Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

Summary

שתואר כאן הוא שיטה לאיתור וללכמת חלבוני קרום חיצוני של המיטוכונדריה ידי immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסמים וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטה זו ניתנת להארכה על מנת להעריך היבטים פונקציונליים של אוכלוסיות המיטוכונדריה.

Abstract

שיטות לאיתור ולמעקב אחר רכיבי חלבון קרום חיצוניים של המיטוכונדריה ברקמות של בעלי חיים הן חיוניות כדי ללמוד פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מתאר טכניקה שבה מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסם הם immunolabeled ונותחה על ידי cytometry זרימה. המיטוכונדריה הוא מבודד מחוט השדרה של מכרסמים ונתונים לצעד העשרה מהיר כדי להסיר מיאלין, חומר מזהם ביותר של שברים במיטוכונדריה הוכנו מרקמת עצבים. אז מיטוכונדריה המבודדת מסומנות עם נוגדן של בחירה ונוגדנים משני מצומדות fluorescently. ניתוח על ידי cytometry זרימה מאמת את טוהר היחסי של הכנות המיטוכונדריה על ידי צביעה עם צבע ספציפי של המיטוכונדריה, ואחריו איתור וכימות של חלבון immunolabeled. טכניקה זו היא מהירה, לכימות ותפוקה גבוהה, המאפשר לניתוח של מאות אלפי מיטוכונדריה לדגימה. זה ישים להערכת p רומןroteins על פני השטח של המיטוכונדריה בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, כמו גם חלבונים שעשויות להפוך mislocalized לאברון זה בפתולוגיה. חשוב לציין, בשיטה זו ניתן מצמידים את צבעי מחוון ניאון כדי לדווח על פעילויות מסוימות של אוכלוסיות המיטוכונדריה ואינה ריאלי למיטוכונדריה ממערכת העצבים המרכזית (מוח וחוט השדרה), כמו גם בכבד.

Introduction

המיטוכונדריה הם אברונים מאוד דינמיים שעוברים סבבים רבים של ביקוע והיתוך, מועברים לאתרים של ביקוש לאנרגיה גבוהה ולהגיב במהירות לגירויים פיסיולוגיים ^1. מאז הוא מוכר מיטוכונדריה שיותר ויותר בתוך רקמות שונות, תאים סלולריים שונים אפילו, יש לי פרופילים תפקודיים שונים, יש צורך בשיטות חדשות לזיהוי תת המיטוכונדריה השונה אלה.

מיקרוסקופית מספקת אמצעי לפיו ניתן דמיין המיטוכונדריה פרט ואת הנוכחות של חלבון באו במיטוכונדריה יכול להיקבע על ידי immunofluorescence ^2. עם זאת, ניתוח כמותי בשיטה זו הוא עבודה אינטנסיבית ומתאים יותר לניסויים באמצעות שורות תאים הונצחו או עיקריות. המחקר של המיטוכונדריה פרט נגזרת מרקמות הוא באופן משמעותי יותר קשה ורוב השיטות אינן מאפשרות זיהוי קל של תת המיטוכונדריה במקביל לevaluני של פונקציה של המיטוכונדריה ^3.

כדי להתמודד עם המשוכה הזאת, שיטה חדשנית לimmunolabel מיטוכונדריה מבודדת מרקמות מכרסמים ולאחר מכן נותחה על ידי cytometry זרימה פותח. זה מאפשר לאיתור והכימות של חלבונים מקומיים לקרום החיצוני של המיטוכונדריה, אשר בהשוואה לניתוח על ידי מיקרוסקופ המהיר, היא הרבה פחות עבודה אינטנסיבית ומאפשרת הניתוח של אלפי מיטוכונדריה במדגם יחיד. assay זה יכול להיות מיושם כדי לפקח על הגורל וכמות היחסית של חלבוני קרום החיצוניים של המיטוכונדריה שנחשבים לconstitutively נוכח במיטוכונדריה, הגיוס של חלבונים על פני השטח של המיטוכונדריה, או זיהוי של חלבוני mislocalized למיטוכונדריה במצבים פתולוגיים. יתר על כן, השילוב של צבעי מחוון ניאון קונבנציונליים מאפשר ההערכה בו זמנית של היבטים מסוימים של תפקוד המיטוכונדריה בהמיטוכונדריה שונהאוכלוסיות.

Protocol

בעלי חיים המשמשים במחקר זה, טופלו לפי קפדן לפרוטוקול (N08001CVsr) שאושר על ידי de l'אוניברסיטת מונטריאול ועדת מרכז דה המשוכללת והנדירה מרכז du Hospitalier (CRCHUM) המוסדית להגנה על בעלי חיים העוקב תקנים לאומיים כפי שתואר על ידי הקנדי מועצה על טיפול בבעלי חיים (CCAC).

הכן את כל חומרים כימיים הנדרשים לביצוע פרוטוקול זה (טבלת 1). ניתן למצוא את כל הפרטים נוספים בנוגע לציוד, אספקה ​​וספקים ברשימה של חומרים.

טבלת 1 יצירות הצפת.

1 אוסף של חוט השדרה עכברוש

1. עמוק לטשטש את העכברוש (ספראג Dawley) עם isoflorane 4%. ודא הרדמה על ידי היעדר רפלקס על צביטה של ​​הבכפו דואר. להרדים את העכברוש על ידי עריפת ראש באמצעות הגיליוטינה. שיטה זו של המתת חסד עדיפה על פני שעלול לעוות את חוט השדרה, אחרים.
2. חותך את העור של הגב לחשוף את עמוד השדרה. חותך את עמוד השדרה במספריים עצם בדיוק מעל עצם האגן. דמיין את הפתיחה של עמוד השדרה.
3. הכנס מזרק 10 מ"ל, עם טיפ 200 μl פיפטה (מצורף באמצעות המסת מעט מעל להבה), מלא בופר פוספט (PBS), לעמוד השדרה.
4. לשטוף את חוט השדרה על ידי מריחת כמות בינונית של לחץ לבוכנה.
5. אם כל דם נמצא על חוט השדרה, לשטוף עם PBS לפני שתמשיך לשלב הבא.
   הערה: שיטה זו גם אומתה למוח ובכבד. אם כולל רקמות אלה, לאסוף מחצית המוח מהחולדה מורדמים וחתיכת כבד במשקל שווה לחוט השדרה. כל הצעדים אחרים יישארו זהים.

