Un alto dosaggio Imaging contenuti per l'identificazione di neurotossina botulinica inibitori

Riepilogo

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Abstract

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Introduzione

Il batterio Clostridium botulinum produce neurotossina botulinica, una delle più potenti tossine biologiche conosciute all'uomo ^1. Ci sono 7 diversi sierotipi BoNT (BoNT / AG). BoNT / A-Gall indurre paralisi a livello della giunzione neuromuscolare a causa di complessi SNARE proteolisi ^2,3. SNARE proteolisi impedisce neurotrasmettitore vescicole-fusione delle membrane e quindi blocchi neurotrasmettitore ^4. Il target SNARE specifica dipende dal particolare sierotipo BoNT coinvolti nel processo intossicazione. BoNT / A e BoNT / E fendere SNAP-25, mentre BoNT / C scinde sia SNAP-25 e sintaxina ^5. I restanti sierotipi sinaptobrevina fendere (chiamato anche vescicole associata proteina di membrana (VAMP). BoNT / A è stato scelto per lo sviluppo del test in quanto è responsabile di una percentuale elevata di naturale il botulismo e ha la più lunga durata d'azione ^6. Sviluppo di piccole molecole terapie contro BoNT / A è un obiettivo importante peril nostro programma di scoperta di nuovi farmaci e ha utilizzato metodi tradizionali di obiettivi per identificare inibitori sito proteolitici attivo ^{7, 8-10.} Tuttavia, la creazione di inibitori del sito attivi con attività ad ampio spettro contro i sierotipi multipli e sull'efficacia dopo l'esposizione sarà probabilmente difficile.

Abbiamo quindi implementato un approccio innovativo, fenotipica droga scoperta che utilizza BoNT SNAP-25 scissione come un endpoint funzionale per identificare piccole molecole in grado di bloccare BoNT-mediata intossicazione del motoneurone. SNAP-25 è necessario per il rilascio dei neurotrasmettitori, come la degradazione di SNAP-25 è predittivo di paralisi e letalità in vivo. Ad esempio, lo screening a base di cellule potrebbe portare alla scoperta di nuovi modulatori di fattori cellulari responsabili della tossina inattivazione o l'inibizione delle vie di tossine all'interno delle cellule bersaglio. Un fattore importante nello sviluppo test fenotipico è la selezione di fisiologicamente rilevanti modelli biologici. We ed altri hanno descritto il mouse staminali embrionali (ES) derivati ​​dalle cellule neuroni motori che ricapitolano il carattere immunologico dei motoneuroni primari, tra cui l'espressione della SNAP-25 ^{11- 13.} È importante sottolineare che questi sistemi cellulari sono molto sensibili alle BoNT / A intossicazione e dimostrano scissione dose-dipendente della SNAP-25 in risposta a concentrazioni crescenti di tossina ^11,12. I neuroni motori differenziati sono prodotti anche in quantità sufficiente per l'analisi basata piastra throughput elevato e hanno permesso la progettazione di una serie di saggi cellulari.

Il test fenotipico è un metodo di immunofluorescenza che utilizza due anticorpi distinti per quantificare scissione di endogeno espresso pieno lunghezza SNAP-25 durante la BoNT / A intossicazione della cultura del mouse motoneurone. Un terminale carbossilico BoNT / A (BACS) anticorpi scissione-sensibile che riconosce solo a figura intera SNAP-25 permette di valutare BoNT / A proteolisi mediata di SNAP-25espressione in neuroni motori del mouse ^10. Un diagramma schematico del test HCI è rappresentato in figura 1.

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Protocollo

Piatto 20.000 differenziate cellule staminali embrionali di topo (MES) / pozzetto in piastre da 96 lisina rivestito Poly-D e così mantenere in motoneurone differenziazione terminale dei media per 5-7 giorni.

1. Compound Amministrazione e Intossicazione con BoNT / A

Eseguire tutti i seguenti lavori in un recinto BSL2 per mantenere la conformità con le linee guida CDC / NIH.

