Méthode pour l'obtention de cellules cancéreuses ovariennes primaires à partir d'échantillons solides

Résumé

Cette étude décrit un procédé détaillé pour l'isolement et la caractérisation de cellules de cancer ovarien primaire à partir de spécimens cliniques solides. Spécimens cliniques sur le cancer de l'ovaire sont soumis à une digestion enzymatique pour obtenir viable, libre fibroblastes cancer épithélial de l'ovaire (COE) de cellules très approprié pour des applications en aval.

Résumé

Des outils fiables pour enquêter sur l'initiation de cancer de l'ovaire et la progression sont nécessaires d'urgence. Bien que l'utilisation de lignées de cellules de cancer de l'ovaire reste un outil précieux pour la compréhension du cancer de l'ovaire, leur utilisation a de nombreuses limites. Il s'agit notamment de l'absence d'hétérogénéité et la pléthore de modifications génétiques associées à des passages in vitro prolongée. Ici, nous décrivons une méthode qui permet de créer rapidement des cellules de cancer ovarien primaire forment les échantillons cliniques solides collectés au moment de la chirurgie. Le procédé consiste à soumettre les échantillons cliniques à une digestion enzymatique pendant 30 minutes. La suspension de cellules isolées est autorisé à croître et peut être utilisé pour une application en aval, y compris le criblage de médicaments. L'avantage de l'ovaire primaires des lignées cellulaires de cancer sur des lignées cellulaires de cancer de l'ovaire est établi qu'ils sont représentatifs des échantillons cliniques spécifiques originaux dont ils sont dérivés et peuvent être dérivées de différents sites si primacancer de l'ovaire ry ou métastatique.

Introduction

Malgré sa faible incidence, le cancer de l'ovaire est le plus meurtrier des maladies gynécologiques et la cinquième cause de décès par cancer chez les femmes ^1,2. Ceci est principalement dû à l'absence d'outils et de modèles fiables qui récapitulent fidèlement l'initiation et la progression de la maladie ^3. La plupart de nos connaissances d'aujourd'hui sur le cancer de l'ovaire a été possible grâce à l'utilisation de cellules immortalisées ovariennes épithéliales de surface (IOS), des lignées de cellules de cancer de l'ovaire et les cellules cancéreuses ovariennes primaires récupérées à partir du liquide d'ascite ^4-7. Malheureusement, leur utilisation présente plusieurs limites, y compris un certain nombre de modifications génétiques et phénotypiques liées au processus d'immortalisation ou dans les passages in vitro et l'hétérogénéité de la population résultant de la préparation fluide ascite.

Par conséquent, les cellules ovariennes cancéreuses primaires dérivées à partir d'échantillons solides identifiables et spécifiques d'un cancer de l'ovaire représentent uniquoutil de e pour l'étude de la progression du cancer de l'ovaire.

Les principales difficultés rencontrées dans le ces cellules malignes obtention sont dues à une prolifération de cellules stromales ou les fibroblastes avec la perte de la viabilité et de l'absence prématurée de la capacité de prolifération dans la culture de ces cellules COE. Plusieurs méthodes pour créer une seule cellule suspensions de tumeurs solides existent actuellement, par des moyens mécaniques ou dissociation enzymatique, mais certaines techniques donnent une plus grande quantité de la solution privilégiée ^8. Ici, nous montrons que la digestion enzymatique à la dispase II entraîne une récupération efficace des cellules de SOE gratuit fibroblastes viables. Les cultures COE ainsi obtenus sont très sensibles à la manipulation génétique et sont également utiles dans des tests de dépistage de drogue, ce qui indique que ces cultures SOE sont adaptés à de nombreuses applications en aval.

Protocole

Déclaration d'éthique
Échantillons solides de cancer de l'ovaire ont été obtenus par le Fonds pour l'Université du Minnesota tissus sur les marchés publics (TPF) après Comité Institutional Review Board: Conseil de sujets humains (CISR) approbation.

Une. Configuration de réactifs

1. Préparer le milieu complet DMEM en la complétant avec du DMEM 10% FBS, et 100 unités de pénicilline-streptomycine. Stocker le milieu à 4 ° C et chaud à 37 ° C avant de l'utiliser.
2. Aliquote dispase II dans des volumes séparés de 5-10 ml pour éviter le gel multiples dégèle et conserver à -20 ° C dans un congélateur sans nonfrost.

