Способ получения первичных клеток рака яичников от твердых образцов

Резюме

Это исследование описывает подробный способ выделения и характеристики первичных клеток рака яичников от твердых клинических образцов. Рак яичников клинические образцы подвергаются ферментативного расщепления, чтобы получить жизнеспособную, фибробластов без эпителиального рака яичников (EOC) клеток высоко подходящий для последующих применений.

Аннотация

Надежные инструменты для исследования яичников инициацию и прогрессирование рака срочно необходимы. Хотя использование яичников линий раковых клеток остается ценным инструментом для понимания рака яичников, их использование имеет много ограничений. К ним относятся отсутствие неоднородности и множество генетических изменений, связанных с расширенной пассажей в пробирке. Здесь мы опишем метод, который позволяет быстро созданию первичных клеток рака яичников образуют твердые клинические образцы, собранные во время операции. Метод состоит в воздействии клинических образцов для ферментативного расщепления в течение 30 мин. Выделенный клеточной суспензии дают расти и могут быть использованы для последующей приложений, включая скрининга лекарственных средств. Преимущество первичных яичников линий раковых клеток более установленных яичников линий раковых клеток является то, что они являются представителями оригинальных конкретных клинических образцов они являются производными от и могут быть получены из различных сайтах будь примары или метастатическим раком яичников.

Введение

Несмотря на относительно низкий уровень заболеваемости, рак яичников является самой опасной из гинекологических заболеваний и пятой ведущей причиной смерти от рака среди женщин ^1,2. В основном это связано с отсутствием надежных инструментов и моделей, которые верой и правдой резюмировать возникновение и прогрессирование заболевания ^3. Большинство наших знаний сегодня о раке яичников стало возможным за счет использования увековечены яичников поверхности эпителиальных клеток (IOSEs), рак яичников клеточных линий и первичных клеток рака яичников, извлеченных из асцитической жидкости ^4-7. К сожалению, их использование имеет ряд ограничений в том числе ряд генетических и фенотипических изменений, связанных с процессом Иммортализация или в проходах пробирке и неоднородности населения в результате асцитической жидкости препарата.

Таким образом, первичные рака яичников клетки, полученные из идентифицируемых и конкретных твердых образцов рака яичников представляют собой Uniquэ инструментом для изучения яичника прогрессирование рака.

Основные трудности, связанные с получение этих злокачественных клеток обусловлены разрастанием стромальных клеток или фибробластов вместе с потере жизнеспособности и преждевременной отсутствия пролиферативной способностью в культуре этих EOC клеток. Существует несколько методов для создания одного клеточные суспензии из твердых опухолей существуют в настоящее время, с помощью механических средств или ферментативной диссоциации, однако некоторые методы дают большее количество предпочтительного результата ^8. Здесь мы показываем, что ферментативное расщепление с диспаза II приводит к эффективной восстановление жизнеспособных, фибробластов без EOC клеток. Полученные таким образом культуры EOC очень восприимчивы к генетической манипуляции и могут быть также использованы в тестах скрининга лекарственных средств, указывая, что эти EOC культур подходят для многих последующих применений.

протокол

Заявление по этике
Твердые образцы рака яичников были получены из университета Миннесоты ткани закупок фонда (ТПФ) после Экспертный совет организации Комитета: Human Тема Комиссия (IRB) одобрение.

1. Настройка Реагент

1. Подготовить всю DMEM среду, дополняя DMEM с 10% FBS, и 100 единиц пенициллина-стрептомицина. Хранить среды при 4 ° С и теплой до 37 ° C перед использованием.
2. Алиготе диспаза II на отдельные тома 5-10 мл, чтобы избежать многократного замораживания оттаивает и хранить при температуре -20 ° С в nonfrost без морозильной камеры.

2. Ткань Коллекция

1. Сбор твердых образцов рака яичников (~ 5 г в размере) на момент операции из районов макроскопически определены как рак патологоанатом. Клинические образцы де-идентифицированы и зарегистрированы в соответствии с институциональными протоколов.
2. Поместите образцы в стерильной, SCREW крышка, полипропилен образцов контейнер, наполненный 30 мл охлажденного льдом PBS. Транспорт образцы из хирургической лаборатории патологии в научно-исследовательской лаборатории для обработки на льду, и в течение 30 мин от сбора образцов (рис. 1).

3. Обработка ткани

1. Работа в стерильных условиях, передавать образцы на чашке Петри (60 мм х 60 мм), содержащей 10 мл свежей, охлажденной льдом PBS и с помощью стерильного лезвие, дальнейшее сокращение в мельчайшие кусочки возможных (2 мм или меньше) ( фиг.2А и 2 B).
2. Передача фарш ткани в 15 мл конической пробирке, содержащей 10 мл предварительно нагретого (37оС в течение 30 мин) диспазы II (2,4 U / мл) в DMEM и инкубировали в 5% CO ₂ и 37 ° С в течение 30 мин. Для обеспечения оптимального переваривания образцов, вручную агитировать клеточной суспензии каждые 5 минут.
3. После 30 мин инкубации, передачи (с использованием10 мл серологической пипеткой) Клеточную суспензию на клеточный фильтр (70 мкм меш) помещают сверху в 50 мл коническую пробирку и применить мягкое давление на сетке с помощью шприца. Отменить любые недиссоциированного ткани (оставшийся на верхней части меш) и собирают полученной суспензии клеток в 50 мл стерильные конические пробирки. Центрифуга при 320 мкг в течение 7 мин при 4 ° С (рис. 3).
4. Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS.
5. Выдержите клеточной суспензии в чашку Петри на 5% CO ₂ и 37 ° C (рисунок 4).
6. Изменение среды после 24 часов от первоначального посева. Это позволяет для удаления клеточных остатков и большинство эритроцитов, присутствующих в культуре.
7. Изменение среды каждые три дня в течение следующих двух недель, после которых культуры первичной EOC готовы для последовательных применений.

Результаты

Свежие клинические образцы рака яичников собраны после операции (рис. 1) и сократить на мелкие кусочки (рис. 2А и 2В), составляющих суспензии клеток. Это позволяет для оптимальной экспозиции образцов в ферментативной обработки. Клеточную суспензию подвергают ф...

Обсуждение

Лучшее понимание яичников этиологии рака и развития имеет решающее значение для улучшения результатов женщин, пострадавших от этой разрушительной болезни. В этом контексте использование создан и "продаже" яичников линии раковых клеток, несомненно, было чрезвычайно полезно. Тем ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS, sterile	Invitrogen	14190-144
Screw lid, polypropylene specimen container, sterile	Thermo Scientific	02 1090
DMEM medium, sterile	Invitrogen	11995-065
Fetal bovine serum, sterile	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicillin-streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122
Dispase II, sterile	Roche	04942 078 001
Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile	Fisher Scientific	forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D
Small dissecting scissors, sterile	Fisher Scientific	08-945
15 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352097
50 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352027
10 ml Serological pipette, sterile	Corning	13-678-11E
6 ml Syringe plunger, sterile	Tyco Healthcare	8881516911
Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile	BD Falcon	352350
5 cm Petri dish, sterile	Corning	430166
10 cm Petri dish, sterile	Corning	430167