1. Preparare 10 mM soluzioni madre di ciascun composto libreria in 100% DMSO in polipropilene piastre da 96 pozzetti. Utilizzare lo stock 10 mM per preparare un piatto di diluizione intermedia che è 10 volte superiore alla concentrazione di retinatura desiderato. Preparare 100 uM piastra intermedia per l'erogazione di 10 stock mm nella piastra a 96 pozzetti e diluire a 100 uM utilizzando terreni di coltura. Pipettare 10 ml di composti in 90 ml di media sulle cellule ^11. Testare i composti: 10 uM concentrazione finale e garantire la percentuale finale di DMSO non supera 0,5%.
2. Eseguire tutte le vite prigionieraIES che utilizzano cellule vive e tossina attiva sotto il livello di biosicurezza 2 condizioni. Sostituire i vecchi media nelle piastre a 96 pozzetti con 80 ml di fresca supporti differenziazione terminale utilizzando una pipetta manuale a 12 canali. Effettuare l'aspirazione ed erogare fasi righe per evitare l'esposizione delle cellule senza supporto per l'aria ambiente.
3. Pretrattare cellule con composti prima dell'applicazione della tossina mediante aggiunta di 10 ml di 10x composti dalla piastra di origine usando una pipetta a 12 canali, seguita da miscelazione per aspirazione (due volte). Per ogni piastra a 96 pozzetti, il trattamento di due colonne di 6 pozzi con 10x DMSO diluito nei media per servire come segnale alto e comandi in bassa di segnale. La colonna senza trattamento BoNT presenta il massimo livello di tutta la lunghezza SNAP-25 (controllo segnale alto). Trattare l'altra colonna con BoNT da solo (senza componenti), come il controllo del segnale basso. Utilizzare un controllo ottimo per osservare l'efficacia di BoNT scissione di SNAP-25 e la sua individuazione con l'anticorpo BACS (Figura 2).
4. Incubare le cellule con composti per 30 minuti a 37 ° C e 6% di CO ₂ in incubatrice coltura cellulare.
5. Preparare neurotossina botulinica A da un 1 mg / fonte commerciale ml in tampone fosfato (PBS) per una finale 10x lavoro diluendo con i media differenziazione terminale.
6. Avviare intossicazione con l'aggiunta di 10 ml di 10x BoNT / A magazzino in pozzi riconosciuto per il trattamento e basso segnale controlli utilizzando una pipetta multicanale (Figura 2). Trattare i pozzetti designati come di tenere sotto controllo con i soli mezzi.
7. Decontaminare tutti ware plastica e altri monouso che viene a contatto con BoNT / A durante lo studio mediante immersione in una soluzione di ipoclorito di 0,825% in acqua per almeno 20 min. Eseguire tutte le procedure di cappe di sicurezza biologica e decontaminare le aree di lavoro sia prima che dopo gli esperimenti con il 5% di detergente disinfettante più pulita, come soluzione MicroChem.
8. Etichettare le piastre in modo chiaro per indicare l'uso di tossine e incubpiastre mangiato trattati con 1 nM / L BoNT / A per 4 ore a 37 ° C e 6% di CO ₂ in un incubatore di coltura cellulare. Visualizza adeguata segnaletica per informare i colleghi che la tossina è in uso in laboratorio.
9. Arresto BONT / A taglio proteolitico ad opera di fissazione metanolo. Rimuovere i supporti contenenti tossine e composti da ogni pozzetto con una pipetta multicanale e scartare in soluzione di candeggina al 10%. Aggiungere il ghiaccio metanolo freddo (100 ml) direttamente a ciascun pozzetto.
10. Incubare le piastre per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) per permettere il fissaggio a verificarsi.
11. Dopo la fissazione, di gestire in modo sicuro i reagenti di scarto (considerato neutralizzate) con livello di biosicurezza 1 protocolli ed eliminare di conseguenza.
12. Eliminare metanolo e utilizzare 100 ml di PBS per lavare le cellule e reidratare la loro prima della colorazione. Eseguire due ulteriori lavaggi PBS.
13. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare PBS nei pozzi, piastre di tenuta con pellicola adesiva di micropiastre e conservare a 4 ° C fino al momento dell'analisi. Conservare le piastre a 4 ° C for diversi giorni.

2. Immunostaining

La procedura di immunoistochimica è un ad alta intensità di lavoro, il funzionamento multifase che comprende reagenti ripetitivi cicli di erogazione / aspirazione e la piastra vasta lavaggio che possono provocare l'introduzione di una significativa variabilità intraplacca e interplate. Un approccio semi-automatico viene applicato per risparmiare il tempo del personale di laboratorio, aumentare la velocità di dosaggio, e ridurre al minimo la variabilità immunocolorazione.

1. Utilizzare una stazione di lavoro automatizzata dotata di testa a 96 pozzetti in grado di trasferire volumi fino a 250 ml e integrato con un braccio robotico pinza a muoversi da laboratorio in diverse posizioni sul ponte modulare (vedi Materiali e attrezzature) per questo protocollo.
   1. La piattaforma modulare è progettato per ospitare diversi tipi di articoli da laboratorio e può supportare fino a 11 elementi in qualsiasi momento. Il gestore di micropiastre è dotato di un doppio scomparto micropiastre impilatore per trattenere emanipolare fino a 50 piastre per ciclo.
   2. La stazione di lavoro automatizzata si trova all'interno di un armadio biosicurezza di classe II progettato per apparecchiature per l'automazione di laboratorio per fornire la sterilità e sicurezza. Per immunostaining automatizzato, il ponte è disposta come mostrato in Figura 3 per consentire l'accesso dei reagenti secondo necessità e senza intervento umano.
2. Piastre di pre-carico contenenti cellule fissate nel caricatore piastra e trasferimento al ponte come necessario per le operazioni di manipolazione dei liquidi. Usare la testa 96 pipetta dotato di 250 punte microlitri per aspirare PBS dai pozzi fino a 10 ml. Permeabilize membrane cellulari per facilitare il legame dell'anticorpo a bersagli intracellulari con tampone permeabilizzazione (0.1% Triton X-100). Distribuire buffer di permeabilizzazione (100 microlitri) in ciascun pozzetto prima di tornare le piastre secondo magazzino di stoccaggio del raccoglitore micropiastra per 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente (RT).
3. Rimuovere buffer di permeabilizzazione e pelavaggio rform piastra con PBS (due volte) come descritto in precedenza al punto 1.13.
4. Dopo l'ultimo ciclo di lavaggio, rimuovere il tampone PBS e dispensare 100 ml di tampone bloccante contenente siero di cavallo 1% e lo 0,1% di Tween 20 in PBS in tutti micropiastre prima di restituirli alla rivista piastra per 1 ora di incubazione a RT.
5. Utilizzare due anticorpi primari per immunoistochimica: un anti-topo anticorpi BACS policlonale di coniglio, per il rilevamento di piena lunghezza anticorpi anti-III tubulina SNAP-25 e un anticorpo monoclonale del mouse per il rilevamento dei neuroni (vedi Materiali e attrezzature). Dopo 60 min di incubazione, rimuovere tampone bloccante ed erogare 50 ml di 4ug / ml di anticorpo BACS e 0,5 mg / ml di III-tubulina in tampone di bloccaggio in tutti i piatti.
6. Incubare per 1 ora a RT rimuovere gli anticorpi primari e lavata 3 volte con 100 ml di PBS contenente 0,05% Tween (PBST).
7. Utilizzare un IgG anti-topo marcato con Alexa Fluor 647 per visualizzare le IgG-III tubulina e anti-coniglio taggati con Alexa Fluor 568 Per visualizzare l'anticorpo BACS. Preparare entrambe anticorpi come una diluizione 2 ug / ml in tampone bloccante ed erogare 50 ml di miscela in ogni pozzetto.
   NOTA: Gli anticorpi secondari selezionati per immunoistochimica sono etichettati con differenti fluorofori per consentire il rilevamento della loro luce fluorescente emessa a lunghezze d'onda diverse che utilizzano canali diversi all'interno del rivelatore dell'Alto Imager contenuti.
8. Incubare per 1 ora a RT. Aspirare gli anticorpi secondari e lavare 3 volte con 100 ml di PBST.
9. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 ml di PBS contenente colorante Hoechst (32 micron) per colorare il DNA per il rilevamento di nuclei.
10. Sigillare le piastre con una pellicola impermeabile leggero per proteggere i fluorofori da photobleaching. Le piastre possono essere conservati a 4   ° C per settimane senza una significativa perdita di segnale.

3. Imaging

NOTA: Eseguire l'acquisizione di immagini con alto contenuto di Imaging SysTEM (vedi Materiali e attrezzature).

1. Specifiche di contenuti ad alta definizioni Imager:
   1. Selezionare il tipo di piatto, struttura, numero di campi, obiettivo: Greiner u chiaro, formato 96 bene, 16, rispettivamente, 20X acqua.
   2. Selezionare i canali: nucleo di eccitazione EX: 405 nm come canale 4; citoplasma EX: 644 nm come canale 2; antigene specifico EX canale anticorpi: 561 nm come canale 3 e Impostazione potenza di eccitazione di ogni laser, esperimento Imposta come 2 esposizioni, Esposizione 1 con una eccitazione a 644 nm, Esposizione 2 con due eccitazioni a 405 nm e 561 nm. Selezionare binning come BIN2.
   3. Utilizzare pozzetti di controllo elevate per l'ottimizzazione dell'esposizione con la massima intensità come canale di SNAP-25 e pozzetti di controllo bassi per intensità minima.
   4. Regolare l'esposizione, in modo che l'intensità di ciascun canale è circa la metà del livello di saturazione (2.000-2.500 unità relative).
   5. Identificare il piano ottimale Z sul canale della maschera cellulare utilizzando delta script di correzione. See Figura 5 per risultati dopo immunoistochimica e di imaging. Esportare i dati al server in cui il software di analisi delle immagini risiede.

4. Analisi dell'immagine (Figura 6)

NOTA: La seguente procedura descrive l'applicazione degli algoritmi software Columbus.

1. Selezionare un algoritmo appropriato per gli oggetti primari (nuclei) segmento. Se necessario, regolare la soglia di fondo e parametri di contrasto. Il software Columbus offre 4 metodi di rilevamento nuclei. Selezionare il metodo che i nuclei segmento con precisione per un controllo a vista nuclei segmentati (in F metodo IGURA 6a M è selezionato).
2. Selezionare l'algoritmo di neuriti (CSIRO neuriti Analisi 2) per segmentare le neuriti Se necessario, regolare i parametri di soglia di sfondo e il contrasto per rimuovere sfondo. Vedere la Figura 6b per i parametri utilizzati per la rilevazione neuriti.
3. Identificare le regioni neuriti (segmenti neuriti) based oggetti secondari (neuriti) utilizzando un'espansione pixel -3 del canale β-tubulina III (Alexa farina 640) come maschera (figura 6c).
4. Calcolare l'intensità dei canali di segnale (SNAP-25, (Alexa farina 568) per la regione neuriti e il canale tubulina β-III (Figura 6d e 6e).
5. Selezionare i parametri desiderati per l'esportazione, come la lunghezza dei neuriti, intensità medie di SNAP-25, β-tubulina III, numero di nuclei, numero di segmento neuriti, ecc (Figura 6f).
6. Piastre di trasferimento da impilatori piastra utilizzando il robot e carico in alto Imager contenuti per l'acquisizione delle immagini.

5. Analisi dei dati:

Per valutare la robustezza del test progettato, calcolare i seguenti parametri dell'esperimento base piastriforme.

1. Del segnale (S) a priorità bassa (B): S / B = intensità del segnale di controllo ad alta media) / media intensità del controllo di segnale basso
2. Coefficiente di variazione (CV) del segnale e lo sfondo (per misurare l'uniformità del segnale specifico): CV = (deviazione standard (SD) / medio di campione) * 100 (%), per determinare la variabilità nella gestione dei liquidi, reagenti, ecc
3. Signal to Noise: S = (media intensità del segnale - intensità media del controllo segnale basso) / SD del controllo ottimo
   1. Calcolare il fattore Z 'intossicazione di una metà di una piastra a 96 pozzetti ed una intossicazione finto dell'altra metà. Z '= 1 - 3 * (SD del controllo segnale alto + SD del controllo segnale basso) / (media del controllo segnale alto - medio del controllo segnale basso). Per l'ulteriore analisi dei dati di screening, normalizzare alcuni parametri prime primarie su una piastra di base per permettere il confronto tra le piastre e tra i diversi giorni di esperimenti.
4. Percentuale di scissione, riflettendo la riduzione del segnale associato a lunghezza completa SNAP-25 rilevata dal anticorpo specifico (BACS): Cleavage% = 100% * (mean intensità del controllo elevato rapporto segnale - intensità di campione) intensità del controllo segnale alto / medio.
5. Percentuale di inibizione della scissione:% di inibizione = 100% * (intensità di campione - media intensità del controllo di segnale basso) / (media intensità del segnale di controllo ad alta - intensità del controllo di segnale basso media).

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Risultati

I dati di controllo alta e bassa create due distinte popolazioni con la differenza delle due mediane superiori a 3 deviazioni standard (Figura 7A). L'obiettivo del processo di screening è quello di trovare i composti all'interno della popolazione campione con valori più vicini alla popolazione di controllo positivo, ipotizzando una distribuzione normale nella popolazione campione (Figura 7B, (i)). Punti di dati che sono 3 deviazioni standard oltre la media sono considerati sta...

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Discussione

L'elevata potenza di neurotossine botuliniche e la relativa facilità del loro militarizzazione ha portato nella loro classificazione come categoria A (priorità più alta) agenti biothreat dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie. Purtroppo, non ci sono FDA ha approvato terapie per contrastare BoNT intossicazione dopo la tossina è stato interiorizzato dai motoneuroni. Qualsiasi meccanismo di druggable che promuove il recupero neuronale da BoNT intossicazione potrebbe portare allo sv...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack