Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Resumo

Este estudo descreve um método detalhado para o isolamento e caracterização de células de cancro do ovário a partir de espécimes clínicos primários sólidos. Espécimes clínicos de câncer de ovário são submetidos a digestão enzimática para obter, câncer viável sem fibroblastos epitelial de ovário células (EdC) altamente adequados para aplicações a jusante.

Resumo

Ferramentas confiáveis ​​para investigar a iniciação do câncer de ovário e progressão são urgentemente necessários. Embora a utilização de linhas celulares de cancro do ovário permanece uma ferramenta valiosa para a compreensão do cancro do ovário, o seu uso tem muitas limitações. Estas incluem a falta de heterogeneidade e a pletora de alterações genéticas associadas com passagens em extensas in vitro. Aqui nós descrevemos um método que permite a criação rápida de células de câncer de ovário primários formar espécimes clínicos sólidos coletados no momento da cirurgia. O método consiste em submeter as amostras clínicas para a digestão enzimática durante 30 minutos. A suspensão de células isoladas é deixada crescer e podem ser usadas para aplicação a jusante, incluindo o rastreio de drogas. A vantagem de linhas celulares de cancro do ovário primários mais linhas de células de câncer de ovário estabelecidos é que eles são representativos dos espécimes clínicos específicos originais são derivadas e podem ser derivadas a partir de diferentes locais quer primacâncer de ovário ry ou metastático.

Introdução

Apesar da sua relativa baixa incidência, o câncer de ovário é o mais mortal das doenças ginecológicas ea quinta causa de morte por câncer entre as mulheres ^1,2. Isto é principalmente devido à falta de ferramentas confiáveis ​​e modelos que recapitulam fielmente a iniciação ea progressão da doença ^3. A maioria do nosso conhecimento hoje sobre o câncer de ovário foi possível através do uso de células imortalizadas ovarianos epiteliais da superfície (IOSEs), linhas de células de câncer de ovário e células de câncer de ovário primários recuperados de líquido ascítico ^4-7. Infelizmente, a sua utilização tem várias limitações, incluindo uma série de mudanças genéticas e fenotípicas associadas com o processo de imortalização ou em passagens in vitro e a heterogeneidade da população resultante da preparação de fluido ascítico.

Portanto, as células de câncer de ovário primários derivados de amostras sólidas identificáveis ​​e específicos do câncer de ovário representam uma unique ferramenta para estudar a progressão do câncer de ovário.

As principais dificuldades na obtenção dessas células malignas são devido a um crescimento excessivo de células do estroma ou fibroblastos, juntamente com perda de viabilidade e prematuro falta de capacidade proliferativa na cultura destas células EOC. Vários métodos para criar suspensões de célula única de tumores sólidos existem actualmente, através de meios mecânicos ou de dissociação enzimática, contudo certas técnicas de produzir uma quantidade maior do resultado preferido ^8. Aqui, vamos mostrar que a digestão enzimática com dispase II resulta em uma recuperação eficaz de células EOC sem fibroblastos viáveis. As culturas EOC assim obtidos são altamente susceptíveis a manipulação genética e são também úteis em ensaios de rastreio de drogas, o que indica que estas culturas EOC são adequadas para muitas aplicações a jusante.

Protocolo

Declaração de Ética
Amostras sólidas de câncer de ovário foram obtidos a partir da Facilidade Universidade de Minnesota colheita de tecidos (TPF) após o Comitê de Revisão Institucional Board: Conselho Assunto Humano (IRB) de aprovação.

1. Setup Reagente

1. Prepare meio DMEM completo, completando DMEM com FBS a 10%, e 100 unidades de penicilina-estreptomicina. Armazenar o meio a 4 ° C e aquecer a 37 ° C antes de usar.
2. Alíquota dispase II em volumes separados de 5-10 ml para evitar congelamento múltipla descongela e armazenar a -20 ° C em um freezer sem nonfrost.