2. Collection de tissus

1. Prélever des échantillons solides de cancer de l'ovaire (~ 5 g en taille) au moment de l'intervention chirurgicale à partir des zones macroscopiquement identifiés comme le cancer par un pathologiste. Les échantillons cliniques sont dé-identifiés et enregistrés conformément aux protocoles institutionnels.
2. Placer les échantillons dans un stérile, scREW couvercle, le polypropylène spécimens récipient rempli avec 30 ml de PBS glacé. Le transport des spécimens de laboratoire de pathologie chirurgicale au laboratoire de recherche pour le traitement de la glace, et dans les 30 minutes à partir de la collecte de l'échantillon (Figure 1).

3. Traitement des tissus

1. Travailler dans des conditions stériles, transférer les échantillons sur une boîte de Pétri (60 mm x 60 mm) contenant 10 ml de frais, PBS glacé et en utilisant une lame de rasoir stérile, outre les couper en plus petits morceaux possibles (2 mm ou moins) ( Figures 2A et 2B).
2. Transférer les tissus hachés dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml d'préchauffé (37 ° C pendant 30 min) dispase II (2,4 U / ml) dans du DMEM et incuber à 5% _de CO2 et à 37 ° C pendant 30 min. Pour assurer une digestion optimale des échantillons, agiter manuellement la suspension de cellules toutes les 5 min.
3. Après 30 min d'incubation, le transfert (en utilisantune pipette sérologique de 10 ml) de la suspension cellulaire sur un tamis cellulaire (70 um de maille) placé sur le dessus d'un tube conique de 50 ml et d'appliquer une légère pression contre la grille, avec un piston de la seringue. Jeter n'importe quel tissu non dissocié (restant sur le dessus de la maille) et recueillir la suspension cellulaire obtenue dans le tube de 50 ml conique stérile. Centrifuger à 320 g pendant 7 minutes à 4 ° C (figure 3).
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de DMEM contenant 10% de FBS.
5. Incuber la suspension de cellules dans une boîte de Petri à 5% de CO ₂ et 37 ° C (Figure 4).
6. Changer le milieu après 24 h de la plaque initiale. Ceci permet d'éliminer les débris cellulaires et la majorité des erythrocytes présents dans la culture.
7. Changer le milieu tous les trois jours pendant les deux semaines suivantes, après quoi les cultures de primaire EOC sont prêts pour des applications en aval.

Résultats

Échantillons cliniques fraîches de cancer de l'ovaire sont recueillies après une intervention chirurgicale (figure 1) et coupées en petits morceaux (Figures 2A et 2B) constituant la suspension cellulaire. Cela permet d'obtenir une exposition optimale des spécimens pour le traitement enzymatique. Suspension cellulaire est exposée à une digestion enzymatique et on a incubé à 37 ° C pendant 30 min. Au cours de la période d'incubation de la suspension...

Discussion

Une meilleure compréhension de l'étiologie du cancer de l'ovaire et le développement est crucial pour améliorer les résultats des femmes touchées par cette maladie dévastatrice. Dans ce contexte, l'utilisation d'établi et "disponible dans le commerce" lignée de cellules de cancer de l'ovaire a sans doute été extrêmement utile. Cependant, nous savons aujourd'hui que les lignées cellulaires de cancer ne sont pas représentatifs de la tumeur humaine qu'ils proviennent dans...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS, sterile	Invitrogen	14190-144
Screw lid, polypropylene specimen container, sterile	Thermo Scientific	02 1090
DMEM medium, sterile	Invitrogen	11995-065
Fetal bovine serum, sterile	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicillin-streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122
Dispase II, sterile	Roche	04942 078 001
Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile	Fisher Scientific	forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D
Small dissecting scissors, sterile	Fisher Scientific	08-945
15 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352097
50 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352027
10 ml Serological pipette, sterile	Corning	13-678-11E
6 ml Syringe plunger, sterile	Tyco Healthcare	8881516911
Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile	BD Falcon	352350
5 cm Petri dish, sterile	Corning	430166
10 cm Petri dish, sterile	Corning	430167