שיטה לקבלת תאי סרטן השחלות ראשיים מתוך דגימות מוצקים

Summary

מחקר זה מתאר שיטה מפורטת לבידוד ואפיון של תאי סרטן שחלות ראשוניים מדגימות קליניות מוצקות. דגימות קליניות בסרטן השחלות חשופים לעיכול אנזימטי לקבל סרטן קיימא, ללא פיברובלסטים אפיתל השחלות תאים (EOC) מתאים במיוחד עבור יישומים במורד הזרם.

Abstract

כלים אמינים לחקירת ייזום סרטן השחלות ואת ההתקדמות נחוצים בדחיפות. בעוד שהשימוש בשורות תאי סרטן השחלות נשאר כלי רב ערך להבנת סרטן השחלות, יש השימוש בם מגבלות רבות. אלה כוללים את חוסר ההטרוגניות והשפע של שינויים גנטיים הקשורים passaging הממושך במבחנה. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת להקמה מהירה של תאי סרטן שחלות ראשוניים ליצור דגימות קליניות מוצקות שנאספו בזמן הניתוח. השיטה מורכבת מהכפפת דגימות קליניות לעיכול אנזימטי ל30 דקות. ההשעיה התא בודדת מותרת לגדול ויכולה לשמש ליישומים במורד הזרם, כולל הקרנת סמים. היתרון של שורות תאי סרטן השחלות עיקריות על שורות תאי סרטן השחלות הוקמו הוא שהם מייצגים את הדגימות הקליניות הספציפיות המקוריות הם נגזרים וניתן להפיק מן האתרים שונים אם פרימהסרטן השחלות ר"י או גרורתי.

Introduction

למרות השכיחות הנמוכה יחסית שלה, סרטן השחלות הוא הקטלני ביותר של מחלות גינקולוגיות והגורם המובילים החמישי של מקרי מוות מסרטן בקרב נשים ^1,2. זאת, בעיקר בשל המחסור בכלים אמינים ומודלים שנאמנו לסכם ייזום והתקדמות המחלה ^3. רוב הידע שלנו היום על סרטן השחלות היה אפשרי באמצעות השימוש בתאים הונצחו השחלות אפיתל פני השטח (IOSEs), שורות תאי סרטן השחלות וסרטן השחלות תאים ראשוניים התאוששו ^מ4-7 הנוזלים הרעיל. למרבה הצער, יש לו השימוש בם מספר מגבלות, כולל מספר השינויים הגנטיים ופנוטיפי הקשורים בתהליך הנצחה או במעברי מבחנה וההטרוגניות של האוכלוסייה כתוצאה מהכנת נוזלים רעילה.

לכן, תאי סרטן השחלות עיקריים הנגזרים מדגימות מוצקות לזיהוי והספציפיים של סרטן השחלות מייצגים uniquכלי דואר לחקר התפתחות סרטן השחלות.

הקשיים העיקריים המעורבים בתאים הממאירים אלה קבלת הם תוצאה של צמיחת יתר של תאי סטרומה או fibroblasts יחד עם הפסד של כדאיות וחוסר המוקדם של יכולת שגשוג בתרבות של תאי EOC אלה. כמה שיטות ליצירת תא בודד השעיות מגידולים מוצקים קיימות כיום, באמצעים מכאניים או ניתוק האנזימטית, לעומת זאת טכניקות מסוימות להניב כמות גדולה יותר של התוצאה המועדפת ^8. כאן, אנו מראים כי עיכול אנזימטי עם dispase השני תוצאות בהתאוששות יעילה של תאי EOC קיימא, ללא פיברובלסטים. תרבויות EOC מה שהושגו הן רגישות מאוד למניפולציה גנטית ושימושיות גם בבדיקות סמים, מצביעים על כך שתרבויות EOC אלה מתאימות ליישומים רבים במורד הזרם.

Protocol

הצהרת אתיקה
דגימות מוצקות של סרטן השחלות התקבלו ממתקן אוניברסיטת מינסוטה רכש רקמות (TPF) לאחר מוסדי מועצה לביקורת הוועדה: אישור דירקטוריון הסובייקט אנושי (IRB).

1. התקנה מגיב

1. להכין מדיום DMEM שלם על ידי השלמת DMEM עם 10% FBS, ו100 יחידות פניצילין, סטרפטומיצין. אחסן את המדיום על 4 מעלות צלזיוס וחמה 37 מעלות צלזיוס לפני שימוש.
2. dispase aliquot השני באמצעי אחסון נפרד של 5-10 מיליליטר, כדי למנוע הקפאה מרובה מפשיר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במקפיא ללא nonfrost.

2. אוסף רקמות

1. לאסוף דגימות מוצקות של סרטן השחלות (~ 5 גרם בגודל) בזמן הניתוח מאזורי macroscopically זוהו כסרטן על ידי פתולוג. דגימות הקליניות מזוהה דה ונרשמו על פי פרוטוקולים מוסדיים.
2. הנח דגימות בסטרילי, scהמכסה REW, פוליפרופילן דגימות מיכל מלא ב30 מיליליטר של PBS קר כקרח. להעביר את הדגימות מהמעבדה לפתולוגיה כירורגית למעבדת המחקר לעיבוד על קרח, ובתוך 30 דקות מאיסוף דגימה (איור 1).

3. עיבוד רקמות

1. עבודה בתנאים סטריליים, להעביר את הדגימות על צלחת פטרי (60 מ"מ x 60 מ"מ) המכיל 10 מיליליטר של PBS הטרי קר כקרח, ובאמצעות סכין סטרילי גילוח, לחתוך יותר לתוך החתיכות אפשריות (2 מ"מ או פחות) הקטנות ביותר ( 2A דמויות ו2 ב ').
2. העבר את הרקמות טחונות לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל 10 מיליליטר של prewarmed (37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות) dispase השני (2.4 U / ml) בDMEM ולדגור על 5% CO ₂ ו37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. כדי להבטיח עיכול מיטבי של הדגימות, להתסיס ידני תרחיף התא כל 5 דקות.
3. לאחר 30 דגירה דקות, העברה (באמצעותפיפטה סרולוגיות 10 מיליליטר) תרחיף התאים על גבי מסננת תא (70 רשת מיקרומטר) ממוקם על גבי צינור חרוטי 50 מיליליטר ולהחיל לחץ עדין נגד הרשת באמצעות בוכנת מזרק. לבטל את כל רקמת undissociated (שנותרה בחלק העליון של הרשת) ולאסוף את ההשעיה התא שהושגה בצינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב320 XG במשך 7 דקות ב 4 ° C (איור 3).
4. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS.
5. דגירה ההשעיה התא בצלחת פטרי ב 5% CO ₂ ו37 ° C (איור 4).
6. שינוי הבינוני לאחר 24 שעות מהציפוי הראשוני. זה מאפשר להסרת פסולת הסלולר ורוב אריתרוציטים הווה בתרבות.
7. לשנות את המדיום כל שלושה ימים בשבועיים שלאחר מכן, לאחר שהתרבויות של EOC העיקרי מוכנות ליישומים במורד הזרם.

תוצאות

דגימות קליניות טריות של סרטן השחלות נאספות לאחר הניתוח (איור 1) וחותכים לחתיכות קטנות (2A דמויות ו2B) המהוות את תרחיף התא. זה מאפשר חשיפה אופטימלית של הדגימות לטיפול אנזימטי. תרחיף תא חשוף לעיכול אנזימטי וטופחו על C ° 37 ל30 דקות. במהלך זמן הדגירה slurry הופך ...

Discussion

הבנה טובה יותר של האטיולוגיה סרטן השחלות ופיתוח היא חיונית לשיפור התוצאות של נשים מושפעות מהמחלה ההרסנית הזאת. בהקשר זה, השימוש בהוקם ו" זמין מסחרי "שורת תאי סרטן השחלות הייתה ללא ספק שימושית מאוד. עם זאת, היום אנחנו יודעים ששורות תאי הסרטן אינן נציג של הגידול הא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS, sterile	Invitrogen	14190-144
Screw lid, polypropylene specimen container, sterile	Thermo Scientific	02 1090
DMEM medium, sterile	Invitrogen	11995-065
Fetal bovine serum, sterile	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicillin-streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122
Dispase II, sterile	Roche	04942 078 001
Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile	Fisher Scientific	forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D
Small dissecting scissors, sterile	Fisher Scientific	08-945
15 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352097
50 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352027
10 ml Serological pipette, sterile	Corning	13-678-11E
6 ml Syringe plunger, sterile	Tyco Healthcare	8881516911
Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile	BD Falcon	352350
5 cm Petri dish, sterile	Corning	430166
10 cm Petri dish, sterile	Corning	430167