.2 בידוד של חוט השדרה Mitochondria (מעובד מתוך אל ונדת ולד ואח. ⁴⁾

1. לאסוף את כל חוט השדרה שלם ומקום בhomogenizer זכוכית 5 מ"ל עם 5 כרכים (~ 3.25 מ"ל) Homogenization חוצץ (HB). להתאוששות אופטימלית של המיטוכונדריה המבודדת, לבצע את כל הצעדים על קרח או בחדר קר. Homogenize רקמה ביד עד שלא חתיכות גדולות של רקמה תישאר, שמונה כ שבץ. הנח homogenate בשני (2 מ"ל) או שלושה (1.7 מ"ל) microcentrifuge צינורות. צנטריפוגה XG 1,300 10 דקות ב 4 ° C בmicrocentrifuge המעבדתיים.
2. להתאושש supernatant ומקום בצינור ultracentrifuge 5 מ"ל. הוספת HB 750 μl (~ 0.5 כרכים) לצינור microcentrifuge המכיל גלולה ובעדינות resuspend גלולה. צנטריפוגה וresuspension חזור על השלבים עוד פעמיים. בריכה כל supernatants (S1A וS1b) לתוך צינור ultracentrifuge 5 מ"ל מעל. צעד זה משמש להסרת קטנה פסולת.
3. צנטריפוגה נקוותה S1 באמצעות ultracentrifuge מצויד בריקבון דלי מתנדנדאו ו צנטריפוגות ב XG 17,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C.
4. שמור supernatant (S2) לעיבוד נוסף אם חלק cytosolic הוא עניין (לדוגמא לניתוח כתם מערבי). Resuspend גלולה (P2), את החלק היחסי של המיטוכונדריה הגולמי, בHB מ"ל 4 + 50 מ"מ KCl. צנטריפוגה XG 17,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C בהרוטור דלי מתנדנד. בטל supernatant ועדינות resuspend גלולה (P3) ב800 HB μl.
   הערה: המיטוכונדריה נשטפים עם HB + 50 מ"מ KCl כדי להסיר כל מזהמי mitochondrially הקשורים שאינם ספציפיים.
5. בצינור ultracentrifuge 5 מ"ל חדש, להוסיף μl בדיוק 800 של גלולה מושעה (P3).
6. לצינור הזה להוסיף, 200 μl של iodixanol (בינוני שיפוע צפיפות), ובכך ליצור ריכוז סופי של 12% iodixanol. מערבבים את התוכן של הצינור בעדינות, אך ביסודיות באמצעות pipetting עם P1000. תוספת של iodixanol הראשון, ולאחר מכן גלולה resuspended (P3) עשויות להיות עדיפות כדי להקל על ערבוב יסודי. צנטריפוגה בultracentrifuge מצויד בהרוטור דלי מתנדנד ב17,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.
7. הערה: הכבד אינו מכיל מיאלין ולכן בשלב זה הוא לא הכרחי אם רק הכבד נמצא בתהליך עיבוד. עם זאת, אם כבד נמצא בתהליך עיבוד במקביל למיטוכונדריה CNS, מומלץ לטפל בכל הרקמות באופן שווה.
8. לשאוב את שכבת המיאלין בחלק העליון של הצינור ובזהירות להסיר ולסלק supernatant. גלולה עשויה להיות רופפת. Resuspend גלולה ב4 HB מ"ל. צנטריפוגה שוב ב17,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant וresuspend גלולה ב4 HB מ"ל. חזור על צנטריפוגה ולהסיר את supernatant.
9. Resuspend גלולה הסופי (P7) ב100-200 HB μl ולהעביר לצינור 1.7 מ"ל microcentrifuge. מדגם זה מכיל מיטוכונדריה המבודדת.
10. המשך לכימות חלבון. לדלל דגימות והעקומה סטנדרטית ב2% סולפט dodecyl נתרן (SDS), כדי להבטיח solubilization נאות של duri מיטוכונדריהכימות חלבון ng.

.3 Immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת לcytometry הזרימה

1. עבור כל תערובת כתמים להיבדק, פיפטה 25 מיקרוגרם של מיטוכונדריה המבודדת לתוך צינור 1.7 מ"ל microcentrifuge. כולל מדגם בלא כתם בכל ניסוי; ועבור כל נוגדן, הקפד לכלול מדגם לשליטת אלוטיפ המתאים.
2. צנטריפוגה ב XG 17,000 עבור 2 דקות ב 4 ° C בmicrocentrifuge ספסל העליון.
3. הסר supernatant וresuspend מיטוכונדריה המבודדת ב50 μl המיטוכונדריה חוצץ (M Buffer) בתוספת 10% BSA חופשי חומצות שומן ל15 דקות ב 4 ° C (צעד חסימה).
   הערה: במהלך תיוג, לבצע incubations במקרר ב 4 מעלות צלזיוס.
4. הוספת נוגדן ראשוני (ארנב נגד Mfn2, 20 מיקרוגרם למ"ל) לצינור ודגירה של 30 דקות ב 4 ° C..
   הערה: קביעת ריכוז אופטימלי של כל נוגדן באופן אמפירי על ידי טיטרציה. בשל שונות בריכוז ו / או purity, הרבה שונה של אותו הנוגדן מאותו היצרן עלול להוביל לתוצאות שונות; לכן טיטרציה נחוצה לכל מגרש חדש של נוגדן.
5. לשטוף את הנוגדן מאוגד עיקרי: צנטריפוגה ב 17,000 XG למשך 2 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ועדינות resuspend גלולה ב200 μl M הצפת. צנטריפוגה ב XG 17,000 עבור 2 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant וresuspend גלולה ב50 μl M הצפת.
6. הוספת נוגדנים משני (נגד הארנב IgG החמור Phycoerythrin (PE), 0.5 מיקרוגרם למ"ל) לצינור ודגירת דגימות ל30 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
7. לשטוף את הנוגדנים משני מאוגדים: צנטריפוגה ב 17,000 XG למשך 2 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant וresuspend גלולה ב200 μl M הצפת. צנטריפוגה ב XG 17,000 עבור 2 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant וresuspend גלולה ב500 μl M הצפת.
8. כדי להבטיח אירועים נמצאים במיטוכונדריה עובדה, מיטוכונדריה כתם מבודד עםצבע מיטוכונדריה ספציפי ניאון ל15 דקות ב RT, המוגן מפני אור. אם הכתמה של פרמטרים אחרים תפקודיים (פוטנציאל הטרנסממברני המיטוכונדריה או ייצור סופראוקסיד) היא רצויה, המשך לשלב .4 אם לא, המשיכו לשלב 5 לרכישה.
   הערה: חשוב לוודא שספקטרום הפליטה של ​​הנוגדנים משני בקנה אחד עם זו של הצבעים הפונקציונליים. לדוגמא, אם אימות טוהר המיטוכונדריה עם צבע מסחרי עם תכונות ספקטרליות דומות לפוטנציאל FITC והטרנסממברני עם תיל אסטר Tetramethylrhodamine (TMRM), נוגדנים משני קיימא יהיה allophycocyanin (APC: ננומטר אקס 650 / Em 660 ננומטר). להוסיף בקרות פיצויים, כלומר, מדגם immunolabeled או מוכתם עם fluorophore יחיד, כאשר החלים.
9. מעבירים צינור מתאים לזרימת טעינת cytometer. (כדי להקל על גודל המדגם הקטן, צינור microtiter ממוקם בתוך 3 מ"ל לזרום cytometer צינור.) שמור על דגימות קרח ולפנות מייד ללזרום cytometer לרכישה.

.4 Assaying מיטוכונדריאלי הטרנסממברני פוטנציאלי ומיטוכונדריאלי Superoxide ייצור על ידי cytometry הזרימה

1. ודא שיש לי מיטוכונדריה המבודדת פוטנציאל הטרנסממברני שלם על ידי צביעה עם 100 ננומטר TMRM (548 ננומטר / ננומטר 574 Em Ex) ^5, בשלב 3.8, ל15 דקות ב RT, מוגנות מפני אור. לשם השוואה של פוטנציאל הטרנסממברני בין דגימות ואוכלוסיות, שימוש בריכוזים שאינן מרווה / תחתונה של TMRM (1 עד 30 ננומטר), עשוי להיות מתאים יותר ^6.
   1. כביקורת מכתים TMRM, מיטוכונדריה המבודדת כתם עם 100 ננומטר TMRM בנוכחות של הידרזין פניל ​​מ-כלורו ציאניד קרבוניל 100 מיקרומטר (CCCP), uncoupler המיטוכונדריה שdepolarize מיטוכונדריה. הריכוז של CCCP נדרש depolarize מיטוכונדריה עשוי להיות פחות אם ריכוזים נמוכים יותר של צבע משמשים.
2. ודא שמיטוכונדריה המבודדת לייצר סופראוקסיד המיטוכונדריה ידי staining עם מחוון סופראוקסיד המיטוכונדריה מתאים ^7, גם בשלב 3.8, ל15 דקות ב RT, מוגנות מפני אור.
   1. כביקורת לייצור סופראוקסיד המיטוכונדריה, מיטוכונדריה המבודדת כתם עם צבע בנוכחות 10 מיקרומטר Antimycin, מעכב של הקומפלקס III של שרשרת הנשימה שתגביר את ייצור סופראוקסיד המיטוכונדריה.

.5 רכישה וניתוח של Immunolabeled מבודד המיטוכונדריה על ידי cytometry הזרימה

1. מכשיר להגדיר: מתחי החלף ליניארי כדי להיכנס למצב כדי להקל על ניתוח של מיטוכונדריה המבודדת ומתחים שנקבעו (FSC: 450; SSC: 250). להבטיח כי אירועים נאספים בFSC-מצב (אזור), כמו גם FSC-W (רוחב) וFSC-H (גובה), כדי להיות מסוגל להוציא כפילויות (כלומר, שני אירועים, שעוברים דרך גלאים באותו הזמן ) באוסף של הודעה נתונים ניתוח. הגדר את מספר האירועים שייגבה ל100,000. לרכוש בקרות פיצוי, אם ישים.
2. רכישת נתונים: לפני רכישת נתונים, להימנע vortexing דגימות. במקום לערבב בעדינות על ידי הקשה על צינור. בתחילה לאסוף אירועים בלחץ נמוך, בgating. שער באוכלוסייה. התאם מתחים של היסטוגרמות בהתאם, בדרך כלל השיא של המדגם בלא כתם יהיה מתאים לעשור השני (10 ^2). ברגע שהשערים הוקמו, ודגימות שנמצאות בעיבוד, הלחץ יכול להיות מופעל עד גבוה.
3. ניתוח: דמיין כפילויות על ידי התוויית FSC-W לעומת FSC. לזהות singlets וכפילויות. השער בsinglets. בחר את אוכלוסיית המיטוכונדריה על ידי gating על אירועים שהם מוכתמים חיובי עם צבע המיטוכונדריה סלקטיבי.
4. לקבוע תיוג רקע משליטת אלוטיפ. שימוש במדגם שליטת אלוטיפ, לקבוע את אחוז תיוג אוכלוסיית המיטוכונדריה החיובי לנוגדני Mfn2.

תוצאות

מיטוכונדריה נובעת ממייתרי השדרה עכברוש ניתן immunolabeled עם נוגדן הממוקד לMitofusin2 (Mfn2), חלבון מעורב באיחוי של הקרום החיצוני של המיטוכונדריה ^8. בעקבות בידוד ותיוג עם נוגדן ספציפי Mfn2 ונוגדנים משני מצומדות fluorescently, מיטוכונדריה מעובדות על ידי cytometry זרימה (איור 1). ב...

Discussion

זה בא לידי ביטוי יותר ויותר כי המיטוכונדריה הן שחקני מפתח בשני פיזיולוגיה ומחלות נורמליות. בעוד immunoblotting יכול לקבוע אילו חלבונים נמצאים בתוך המיטוכונדריה או על פני השטח של המיטוכונדריה במצב מסוים, דיווחים בשיטה זו בממוצע של האוכלוסייה כולה. שיטה זו לא יכולה להניב מיד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Charles River	Strain code 400	Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.
Dounce homogenizer	Kontes Glass Co.	885450-0022	Duall 22
Microcentrifuge	Thermo Scientific		Sorvall Legend Micro 17 R
Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	344057	Transparent, thin walled
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific		Sorvall WX UltraSeries
AH-650 rotor and buckets	Thermo Scientific
Opti-prep	Axis-Shield	1114542	Iodixanol, density gradient medium
Fatty acid free Bovine Serum Albumin	Sigma	A8806	Must be fatty acid free for mitochondria
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma	S9637
Rabbit anti-Mitofusin2 antibody	Sigma	M6319
Rabbit IgG	Jackson Immuno Research	011-000-003
Anti-Rabbit IgG PE	eBioscience	12-4739-81
Micro titer tube	Bio-Rad	223-9391	For sample acquisition by flow cytometry
MitoTrackerGreen (MTG)	Invitrogen	M7514	100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM	Invitrogen	T668	100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP	Sigma	C2759
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008	5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm
Antimycin A	Sigma	A8874
LSR II flow cytometer	BD
BD FACSDiva Software	BD
FlowJo	TreeStar Inc.		Software used for analysis
BCA protein assay kit	Pierce/Thermo Scientific	23225	Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS