Katı Örneklerinin From İlköğretim Yumurtalık Kanseri Hücreleri alma için yöntem

Özet

Bu çalışma, bir katı klinik örneklerden birincil yumurtalık kanser hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir yöntemi tarif etmektedir. Yumurtalık kanseri klinik örnekler alt uygulamalar için son derece uygun olan uygun bir, fibroblast içermeyen epitelyal yumurtalık kanseri (EOC) hücreleri elde etmek için enzimatik sindirme tabi tutulur.

Özet

Yumurtalık kanseri başlamasını ve ilerlemesini soruşturma için güvenilir araçlar acilen ihtiyaç vardır. Yumurtalık kanseri hücresi hatlarının kullanımı yumurtalık kanseri anlamak için değerli bir araç devam ederken, bunların kullanımı, birçok sınırlamalar vardır. Bu heterojenlik eksikliği ve genişletilmiş in vitro pasaj ile ilişkili genetik değişikliklerin bolluk vardır. Burada birincil yumurtalık kanseri hücrelerinin hızlı kurulması için bir yöntem sağlar: bir ameliyat sırasında toplanan katı klinik örnekler meydana açıklar. Yöntem, 30 dakika boyunca enzimatik sindirme klinik örnekleri tabi oluşur. İzole edilmiş hücre süspansiyonu büyümeye bırakılır ve ilaç taraması gibi alt uygulama için kullanılabilir. Kurulan yumurtalık kanseri hücre hatları üzerinden birincil yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin avantajı, türetildikleri ve farklı sitelerde olup türetilebilir orijinal spesifik klinik numuneler için temsili olmasıdır primary veya metastatik over kanseri.

Giriş

Nispeten düşük insidansı rağmen, yumurtalık kanseri jinekolojik hastalıklar ve kadınlarda ^1,2 arasında kanser ölümlerinin beşinci önde gelen nedeni arasında en ölümcül olanıdır. Bu sadakatle hastalığın ^3'ün başlangıcı ve ilerlemesini özetlemek güvenilir araçlar ve model eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Yumurtalık kanseri hakkındaki bilgi, bugün çoğu asitik sıvı ^4-7 geri ölümsüzleştirilmiş over yüzey epitel hücreleri (kaybetmez), yumurtalık kanseri hücre hatları ve primer yumurtalık kanser hücrelerinin kullanımı ile mümkün olmuştur. Ne yazık ki, bunların kullanımı ölümsüzleşme işlemi ile ya da in vitro pasajlar ilişkili genetik ve fenotipik bir dizi değişiklik ve asitik sıvı preparattan elde nüfusun heterojenliği dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalara sahiptir.

Bu nedenle, yumurtalık kanseri tanımlanabilir ve belirli katı örneklerden türetilmiş primer yumurtalık kanseri hücrelerinin uniqu temsilyumurtalık kanserinin ilerlemesini eğitim için e araçtır.

Bu habis hücrelerin elde edilmesi ile ilgili başlıca zorluklar canlılık kaybına ve EOC, bu hücrelerin kültürü içinde çoğalma kapasitesinin vaktinden önce eksikliği ile birlikte stromal hücreleri ya da fibroblastlarının bir büyüme kaynaklanmaktadır. Katı tümörlerden tek hücre süspansiyonları oluşturmak için çeşitli yöntemler halen mekanik yollarla ya da enzimatik ayrışma yoluyla, ancak bazı teknikler tercih edilen sonucun ⁸ daha büyük bir miktarda, verim vardır. Burada, gösteriyor ki uygun, fibroblast içermeyen EOC hücrelerinin etkili bir kurtarma dispase II sonuçları ile enzimatik sindirim. Bu şekilde elde edilen kültürler EOC genetik manipülasyonu için son derece hassastır ve aynı zamanda, ilaç tarama deneylerinde yararlıdır, bu EOC kültürler çok alt uygulamalar için uygun olduğuna işaret etmektedir.

Protokol

Etik Bildirimi
Yumurtalık kanseri Katı numuneler Kurumsal Değerlendirme Kurulu Komite sonra Minnesota Üniversitesi Doku Alımı Tesisi (TPF) elde edilmiştir: İnsan Konu Kurulu (KİK) onayı.

1.. Reaktif Kur

1. % 10 FBS ve 100 birim penisilin-streptomisin ile takviye DMEM ile tam bir DMEM ortamıyla hazırlayın. 4 ° C 'de sıcak bir orta depolamak ve 37 ° C, kullanımdan önce.
2. Birden fazla donma önlemek için 5-10 ml ayrı cilt içine kısım dispase II nonfrost ücretsiz dondurucuda -20 ° C'de çözülür ve mağaza.

