誰が誰ですか？非侵襲的な方法に個別にセックス·アンド·ザ·マーク·晩成性の雛

要約

このプロトコルは、孵化直後にマーキング極めて迅速、簡単、非侵襲的、信頼性の高い鳥の低コスト、分子性決定とそれらの非侵襲的、迅速、安全かつ容易に認識可能にする方法の便利なセットを提供します。雛の限られた処理が必要となります。メソッドのこの便利なツールボックスは、RRR-ガイドラインに完全に準拠しています。

要約

多くの実験は、初期の子孫の性別を決定するだけでなく、初期の個体識別のための新生児のマーキングが必要です。該当するときはいつでも、動物福祉のガイドラインによれば、非侵襲的な技術が優先されるべき。私たちのグループでは、研究室で、現場での曲の鳥の異なる種で動作し、我々が正常なセックスに非侵襲的方法を適用し、個別に雛をマーク。本論文では、総合的な非侵襲的なツールボックスが表示されます。鳥を雌雄鑑別することは前に第二次性徴形質発現をPCRのためのDNA含有物質の収集を必要とします。私たちは、口腔スワブからDNAを抽出することにより、あらゆる年齢（ポスト孵化）の性鳥への迅速かつ簡単な方法を確立した。結果は、3時間以内に得ることができる。のための個々のマーキングひよこのダウン羽が孵化順序内での高速同定を可能にする特定のパターンでトリムされます。メソッドのセットは、標準装備の研究室でも容易に適用され、働いに特に適し特別な機器などの分野でのGはサンプリングと保存のために必要とされている。雛の取扱いを最小限にし、マーキングおよび性判別技術は、非侵襲的、それによって動物福祉ガイドラインのRRR原理を支援しています。

概要

個人認識、性判別およびジェノタイピングは、実験的研究の様々な基本的な前提条件である。 DNAの軸受材料を得て、（でも早い年齢で）明確に被写体をマーキング生理、行動、生存への影響を最小限に抑える必要があります。可能な限り、侵襲的処置はRRR原理¹によれば避けるべきである。

非侵襲的な方法だけでな​​く、動物のために有益であるだけでなく、動物が少ない治療法の影響を受けているようにして得られたデータを向上することがあります。

鳥類では、DNAの性判別が糞^2、羽毛^3,4または口腔スワブ^3,5,9などの非侵襲的に得られる材料の数に基づいて行うことができる。彼らは実行が容易であるために関係なく、患者の状態や年齢頬スワブの鳥類の雌雄鑑別のための選択の方法はほとんど失敗しないと取り扱いが短い、、である。

口腔スワブからこれまでのところ、DNAいずれかの市販のキット^3,6又は時間^3,6-8標準的なDNA抽出プロトコールを消費で抽出した。キットだけでなく、かなり高価ですが、彼らのプロトコルは、フィールドワークのための課題を課すことができる。いくつかの手続きの詳細、 例えば乾燥およびサンプルのインキュベーションは、フィールドには実用的ではない。特に実験プロトコルは、早ければ数分後孵化などからセックス依存の治療を必要とする設定で、結果を得るために、迅速な非侵襲的、信頼性が高く、簡単な方法のために促すとされている。

鳥類の分類群間でマーキング個人のためのかなりのツールボックスは^、10を開発してきた。利用可能な技術の広い配列は、研究目的、種や予算のさまざまなを占めています。しかし、小さな雛をマークすると、新たな課題を研究者に直面しています。いくつかの種（ 例えばスズメ目）のヒヨコは、レッグバンドを適用するには小さすぎる、代替方法を必要とする親の子孫の動作を変更しないでください。フィールドと実験室での研究で動物福祉や技術の改善に意識や関心が高まっているように、非侵襲性の技術を使用することを強く奨励して好ましい。

このプロトコルは、個々に、レッグバンドを適用する前に、非常に若い雛をマークするために非侵襲的、迅速かつ容易に認識永続方法を提供することは可能である。このマーキング方法は、最も重要な鳥類の実験室モデルの種の一つ、ゼブラフィンチ（Taeniopygia滴状 ^{）11月13日}に導入されている。プロトコルは、個々のマーキング技術¹⁰のための以前に発表され目標のすべてに準拠しており、すでに正常^14,15を適用されている。

プロトコル

すべての手順は、動物保護（TierSchG）のためのドイツの法律を遵守して実施された。

試薬および消耗品の1。準備

1. 分子グレードの水中5％（w / w）のキレックス-100溶液を調製する。標準1.5ミリリットルの反応管に200μLのアリコートを準備します。キレックス樹脂はサスペンションからの高速沈殿するように、一定分量の調製中絶えず再均質化するサスペンションが必要である。それは1つのバッチを50 ml以上を準備し、マグネチックスターラーを用いて均質化した懸濁液を維持することをお勧めです。キレックス溶液を周囲条件で年間保存することができる。
2. 試験対象の鳥のくちばしの幅よりも狭い幅のワットマン紙の部分をカット。用紙の長さは、サンプルを取るための方法によって異なります。
   1. 鉗子を使用して、作品は鳥のくちばしに挿入される鉗子ずにサンプル採取を可能にするのに十分な長さでなければなりません。として概算は、0.5cmのくちばしの長さ1cmの長さの一枚の紙は、問題ないはずです。
   2. 鉗子を使用していない場合は、作品は長くなければなりませんが、一枚の剛性は、まだ上皮細胞の採取を可能にするはずである。
3. 分析しようとするそれぞれのサンプルについて、PCRプレミックスの1アリコートを準備します。混合液25の全体積0.18のdNTPを含有する、2mMのMgCl _2、70mMのトリス-HCl、17.25 mMの硫酸アンモニウム、0.1％のTween-20、0.32μMのP2プライマー（TCTGCATCGCTAAATCCTTT）におけるPCR、0.32μMP8用プライマー^{（CTCCCAAGGATGAGRAAYTG）16}および2単位のTaqポリメラーゼ。自家製のTaqポリメラーゼ¹⁷を使用すること^ができる。 DNA溶液の最大量の添加を可能にするために、6μlのプレミックスは、数週間のために調製し、-20℃で保存することができる。

2。サンプルの採取

PCRプライマーなどの鳥類の性決定がヒトDNAにアニーリングすることはできませんのために手袋を身に着けていることは必須ではない。のために他のジェノタイピングの目的は、それが賢明かもしれません。

1. 興味のある鳥を捕獲し、そっと「リンゲルグリップ^「18と1手などでそれを保持。鳥を圧迫しないようにしてください。
2. 鉗子でワットマン紙を持って、頬の内側、舌と後鼻孔を渡ってそれを数回強打。通常、サンプルは、30秒未満以内に得られる。
   1. 成体動物：種によって、そのくちばしを開くために鳥を得ることは困難かもしれません。通常、くちばしの側面に触れ、穏やかな圧力を適用すると、動作します。
   2. 雛：孵化やヒナからのサンプリングがその物乞い行動はくちばしの内部への容易なアクセスを提供するので、この技術を用いて、特に簡単です。そのnestboxが開かれたとき、彼らはすぐに例を請うようにそれも、すべてでそれらを処理せずにサンプルを得ることができるかもしれません。
3. 直ちに調製した反応管contaiに用紙を格納5％（w / w）のキレックス-100溶液200μlを寧。

あなたも/予定の場合はセクション6で説明したようにここで行い、雛をマークする必要があります。

DNA抽出前のサンプルの3。ストレージ

1. -20℃での研究室で働いている場合は、サンプルの保存これは、周囲温度で保存サンプル（フィールド内など ）が可能かは難しいことではありません場合。
2. 試料を室温から-20℃の範囲の温度で3年以上保存することができる

4。DNA抽出

1. 試料が凍結している場合、室温で解凍。
2. 一枚の紙がキレックス-100溶液に沈め管の底にあることを確認します。
3. 56℃で15分間、サンプルをインキュベート
4. 簡単にボルテックスチューブの内容をスピンダウン。
5. 100℃で8分間のサンプルをインキュベート
6. 3分間15,000×gでサンプルをスピン。
7. Sを使用してくださいその後の遺伝子型判定のためupernatant。

5。分子性決定

1. サンプルあたり6μlのプレミックスプラス2の負のための追加のチューブ（必須）および陽性コントロール（オプション）を1 PCRチューブを準備します。ルーチンの性決定のポジティブコントロールとして、最後に成功した雌雄鑑別からのサンプルが含まれています。
2. DNA抽出からのPCRプレミックスに上清の19μLを加える。キレックスビーズのキャリーオーバーを避けるために、溶液の表面からピペットにしてください。キレックスは陽イオン交換体であるため、深刻なすべての酵素反応を阻害するので、これは非常に重要です。
3. 3分間、72℃で45秒の伸長ステップ、続いて55℃で30秒のアニーリング工程、続いて30秒間溶融工程94°C、45サイクルの各94℃でインキュベーション：以下のPCRプログラムを実行するC.最終チェースオフ工程では、反応は72℃で5分間インキュベートする
4. 2％標準TBEまたはTAE agaroを準備 PCR産物を分離するためのそれ自体のゲル。
5. 適切な電圧設定でアガロースゲルを実行します。
6. UV光下でバンドを可視化し、写真を撮る。メスから発信サンプル中の2バンドが十分に分離されていることを確認します。
7. 1（男性）または2（メス）のバンドの存在によって、女性のサンプルの男性を区別する。

6。雛マーキング

1. 種/研究のための適切なスケジュールで、新たに孵化した雛のための巣を確認します（ほとんどのヒナが孵化した後のように朝には例えば 、毎日のチェックがお勧めします）。
2. 異なる特性の場所で巣内の各ひよこのダウン羽を切った。キンカチョウで浮き沈みの房は、雛の体全体で4つの特徴と異なる領域（ 図4A）で成長する。それぞれのひよこのための1の領域（ 図4B）をカット。つ以上の雛一ネスト内に存在する場合、固有の4 '髪型'は組み合わせることができる。

キンカチョウの場合ove_content ">：羽は検出が困難になり、雛サイズが鳴って許可した場合ダウン孵化ポスト10日にレッグバンドを適用します。

結果

口腔スワブは小鳥種々の性決定のためのDNAを得るために使用することができる

サンプルは、キンカチョウ（Taeniopygia滴状、99の個人、年齢0日- 5歳）から採取した、カナリア諸島（Serinusのカナリア ）、ベンガルフィンチ（Lonchura線条体 ）、ナイチンゲール（ サヨナキドリ ）、シジュウカラ（ シジュウカラ ）とブラックバーズ（ ツ?...

ディスカッション

キレックスを用いた口腔スワブから雌雄鑑別は非常に高い成功率を示した。脚バンディングが可能になるまで切削雛のダウンの羽毛は、雛の間で差別化を可能にしました。

口腔スワブからのキレックス-DNA抽出に成功し、分子性判別を実行するための十分なDNAが得られた。性的二型羽によって検証としての性決定は正しい100％だった。ここで報告された成功率は2これまで...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman 3MM Chromatography paper	e.g. Fisher Scientific	No.:3030-153
Chelex 100 Resin	Biorad	#143-2832
Taq polymerase	addgene	http://www.addgene.org/25712/
leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2.5 mm)	Horst Stengel Sohn