고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

요약

이 연구는 고체 임상 검체에서 기본 난소 암 세포의 분리 및 특성에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 난소 암 임상 검체는 다운 스트림 애플리케이션에 매우 적합 가능한, 섬유 아세포없는 상피 난소 암 (EOC) 세포를 얻기 위해 소화 효소를 실시하고 있습니다.

초록

난소 암의 개시 및 진행을 조사하는 신뢰할 수있는 도구가 절실히 필요합니다. 난소 암 세포주의 사용이 난소 암을 이해하기위한 유용한 도구가 남아 있지만, 이들의 사용은 많은 제한이있다. 이러한 이질성의 부족 및 확장 체외 계대과 관련된 유전 변경의 과다 있습니다. 여기에서 우리는 기본 난소 암 세포의 빠른 구축을 허용하는 방법은 수술시에 수집 된 고체 임상 검체를 형성 기술한다. 상기 방법은 30 분 동안 효소 소화에 임상 검체를 행하여 이루어져있다. 격리 된 세포 현탁액을 성장시킨다 및 약물 스크리닝 하류 애플리케이션에 사용될 수있다. 설립 난소 암 세포주 이상의 일차 난소 암 세포주의 이점은 그들이 유래되고 다른 사이트 여부로부터 유도 될 수있는 일본어 특정 임상 검체의 대표 점이다 프리마공예 또는 전이성 난소 암.

서문

상대적으로 낮은 발병률에도 불구하고, 난소 암은 부인과 질환과 ^{여성, 2} 중 암 사망의 다섯 번째 주요 원인의 치명적인입니다. 이 충실히 질병 ^3의 개시 및 진행을 요점을 되풀이 신뢰할 수있는 도구와 모델의 부족에 주로 기인한다. 난소 암에 대한 우리의 지식 오늘날 대부분 ascitic 유체 ^4-7로부터 회수 불멸화 난소 표면 상피 세포 (잃었 지), 난소 암 세포주 및 일차 난소 암 세포의 사용을 통해 가능했습니다. 불행히도, 그들의 사용은 불멸화 과정 또는 체외 통로에 관련된 유전자와 표현형의 변화의 수와 ascitic 유체 준비로 인한 인구의 이질성 등 여러 가지 제한 사항이 있습니다.

따라서 난소 암의 식별과 특정한 고체 시료 유래 차 난소 암세포 UNIQU을 나타내는난소 암의 진행을 연구하는 전자 도구입니다.

획득이 악성 세포에 관련된 주요 문제는 생존의 손실이 EOC 세포의 배양에서 증식 능력의 조기 부족과 함께 간질 세포 또는 섬유 아세포의 증식에 기인한다. 고형 종양에서 단일 세포 현탁액을 만들 수있는 몇 가지 방법은 현재 기계적인 방법 또는 효소 분해를 통해, 그러나 특정 기술을 선호하는 결과 ^8의 큰 금액을 산출 존재한다. 여기, 우리는 표시가 가능한, 섬유 아세포 무료 EOC 세포의 효과적인 복구 디스 파제 II 결과에 소화 효소. 이렇게 얻어진 EOC의 문화 유전자 조작에 매우 민감하고 또한 약물 선별 검사에 유용하다, 이러한 EOC 문화가 다양한 다운 스트림 애플리케이션에 적합하다는 것을 나타낸다.

프로토콜

윤리 정책
난소 암의 고체 시료는 기관 심사위원회위원회 후 미네소타 대학의 조직 조달 시설 (TPF)으로 하였다 : 인간의 제목위원회 (IRB)의 승인을.

1. 시약 설치

1. 10 % FBS, 100 단위 페니실린 - 스트렙토 마이신과 DMEM을 보완하여 완전한 DMEM 매체를 준비합니다. 4 ° C에서 미디어를 저장하고 따뜻한 37 ° C는 사용하기 전에.
2. 다수의 동결을 방지하기 위해 5 ~ 10 ㎖를 별도의 볼륨으로 나누어지는 디스 파제 II는 nonfrost없는 냉동고에 -20 ° C에서 해동 및 저장.

2. 조직 컬렉션

1. 거시적으로 병리학 자에 의해 암으로 확인 된 지역에서 수술시 난소 암 (크기 ~ 5의 g)의 고체 시료를 수집합니다. 임상 표본 드 식별 및 기관 프로토콜에 따라 등록됩니다.
2. 멸균, 사우스 캐롤라이나에있는 표본을 배치REW 뚜껑, 폴리 프로필렌은 빙냉 PBS 30 ㎖로 채워진 용기 표본. 시험편 컬렉션에서 30 분 (그림 1) 내에서, 얼음 처리를 위해 연구소에 외과 병리 실험실에서 시료를 수송한다.

3. 조직 처리

1. 멸균 조건 하에서 작동하는 페트리 접시 위에 시료 (60mm X 60mm) 신선 빙냉 PBS 10 ㎖를 함유하고 추가로 (2 ㎜ 이하)가 가능한 작은 조각으로 잘라 멸균 면도날을 사용하여 (전송 도 2a 및도 2 B).
2. DMEM에 디스 파제 II (2.4 U / ㎖) (30 분 37 ° C) 데워진 10 ㎖를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송하고 30 분 동안 5 % CO _2와 37 ° C에서 알을 품다. 표본의 최적의 소화를 보장하기 위해, 수동으로 세포 슬러리마다 5 분을 선동.
3. 30 분 배양, 전송 (사용 후10 ㎖의 혈청 피펫) 셀 스트레이너 (70 μM 메쉬) 상으로 세포 슬러리를 50 ㎖ 원추형 튜브의 상단에 배치하고 시린지 플런저를 사용하여 메시에 대해 완만 한 압력을 적용 할 수있다. (메쉬의 상단에 남아있는) 모든 해리되지 않은 조직을 무시하고 50 ㎖ 멸균 원뿔 관에서 얻은 세포 현탁액을 수집합니다. 4 ° C에서 7 분 (그림 3)에 대한 320 XG에 원심 분리기.
4. 상층 액을 버리고 10 % FBS를 함유하는 DMEM으로 10 ㎖ 중에 세포 펠렛을 재현 탁.
5. 셀 5 % CO _2에서 배양 접시에있는 서스펜션과 37 ° C (그림 4)을 품어.
6. 초기 도금에서 24 시간 후 매체를 변경합니다. 이 세포 파편의 제거 및 문화에 존재하는 적혈구의 대부분을 수 있습니다.
7. 매체에게 차 EOC의 문화가 다운 스트림 애플리케이션을위한 준비가 된 후 다음 두 주 동안 매 3 일, 변경합니다.

결과

난소 암의 임상 검체는 신선한 (도 1)는 수술 후 수거하고, 세포 슬러리를 구성하는 작은 조각 (도 2a 및 2b)에서 절단된다. 이 효소 치료에 대한 표본의 최적의 노출을 할 수 있습니다. 셀룰라 슬러리 소화 효소에 노출하고, 30 분간 37 ℃에서 배양된다. 배양 시간 동안 슬러리 (특히 각 교반 후) 점차 구름이되고이 조직 세분화의 표시이다. 배양 시간의 끝에서, 슬...

토론

난소 암의 병인학 및 개발의 더 나은 이해가이 파괴적인 질환에 의해 영향을 여성의 결과를 개선하기 위해 매우 중요하다. 이러한 상황에서의 사용은 설립 "시판되는"난소 암 세포주는 의심 할 여지없이 대단히 유용왔다. 그러나 오늘 우리는 암 세포 라인들은 이성 ^9,10의 부족 등 많은 측면에서 시작된 인간의 종양을 반영하지 않고 있다는 것도 알고있다.

여?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS, sterile	Invitrogen	14190-144
Screw lid, polypropylene specimen container, sterile	Thermo Scientific	02 1090
DMEM medium, sterile	Invitrogen	11995-065
Fetal bovine serum, sterile	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicillin-streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122
Dispase II, sterile	Roche	04942 078 001
Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile	Fisher Scientific	forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D
Small dissecting scissors, sterile	Fisher Scientific	08-945
15 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352097
50 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352027
10 ml Serological pipette, sterile	Corning	13-678-11E
6 ml Syringe plunger, sterile	Tyco Healthcare	8881516911
Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile	BD Falcon	352350
5 cm Petri dish, sterile	Corning	430166
10 cm Petri dish, sterile	Corning	430167