Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

Summary

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Abstract

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Introduction

טוקסין החיידק Clostridium מייצר רעל עצב טוקסין, אחד מהרעלים הביולוגיים החזקים ביותר הידוע לאדם ^1. ישנם 7 קפסיד bont מובהקים (בונט / AG). בונט / A-גאל לגרום שיתוק בצומת העצבית-שהרירית בשל proteolysis המורכבת מלכודת ^2,3. proteolysis המלכודת מונעת איחוי שלפוחית-קרום מוליך עצבי, ולכן לוקים הנוירוטרנסמיטר exocytosis ^4. יעד המלכודת הספציפי תלוי בסרוטיפ bont המסוים המעורב בתהליך שכרות. בונט / וונט / E תדבק SNAP-25 ואילו דבק בונט / C שני SNAP-25 וsyntaxin ^5. Synaptobrevin ידבק קפסיד הנותרים (המכונה גם חלבון הקרום קשור-שלפוחיות (נצלנית). בונט / נבחר לפיתוח assay כפי שהוא אחראי לשיעור גבוה של בוטוליזם באופן טבעי ויש לו משך הזמן הארוך ביותר של פעולה ^6. פיתוח של מולקולה קטנה תרופות נגד ונט / היא מטרה עיקרית לתכנית גילוי תרופות ו נצלה שיטות המבוסס על יעד מסורתיים לזהות מעכבי proteolytic האתר פעילים ^{7, 8-10.} עם זאת, היצירה של מעכבי אתר פעילים עם פעילות קשת רחבה נגד קפסיד מרובה ויעילות לאחר החשיפה צפויה להיות מאתגרת.

לכן יש לנו יישמתי גישה חדשנית, פנוטיפי תרופת גילוי שמשתמשת במחשוף בונט SNAP-25 כנקודת סיום פונקציונלית לזהות מולקולות קטנות שיכול לחסום שיכרון הנוירון מוטורי בתיווך בונט. SNAP-25 נדרש לשחרור הנוירוטרנסמיטר, כהשפלה של SNAP-25 הוא חיזוי של שיתוק וקטלני in vivo. לדוגמא, הקרנה מבוססת תאים עלולה להוביל לגילוי של מאפננים חדשים של גורמים הסלולר אחראים לאיון רעלן או עיכוב של מסלולי רעלן בתוך תאים ממוקדים. גורם חשוב בהתפתחות assay פנוטיפי הוא הבחירה של מודלים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. Wדואר ואחרים תארו את הנוירונים עכבר גזע עוברי (ES) שמקורן בתאים מנוע כי לשחזר את האופי החיסוני של תאי עצב מוטוריים ראשוניים, ובכלל זה הביטוי של SNAP-25 ^{11- 13.} חשוב לציין, המערכות הסלולריות אלה רגישות מאוד לונט / שיכרון ולהפגין מחשוף תלוי-מינון של SNAP-25 בתגובה לגידול בריכוזי של רעלן ^11,12. הנוירונים המוטוריים המובחן גם הם מיוצרים בכמויות שמספיקות לניתוח מבוסס צלחת תפוקה גבוהה ואפשרו את העיצוב של מערך של מבחני סלולריים.

Assay פנוטיפי הוא שיטת immunofluorescence ניצול שני נוגדנים שונים לכמת מחשוף של באורך מלא בא לידי ביטוי באופן אנדוגני SNAP-25 במהלך ונט / שיכרון של תרבות הנוירון מוטורי עכבר. מסוף carboxyl ונט / נוגדן מחשוף רגיש (BACS) שמכיר באורך מלא רק SNAP-25 מאפשר ההערכה של bont proteolysis תיווך / של SNAP-25ביטוי במנוע עכבר נוירונים ^10. תרשים סכמטי של assay HCI מתואר באיור 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

תאי הגזע העובריים של עכבר צלחת 20,000 הבדיל (MES) / גם ב96 צלחות ליזין מצופה פולי-D היטב ולשמור בתקשורת בידול מסוף הנוירון מוטורי 5-7 ימים.

מנהל 1. מתחם ושיכרון בונט /

לבצע את כל העבודה הבאה במתחם BSL2 על מנת לעמוד בהנחיות ה- CDC / NIH.

1. הכן 10 פתרונות מניות מ"מ של כל מתחם ספרייה ב100% DMSO בפוליפרופילן 96 צלחות גם. השתמש במניית 10 מ"מ להכין צלחת דילול ביניים שהיא פי 10 גדולים יותר מריכוז ההקרנה הרצויה. הכן 100 צלחת ביניים אום על ידי מחלק 10 מניות מ"מ לתוך צלחת 96-היטב ולדלל אותו ל -100 UM באמצעות תקשורת ותרבות. להפריש 10 μl של התרכובות על 90 μl של תקשורת על התאים ^11. תבדוק את התרכובות בשעה 10 בריכוז סופי אום ולהבטיח את האחוז הסופי של DMSO אינו עולה על 0.5%.
2. לבצע את כל ההרבעהies שעושה שימוש בתאים חיים ורעלן פעיל ברמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים. החלף את המדיה הישנה ב96-גם צלחות עם 80 μl של תקשורת בידול מסוף הטרי באמצעות פיפטה במדריך 12 ערוץ. לבצע שאיפה ולוותר צעדים על ידי שורות כדי למנוע חשיפה של התאים ללא תקשורת לאוויר הסביבה.
3. Pretreat תאים עם תרכובות שלפני היישום של רעלן על ידי תוספת של 10 μl של 10x תרכובות מצלחת המקור באמצעות פיפטה 12 ערוץ, ואחריו ערבוב על ידי שאיפה (פעמיים). לכל צלחת 96-היטב, לטפל בשני טורים של 6 בארות עם 10x DMSO המדולל בתקשורת כדי לשרת גבוהה כאות ובקרת אות נמוכה. הטור ללא טיפול בונט מציג את הרמה הגבוהה ביותר של האורך המלא SNAP-25 (שליטת אות גבוהה). פנק את הטור השני עם bont לבד (ללא כל תרכובות) כשליטת אות הנמוכה. השתמש שליטה נמוכה כדי לבחון את היעילות של המחשוף בונט של SNAP-25 וזיהוי שלה עם נוגדן BACS (איור 2).
4. דגירה תאים עם תרכובות למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס ו -6% CO ₂ בתרבית תאי החממה.
5. הכן עצבי טוקסין מ1 מ"ג / מיליליטר במקור מסחרי פוספט שנאגרו מלוח (PBS) למניות 10x סופיות עובדות על ידי דילול עם תקשורת בידול מסוף.
6. ליזום שיכרון על ידי הוספת 10 μl של 10x בונט / המניה לתוך בארות המיועדות לבקרת טיפול ואות נמוכה בעזרת פיפטה רבה (איור 2). פנק את הבארות יועדו כגבוהה שליטה עם תקשורת לבד.
7. לטהר את כל כלי הפלסטיק חד-פעמים ואחרות שבאים במגע עם בונט / במהלך המחקר על ידי טבילה בתמיסת היפוכלוריט 0.825% במים לפחות 20 דקות. לבצע את כל ההליכים בארונות בטיחות ביולוגיים ולטהר אזורי עבודה לפני ואחרי ניסויים עם 5% חומר ניקוי חיטוי חומרי ניקוי כגון פתרון MicroChem.
8. תווית הצלחות ברורה כדי לציין את הרעל וincubצלחות אכלו טופלו בnM 1 / L בונט / 4 שעה על 37 מעלות צלזיוס ו -6% CO ₂ באינקובטור תרבית תאים. להציג שילוט מתאים כדי ליידע עמיתים שהרעל נמצא בשימוש במעבדה.
9. התחנה בונט / מחשוף פרוטאוליטים על ידי קיבעון מתנול. הסר מדיה המכילה רעלן ותרכובות מכל טוב עם פיפטה רבה וזורקים בפתרון אקונומיקה 10%. להוסיף מתנול הקרח הקר (100 μl) ישירות לכל טוב.
10. דגירה צלחות במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT) על מנת לאפשר קיבוע להתרחש.
11. לאחר קיבוע, להתמודד בבטחה עם ריאגנטים המושלכים (נחשב מנוטרל) עם פרוטוקולי 1 רמת בטיחות ביולוגית וזורקים בהתאם.
12. בטל מתנול ולהשתמש של PBS 100 μl לשטוף את התאים ורעננותם לפני immunostaining. בצע שני שוטף PBS נוסף.
13. לאחר השטיפה של הדבר, לעזוב את PBS בבארות, צלחות חותם עם סרט דבק microplate ולאחסן ב 4 ° C עד לניתוח. צלחות חנות ב 4 ° C FOr כמה ימים.

2. Immunostaining

הליך immunostaining הוא, פעולה רב שלבי עבודה אינטנסיבית הכוללת מחזורים חוזרים ונשנים מגיב לוותר / לשאוב ושטיפת צלחת נרחבת שעלולות להוביל להקדמה האפשרית של השתנות intraplate וinterplate משמעותיות. גישה חצי אוטומטי מוחלת לחסוך את הזמן של אנשי מעבדה, להגדיל את תפוקת assay, ולמזער immunostaining שונות.

1. השתמש בתחנת עבודה אוטומטית מצויד בראש 96-היטב מסוגל להעביר נפחים של עד 250 μl ומשולב עם זרוע רובוטית תפסן לעבור מעבדתי למקומות שונים על הסיפון המודולרי (ראה חומרים וציוד) לפרוטוקול זה.
   1. הסיפון מודולרית נועד לארח סוגים שונים של מעבדתי ויכול לתמוך בעד 11 פריטים בכל זמן נתון. מטפל microplate האוטומטית מצויד במערה microplate מגזין כפול כדי להחזיק ולתפעל עד 50 צלחות בכל מחזור.
   2. תחנת העבודה האוטומטית ממוקמת בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II המיועד לציוד אוטומציה מעבדה כדי לספק לעקרות ובטיחות. עבור immunostaining האוטומטי, הסיפון מסודר כפי שמוצג באיור 3 כדי לאפשר גישה מגיב בהתאם לצורך וללא התערבות אדם.
2. צלחות טרום עומס המכילות תאים קבועים למגזין הצלחת ומעביר לסיפון כנדרש לפעילות טיפול נוזלי. השתמש מצויד עם 250 טיפים μl ראש 96 פיפטה כדי לשאוב PBS מהבארות עד 10 μl. Permeabilize קרומים תאיים כדי להקל על נוגדן מחייב למטרות תאיות עם חיץ permeabilization (0.1% Triton-X 100). לוותר חיץ permeabilization (100 μl) לתוך זה גם לפני החזרת הצלחות למגזין האחסון השני של מערה microplate לדגירת 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT).
3. הסר חוצץ permeabilization וPEשטיפת צלחת rform עם PBS (פעמיים) כפי שתוארה לעיל בשלב 1.13.
4. לאחר השלב לשטוף האחרון, להסיר את PBS חיץ ולוותר של חיץ חסימה המכיל 1% בסרום סוס ו -0.1% Tween 20 בPBS 100 μl לכל microplates לפני החזרתן למגזין הצלחת 1 שעתי דגירה על RT.
5. השתמש בשני נוגדנים ראשוניים לimmunostaining: נוגדן BACS אנטי עכבר הארנב polyclonal, לגילוי אורך מלא אנטי-III נוגדן טובולין SNAP-25 וחד שבטי עכבר לצורך זיהוי של תאי עצב (ראה חומרים וציוד). לאחר 60 דקות של דגירה, להסיר את חיץ החסימה ולוותר 50 μl של 4ug / מיליליטר של נוגדן BACS ו0.5 מיקרוגרם / מיליליטר של III-טובולין בחסימת מאגר לכל הצלחות.
6. דגירה 1 שעות ב RT להסיר את הנוגדנים הראשוניים ולשטוף 3 פעמים עם PBS של 100 μl מכיל 0.05% Tween (PBST).
7. השתמש IgG אנטי עכבר שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 647 לדמיין IgG -III טובולין ונגד הארנב מתויג עם אלקסה Fluor 568 לדמיין את נוגדן BACS. הכן שני הנוגדנים כדילול / מיליליטר 2 מיקרוגרם בחסימת מאגר ולוותר 50 μl של התערובת לתוך כל טוב.
   הערה: הנוגדנים משני שנבחרו לimmunostaining מסומנות עם fluorophores שונה ומאפשרת גילוי של אור הניאון נפלט באורכי גל שונים באמצעות ערוצים שונים בתוך הגלאי של Imager התוכן הגבוה.
8. דגירה עבור שעה 1 ב RT. לשאוב את הנוגדנים משני ולשטוף 3 פעמים עם PBST של 100 μl.
9. לאחר השטיפה של הדבר, להוסיף צבע של PBS המכיל Hoechst (32 מיקרומטר) 100 μl להכתים את ה- DNA לזיהוי גרעינים.
10. לאטום את הצלחות עם סרט בלתי חדיר אור כדי להגן על fluorophores מphotobleaching. ניתן לאחסן צלחות ב 4   ° C במשך שבועות ללא אובדן משמעותי של אות.

3. הדמיה

הערה: בצע רכישת תמונה באמצעות תוכן גבוה ההדמיה SysTEM (ראה חומרים וציוד).

1. מפרט של הגדרות Imager תוכן גבוהות:
   1. בחר סוג פלייט, פריסה, מספר תחומים, מטרה: גריינר u ברור, פורמט 96 גם, 16, 20X מים בהתאמה.
   2. ערוצים נבחרים: EX עירור גרעין: 405 ננומטר כערוץ 4; ציטופלסמה EX: 644 ננומטר כערוץ 2; EX אנטיגן הספציפי ערוץ נוגדן: 561 ננומטר כערוץ 3 וכוח עירור הגדרה של כל לייזר, ניסוי התקנה כמו 2 חשיפות, חשיפה 1 עם עירור אחד ב644 ננומטר, חשיפה 2 עם שני עירורים ב 405 ננומטר ו561 ננומטר. בחר binning כBin2.
   3. השתמש בבארות שליטה גבוהות לאופטימיזציה חשיפה בעוצמה המרבית כערוץ SNAP-25 ובארות שליטה נמוכות לעצמה מינימאלית.
   4. התאם את החשיפה, כך שהעצמה של כל ערוץ היא כמחצית מרמת הרוויה (2,000-2,500 יחידות יחסית).
   5. זהה את מטוס Z האופטימלי בערוץ מסכת תא באמצעות סקריפט תיקון דלתא. ראה Figure 5 לתוצאות לאחר immunostaining והדמיה. נתוני יצוא לשרת שבי תוכנת ניתוח תמונה המתגוררת.

4. ניתוח תמונה (איור 6)

הערה: השלבים הבאים מתארים יישום של אלגוריתמי תוכנת קולומבוס.

1. בחר אלגוריתם מתאים למגזר האובייקטים העיקריים (גרעינים). במידת הצורך, להתאים את סף רקע ופרמטרים לעומת זאת. תוכנת קולומבוס מספקת 4 שיטות זיהוי גרעינים. בחר את השיטה שגרעיני קטע בצורה מדויקת על ידי בחינה ויזואלית בדיקת גרעינים מפולחים (בF שיטת 6 א igure M נבחר).
2. בחר את אלגוריתם neurite (CSIRO neurite ניתוח 2) למגזר neurites אם נדרש, להתאים את הפרמטרים סף רקע ולעומת זאת להסרת רקע. ראה 6 ב איור לפרמטרים המשמשים לאיתור neurites.
3. זהה את אזורי neurite (מגזרי neurite) basאד על אובייקטים משני (neurites) באמצעות הרחבת פיקסל -3 של ערוץ טובולין β-III (Alexa קמח 640) כמסכה (איור 6 ג).
4. חישוב עוצמת ערוצי האות (SNAP-25, (Alexa קמח 568) לאזור neurites וערוץ β-III טובולין (איור 6 ד & 6-ה).
5. בחר פרמטרים רצויים ליצוא, כגון אורך neurite, עוצמות ממוצעת של SNAP-25, טובולין β-III, מספר גרעינים, מספר קטע neurite, וכו '(6F איור).
6. העברת צלחות ממלגזות צלחת באמצעות הרובוט והעומס לImager התוכן הגבוה לרכישת תמונה.

5. ניתוח נתונים:

כדי להעריך את חוסנו של assay נועד, לחשב את הפרמטרים הבאים מהניסוי מבוסס הצלחת.

1. אות (S) לרקע (B): S B = עוצמת אומרת עוצמת שליטת אות גבוהה) / אומר / שליטה אות נמוכה
2. מקדמים שונה (CV) של אות ורקע (כדי למדוד את האחידות של האות הספציפית): קורות חיים = (סטיית תקן (/ ממוצע של מדגם SD)) * 100 (%), כדי לקבוע את השונות בטיפול נוזלי, ריאגנטים, וכו '
3. אות לרעש: S = (ממוצע עוצמת האות - אומר עוצמת שליטת אות נמוכה) / SD שליטה נמוכה
   1. לחשב הגורם "Z עם שיכרון מחצית מצלחת 96-היטב ושכרות מדומה של החצי השני. Z '= 1 - 3 * (SD שליטה אות גבוהה + SD שליטה אות נמוכה) / (ממוצע של שליטת אות גבוהה - ממוצע של שליטת אות נמוכה). לניתוח נוסף של נתוני ההקרנה, לנרמל חלק מפרמטרי הגלם העיקריים על בסיס צלחת כדי לאפשר השוואה בין לוחות ובין ימים השונים של ניסויים.
4. אחוזים ממחשוף, המשקפים ירידה של האות הקשורים באורך מלא SNAP-25 זוהה על ידי נוגדן ספציפי (BACS):% מחשוף = 100% * (MEAעוצמת n שליטה אות גבוהה - עוצמת המדגם) / אומרת עוצמת שליטת אות גבוהה.
5. אחוזים מהעיכוב של מחשוף:% עיכוב = 100% * (עוצמת המדגם - אומר עוצמת שליטת אות נמוכה) / (ממוצע עוצמת שליטת אות גבוהה - כלומר עוצמת שליטת אות נמוכה).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

נתונים מפקדים גבוהים ונמוכים יצרו שתי אוכלוסיות נפרדות עם ההבדל של שני חציונים עולה על 3 סטיות תקן (איור 7 א). המטרה של תהליך המיון היא למצוא תרכובות באוכלוסיית המדגם עם ערכים קרובים יותר לאוכלוסיית ביקורת חיובית, בהנחה של התפלגות נורמלית באוכלוסיית המדגם

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

העוצמה הגבוהה של עצבי טוקסין והקלות היחסית של חימושם הביאה סיווגם כקטגוריה (העדיפות הגבוהה ביותר) סוכני biothreat על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן. למרבה הצער, אין FDA אישר תרופה נגד שכרות בונט לאחר רעלן הופנם על ידי תאי העצב המוטוריים. כל מנגנון druggable שמקדם את ההח?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack