dans le domaine. Surtout dans un contexte où les protocoles expérimentaux nécessitent un traitement dépendant du sexe à partir dès que quelques minutes après l'éclosion, il est instamment pour une méthode rapide, non invasive, fiable et facile d'obtenir des résultats.

Dans l'ensemble du taxons aviaire une boîte à outils considérable pour les personnes de marquage a été développé ^10. Le large éventail des techniques disponibles représente la variété des objectifs de la recherche, des espèces et des budgets. Toutefois, le marquage des petits oisillons a été confrontée à des chercheurs avec des défis supplémentaires. Chez certaines espèces (par exemple les passereaux) poussins sont trop petits pour appliquer des bandes de jambe et nécessitent des méthodes alternatives, quine modifie pas le comportement des parents-enfants. La prise de conscience et l'intérêt dans l'amélioration du bien-être et les techniques dans des études de terrain et de laboratoire animal est de plus en plus, l'utilisation de techniques non invasives est fortement encouragée et préférée.

Ce protocole fournit une méthode non-invasive, rapide, facilement reconnaissable et persistant pour marquer individuellement les très jeunes oisillons avant d'appliquer des bandes de jambe est possible. Cette méthode de marquage est introduit sur ​​l'une des espèces les plus importantes du modèle de laboratoire aviaire, le Finch Zebra (Taeniopygia de guttata) ^11-13. Le protocole est conforme à tous les objectifs précédemment publiés pour les techniques de marquage individuels ¹⁰ et a déjà été appliquée avec succès ^14,15.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec la loi allemande pour la protection des animaux (TierSchG).

1. Préparation des réactifs et consommables

1. Préparer une 5% (p / p) de Chelex-100 solution dans l'eau de qualité moléculaire. Préparer des aliquotes de 200 pl dans des tubes de réaction de 1,5 ml standard. Comme la résine Chelex précipite rapidement à partir de la suspension, il est nécessaire de ré-homogénéiser la suspension constamment au cours de la préparation des fractions aliquotes. Il est conseillé de préparer 50 ml ou plus en un seul lot et maintenir la suspension homogénéisée à l'aide d'un agitateur magnétique. La solution Chelex peut être stocké pendant des années dans les conditions ambiantes.
2. Couper des morceaux de papier Whatman avec une largeur inférieure à la largeur du bec de l'oiseau à tester. La longueur du papier dépend de la méthode de prélever l'échantillon:
   1. En utilisant des pinces, la pièce doit être suffisamment longue pour permettre le prélèvement de l'échantillon sans la pince étant insérée dans le bec de l'oiseau. En tant queestimation approximative, pour une longueur de bec de 0,5 cm un morceau de papier avec la longueur de 1 cm doit être fine.
   2. Si ce n'est pas l'aide de pinces, la pièce doit être plus long, mais la rigidité de la pièce doit toujours permettre l'échantillonnage des cellules épithéliales.
3. Préparer une aliquote de prémélange de PCR pour chaque échantillon à analyser. Pour une PCR dans un volume total de 25 ul du mélange contient mM dNTP à 0,18, 2 mM de _MgCl2, 70 mM Tris-HCl, le sulfate d'ammonium 17,25 mM, 0,1% de Tween-20, 0,32 uM amorce P2 (TCTGCATCGCTAAATCCTTT), 0,32 uM P8 amorce (CTCCCAAGGATGAGRAAYTG) ¹⁶ et 2 unités de Taq polymérase. Maison Taq polymerase ¹⁷ peut être utilisé. Afin de permettre l'addition de la quantité maximale d'ADN-solution, un pré-mélange de 6 pi peut être préparé et conservé à -20 ° C pendant plusieurs semaines.

2. Prélèvement des échantillons

Le port de gants n'est pas essentielle pour la détermination du sexe aviaire que les amorces de PCR peuvent pas s'hybrider avec l'ADN humain. Pourd'autres fins de génotypage, il pourrait être souhaitable.

1. Capturer l'oiseau d'intérêt et tenir doucement dans un exemple de pair avec la «prise de sonnerie» ^18. Assurez-vous de ne pas presser l'oiseau.
2. Placez une feuille de papier Whatman avec une pince et la glisser à plusieurs reprises dans l'intérieur des joues, la langue et la choane. Habituellement, les échantillons sont obtenus en moins de 30 secondes.
   1. Les animaux adultes: selon les espèces, il pourrait être difficile d'obtenir l'oiseau d'ouvrir son bec. Habituellement toucher le côté du bec et appliquant une légère pression va fonctionner.
   2. Les oisillons: échantillonnage de nouveau-nés ou des oisillons est particulièrement facile en utilisant cette technique, que leur comportement mendicité offre un accès facile à l'intérieur du bec. Il pourrait même être possible d'obtenir l'échantillon sans les manipuler à tous, comme ils mendient facilement par exemple lorsque leur nichoir est ouvert.
3. Stocker immédiatement le papier dans un préparés contai tube de réactionning 200 ul de 5% (p / p) Chelex-100 solution.

Si vous avez l'intention aussi / besoin de marquer les poussins, faites-le maintenant comme décrit dans la section 6.

3. Stockage des échantillons avant l'extraction de l'ADN

1. Si travaillant dans le laboratoire, les échantillons à -20 ° C. Si ce n'est pas possible de stocker des échantillons ou difficile (par exemple dans le domaine) à température ambiante.
2. Les échantillons peuvent être conservés pendant plus de 3 ans à des températures allant de la température ambiante à -20 ° C.

4. DNA Extraction

1. Si l'échantillon est congelé, le décongeler à la température ambiante.
2. Assurez-vous que le morceau de papier est présent dans le fond du tube immergé dans la solution Chelex-100.
3. Incuber les échantillons pendant 15 min à 56 ° C.
4. brièvement Vortex et centrifuger le contenu du tube.
5. Incuber les échantillons à 8 min à 100 ° C.
6. Faites tourner les échantillons à 15 000 g pendant 3 min.
7. Utilisez les supernatant pour le génotypage ultérieur.

5. Moléculaire Détermination du sexe

1. Préparer un tube PCR avec 6 pi prémélange par échantillon plus deux tubes supplémentaires pour le négatif (obligatoire) et contrôle positif (en option). Pour la détermination du sexe de routine inclure un échantillon de la dernière sexage réussie en tant que contrôle positif.
2. Ajouter 19 ul de surnageant provenant de l'extraction de l'ADN de la pré-mélange PCR. Assurez-vous de la pipette de la surface de la solution pour éviter le report des perles Chelex. Ceci est crucial, comme Chelex est un échangeur de cations et par conséquent inhibe fortement les réactions enzymatiques.
3. Exécuter le programme de PCR suivant: incubation à 94 ° C pendant 3 min, 45 cycles chacune avec une fusion de l'étape 30 sec 94 ° C, suivie d'une étape de recuit de 30 secondes à 55 ° C, suivie d'une étape d'élongation de 45 secondes à 72 ° C. Dans une étape finale chasser, les réactions sont incubées pendant 5 min à 72 ° C.
4. Préparer un TBE standard de 2% ou TAE agaro soi gel pour séparer les produits de PCR.
5. Exécuter le gel d'agarose avec des réglages de tension appropriées.
6. Visualiser les bandes sous lumière UV et prendre une photo. Assurez-vous que les deux bandes dans les échantillons provenant de femmes sont bien séparés.
7. Distinguer mâle à partir d'échantillons de femmes par la présence d'un deux bandes (femelle) (mâle) ou.

6. Marquage oisillons

1. Vérifiez nids pour les poussins nouvellement éclos sur une appropriée de calendrier pour l'espèce / étude (par exemple, les contrôles quotidiens le matin est conseillé que la plupart des poussins éclosent alors).
2. Couper le duvet de chaque poussin dans un nid à un endroit caractéristique différente. Dans les diamants mandarins touffes de bas poussent à quatre zones caractéristiques et distinctes de l'organisme (figure 4A) de l'oisillon. Pour chaque poussin couper une zone (figure 4B). Si il ya plus de quatre poussins dans un nid, les quatre «décotes» uniques peuvent être combinés.

ove_content "> Pour les diamants mandarins: Appliquer des bandes de jambe à une dizaine de jours après l'éclosion quand duvet deviennent difficiles à détecter et la taille des oisillons permet de sonner.

Résultats

Prélèvements dans la bouche peuvent être utilisées pour obtenir de l'ADN pour la détermination du sexe dans une variété de petits oiseaux

Les échantillons ont été prélevés diamants mandarins (Taeniopygia guttata, 99 personnes, âge 0 jours - 5 ans), Canaries (Serinus canaria), bengalis Pinsons (Lonchura striata), des rossignols (Luscinia megarhynchos), Mésanges (Parus major) et merles (Turdus merula) (pour toutes les a...

Discussion

Sexage de frottis buccal à l'aide de Chelex ont montré un taux de réussite très élevé. Les duvet de nouveau-nés de coupe ont permis la différenciation entre les oisillons jusqu'à ce que la jambe bandes était possible.

Extraction Chelex-ADN à partir d'un frottis buccal a donné suffisamment d'ADN pour réaliser avec succès le sexage moléculaire. La détermination du sexe était de 100% correctes, validé par le plumage dimorphisme sexuel. Le taux rapporté ici de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman 3MM Chromatography paper	e.g. Fisher Scientific	No.:3030-153
Chelex 100 Resin	Biorad	#143-2832
Taq polymerase	addgene	http://www.addgene.org/25712/
leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2.5 mm)	Horst Stengel Sohn