2. Recolha de Tecidos

1. Recolher amostras sólidas de cancro do ovário (~ 5 g de tamanho), no momento da cirurgia a partir de zonas macroscopicamente identificados como cancro por um patologista. Espécimes clínicos são de-identificados e registados de acordo com protocolos institucionais.
2. Coloque as amostras em um estéril, sctampa rew, polipropileno espécimes recipiente cheio com 30 ml de PBS gelado. Transportar as amostras de laboratório de patologia cirúrgica para o laboratório de pesquisa para o processamento no gelo, e dentro de 30 minutos a partir de coleta de amostras (Figura 1).

3. Processamento de Tecidos

1. Trabalhando sob condições estéreis, a transferência das amostras para uma placa de Petri (60 mm x 60 mm) contendo 10 ml de fresco, PBS gelado e utilizando uma lâmina de barbear esterilizada, ainda cortado em peças mais pequenas possíveis (2 mm ou menos) ( As figuras 2A e 2 B).
2. Transferir os tecidos picados num tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de pré-aquecido (37 ° C durante 30 min), dispase II (2,4 U / ml) em DMEM e incubar em 5% de CO ₂ e 37 ° C durante 30 min. Para assegurar uma digestão óptima dos espécimes, agitar manualmente a suspensão celular a cada 5 min.
3. Após 30 min de incubação, a transferência (usando10 ml de uma pipeta serológica) a suspensão de células em um filtro celular (malha de 70 um) colocados na parte superior de um tubo de 50 ml e aplica uma pressão suave contra a malha utilizando um êmbolo de seringa. Descartar qualquer tecido não dissociado (restante no topo da malha) e recolher a suspensão celular obtida no tubo de 50 ml estéril. Centrifugar a 320 xg durante 7 minutos a 4 ° C (Figura 3).
4. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM contendo 10% de FBS.
5. Incubar a suspensão de células em placas de Petri de 5% de CO ₂ e 37 ° C (Figura 4).
6. Mude o meio após 24 horas do início do cultivo. Isto permite a remoção de detritos celulares e a maioria dos eritrócitos presentes na cultura.
7. Troca da mídia a cada três dias para as duas semanas seguintes, após o que as culturas de EOC primário estão prontos para aplicações a jusante.

Resultados

Espécimes clínicos frescas de cancro do ovário são recolhidas após a cirurgia (Figura 1) e cortado em pequenos pedaços (Figuras 2A e 2B), que constituem a suspensão de células. Isto permite uma exposição óptima dos espécimes para o tratamento enzimático. Suspensão de células é exposto a digestão enzimática e foram incubadas a 37 ° C durante 30 min. Durante o tempo de incubação da suspensão torna-se cada vez mais turva (especialmente depois de cada ...

Discussão

Uma melhor compreensão da etiologia do câncer de ovário e de desenvolvimento é crucial para melhorar o resultado de mulheres afetadas por esta doença devastadora. Neste contexto, a utilização de estabelecida e "comercialmente disponível" linha de células de cancro do ovário, sem dúvida, tem sido extremamente útil. No entanto, hoje sabemos que linhas celulares de cancro não são representativos do tumor humano que originou, em muitos aspectos, incluindo a falta de heterogeneidade ^9,10. <...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS, sterile	Invitrogen	14190-144
Screw lid, polypropylene specimen container, sterile	Thermo Scientific	02 1090
DMEM medium, sterile	Invitrogen	11995-065
Fetal bovine serum, sterile	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicillin-streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122
Dispase II, sterile	Roche	04942 078 001
Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile	Fisher Scientific	forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D
Small dissecting scissors, sterile	Fisher Scientific	08-945
15 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352097
50 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352027
10 ml Serological pipette, sterile	Corning	13-678-11E
6 ml Syringe plunger, sterile	Tyco Healthcare	8881516911
Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile	BD Falcon	352350
5 cm Petri dish, sterile	Corning	430166
10 cm Petri dish, sterile	Corning	430167