2. Doku Toplama

1. Makroskopik olarak bir patolog tarafından kanser gibi tanımlanan alanlarda cerrahi sırasında yumurtalık kanseri (boyut olarak ~ 5 g) katı madde örnekleri toplamak. Klinik örnekler-de tespit ve kurumsal protokollere göre kayıtlıdır.
2. Steril, sc örnekleri yerleştirinrew kapak, polipropilen, buzla soğutulmuş PBS nin 30 ml 'si ile doldurulmuş bir kap ve numune. Ve numune toplama 30 dakika (Şekil 1) içinde, buz üzerinde işlem için araştırma laboratuvarında için cerrahi patoloji laboratuvar numunelerini taşımak.

3. Doku İşleme

1. Steril koşullar altında çalışarak, bir Petri kabı üzerine numune (60 mm x 60 mm), taze, buz soğukluğunda 10 ml PBS ihtiva eden ve bundan başka (2 mm veya daha az) mümkün olan en küçük parçalar halinde kesilmiş, bir steril bir jilet kullanılarak (aktarmak Şekiller 2A ve 2B).
2. DMEM dispase II (2.4 U / ml) (30 dakika boyunca 37 ° C) önceden ısıtılmış 10 ml içeren, 15 ml konik tüp içine kıyılmış dokuları aktarın ve 30 dakika boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Örneklerin optimal sindirim sağlamak için, el ile hücre karışımının her bir 5 dakika çalkalayın.
3. 30 dakika inkübasyon, transferi (kullandıktan sonra10 ml serolojik pipet) bir hücre süzgecinden (70 um mesh) üzerine hücre bulamacı, 50 ml konik tüp üstüne yerleştirilir ve bir şırınga pistonunun kullanılarak örgü karşı hafif bir basınç uygulamak. (Mesh üstünde kalan) herhangi bir çözülmemiş doku atın ve 50 ml konik bir tüp içinde, steril, elde edilen hücre süspansiyonu toplar. 4 ° C 'de, 7 dakika (Şekil 3) için 320 x g'de santrifüjleyin.
4. Süpernatant atılır ve% 10 FBS içeren DMEM, 10 ml hücre pelletini.
5. Hücre% 5 _CO2 ile bir Petri tabağına ve süspansiyon 37 ° C de (Şekil 4) inkübe edin.
6. Ilk kaplama 24 saat sonra, ortam, değiştirin. Bu, hücre kalıntılarının uzaklaştırılmasından ve kültür içinde mevcut olan eritrositlerin çoğunluğu için izin verir.
7. ORTA birincil EOC'nin kültürleri aşağı uygulamalar için hazır sonra aşağıdaki iki hafta boyunca her üç günde bir değiştirin.

Sonuçlar

Yumurtalık kanseri Taze klinik örnekleri (Şekil 1), ameliyat sonrası toplandı ve hücre karışımın küçük parçalar oluşturan (Şekil 2A ve 2B) kesilir. Bu, enzimatik tedaviye numunelerin uygun poz sağlar. Hücre bulamacı enzimatik sindirme maruz bırakılmış ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Inkübasyon süresi boyunca bulamaç (özellikle her ajitasyon sonra) giderek daha bulanık hale gelir ve bu doku ayrıştırma bir işaretidir. İ...

Tartışmalar

Yumurtalık kanseri etiyolojisi ve gelişme daha iyi anlaşılması, bu yıkıcı hastalıktan etkilenen kadınların sonucunu iyileştirmek için çok önemlidir. Bu bağlamda, kullanılmasıdır kurulmuş ve "ticari olarak temin edilebilen" yumurtalık kanseri hücre çizgisi şüphesiz son derece yararlı olmuştur. Ancak, bugün biz kanseri hücre hatları onlar heterojenitenin ^9,10 eksikliği gibi birçok açıdan kökenli insan tümör temsilcisi olmadığını biliyorum.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS, sterile	Invitrogen	14190-144
Screw lid, polypropylene specimen container, sterile	Thermo Scientific	02 1090
DMEM medium, sterile	Invitrogen	11995-065
Fetal bovine serum, sterile	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicillin-streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122
Dispase II, sterile	Roche	04942 078 001
Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile	Fisher Scientific	forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D
Small dissecting scissors, sterile	Fisher Scientific	08-945
15 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352097
50 ml Conical capped tubes, sterile	BD Falcon	352027
10 ml Serological pipette, sterile	Corning	13-678-11E
6 ml Syringe plunger, sterile	Tyco Healthcare	8881516911
Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile	BD Falcon	352350
5 cm Petri dish, sterile	Corning	430166
10 cm Petri dish, sterile	Corning	430167