Ein hoher Gehalt Imaging Assay zur Identifizierung von Botulinum Neurotoxin-Inhibitoren

Zusammenfassung

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Zusammenfassung

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Einleitung

Das Bakterium Clostridium botulinum produziert Botulinum Neurotoxin, einem der potentesten biologischen Giftstoffen auf den Menschen bekannt ^1. Es gibt 7 verschiedene BoNT-Serotypen (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induzieren die Lähmung an der neuromuskulären Synapse durch SNARE-Komplex Proteolyse ^2,3. SNARE Proteolyse verhindert Neurotransmitter-Vesikel-Membranfusion und damit Blöcke Exozytose von Neurotransmittern ^4. Die spezifische SNARE Ziel ist abhängig von der jeweiligen BoNT Serotyp im Rausch Prozess beteiligt. BoNT / A und BoNT / E spalten SNAP-25 in der Erwägung, BoNT / C spaltet sowohl SNAP-25 und Syntaxin ^5. Die verbleibenden Serotypen spalten Synaptobrevin (auch Vesikel-assoziiertes Membranprotein (VAMP) genannt. BoNT / A wurde für die Assay-Entwicklung gewählt, da es einen hohen Anteil von natürlich vorkommenden Botulismus verantwortlich und hat die längste Wirkdauer. ⁶ die Entwicklung des kleinen Moleküls Therapeutika gegen BoNT / A ist ein wichtiges Ziel fürunsere Wirkstoffforschungsprogramm und hat die traditionelle Zielbasierte Methoden genutzt, um aktive Zentrum proteolytischen Inhibitoren ^{7 identifizieren, 8-10.} Jedoch wird die Schaffung von aktiven Zentrum Inhibitoren mit breiten Wirkungsspektrum gegen mehrere Serotypen und Postexpositions Wirksamkeit wahrscheinlich schwierig sein.

Daher haben wir eine innovative, phänotypische Wirkstoffforschungsansatz, BoNT SNAP-25-Spaltung als funktionelle Endpunkt an kleine Moleküle, die BoNT-vermittelten motorischen Neurons Intoxikation blockieren identifizieren können verwendet implementiert. SNAP-25 ist für die Freisetzung von Neurotransmittern erforderlich, wie Abbau von SNAP-25 ist prädiktiv für Lähmung und Letalität in vivo. Zum Beispiel könnten zellbasierte Screening zur Entdeckung neuer Modulatoren zellulärer Faktoren für Toxin Inaktivierung oder Hemmung der Toxin-Bahn-Innere Zielzellen verantwortlich führen. Ein wichtiger Faktor bei der phänotypischen Assay-Entwicklung ist die Auswahl der physiologisch relevanten biologischen Modellen. We und andere haben embryonalen Stammzellen (ES) Zellen abgeleiteten Motorneuronen, welche die immunologischen Charakter des primären Motoneuronen zu rekapitulieren, einschließlich der Expression von SNAP-25 ^{11- 13} beschrieben. Wichtig ist, dass diese zellulären Systeme sind sehr empfindlich auf BoNT / A-Intoxikation und zeigen Dosis-abhängige Spaltung von SNAP-25 in Reaktion auf ansteigende Konzentrationen des Toxins ^11,12. Das differenzierte Motorneuronen sind ebenfalls in Mengen, die ausreichend für die Hochdurchsatzanalyse basiert Platte sind, und erlaubt die Konstruktion einer Reihe von zellulären Assays hergestellt.

Die phänotypische Assay ist ein Immunfluoreszenzverfahren, das zwei verschiedene Antikörper zur Spaltung der endogen exprimierten voller Länge SNAP-25 während der BoNT / A Rausch der Maus Motor Neuron Kultur quantifizieren. Ein carboxylterminalen BoNT / A-Spaltung empfindlichen (BACS) Antikörper, der nur in voller Länge SNAP-25 erkennt erlaubt die Beurteilung von BoNT / A vermittelten Proteolyse von SNAP-25Expression in der Maus Motoneuronen ^10. Ein schematisches Diagramm des HCl-Assay ist in 1 dargestellt.

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Protokoll

Platten 20.000 differenziert Maus-ES-Zellen (MES) / Well in einer 96-Well Poly-D Lysin beschichteten Platten und aufrechtzuerhalten in Motoneuronen-terminalen Differenzierung Medien für 5-7 Tage.

1. Verbindung Verwaltung und Intoxikation mit BoNT / A

Führen Sie alle der folgenden Arbeit in einem BSL2 Gehäuse, um die Einhaltung CDC / NIH-Richtlinien zu halten.

1. Herstellung von 10 mM Stammlösungen der einzelnen Bibliotheksverbindung in 100% DMSO in 96-Well-Polypropylenplatten. Nutzen Sie die 10 mM Stamm um eine Zwischenverdünnungsplatte, die 10-fach größer als die gewünschte Screening Konzentration vorzubereiten. Bereiten 100 uM Zwischenplatte durch den Verzicht 10 mM Stamm in 96-Well-Platte und verdünnen Sie es mit Kulturmedien bis 100 & mgr; M. Verzichtet werden 10 & mgr; l der Verbindungen auf 90 ul Medium auf den Zellen ^11. Testen Sie die Verbindungen bei 10 uM Endkonzentration und sorgen für die endgültige Prozentsatz der DMSO 0,5% nicht überschreiten.
2. Führen Sie alle Bolzenies, die lebenden Zellen und aktives Toxin unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen zu nutzen. Ersetzen Sie die alten Medien in den 96-Well-Platten mit 80 ml frisches terminalen Differenzierung Medien mit einem 12-Kanal-Handpipette. Führen Sie Aspiration und verzichten Schritte durch Reihen, um die Exposition der Zellen gegenüber der Umgebungsluft zu vermeiden, ohne Medien.
3. Vorzubehandeln Zellen mit Verbindungen vor der Applikation von Toxin durch Zugabe von 10 ul 10x-Verbindungen von der Quelle-Platte unter Verwendung einer 12-Kanal Pipette, gefolgt von Mischen durch Absaugen (zweimal). Für jede 96-Well-Platte, behandeln zwei Spalten mit 6 Vertiefungen mit 10x DMSO in den Medien verdünnt, um als High-Signal und niedrige Signalsteuerungen dienen. Die Säule ohne BoNT-Behandlung weist das höchste Niveau der vollen Länge SNAP-25 (High-Signal-Steuerung). Behandeln Sie die anderen Säule mit BoNT allein (ohne Verbindungen) als Low-Signal Kontrolle. Verwenden Sie niedrige Steuer, um die Effizienz von BoNT Spaltung SNAP-25 und dessen Nachweis mit der BACS-Antikörper zu beobachten (Abbildung 2).
4. Inkubieren Zellen mit Verbindungen für 30 min bei 37 ° C und 6% CO ₂ in den Zellkulturbrutschrank.
5. Vorbereitung Botulinum Neurotoxin A aus einer 1 mg / ml kommerziellen Quelle in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Arbeitsstamm 10x durch Verdünnen mit terminalen Differenzierung Medien.
6. Initiate Intoxikation durch Zugabe von 10 ul 10x BoNT / A Lager in für die Behandlung und Low-Signal steuert mit einer Mehrkanalpipette (Abbildung 2) Kavitäten pipettieren. Behandeln Sie die so hoch Steuerung mit Medien allein Kavitäten pipettieren.
7. Dekontaminieren alle Kunststoffwaren sowie anderen Einmal die in Kontakt mit BoNT / A während der Studie durch Eintauchen in 0,825% Hypochlorit-Lösung in Wasser für mindestens 20 Minuten kommt. Führen Sie alle in der biologischen Sicherheit Schränke und dekontaminieren Arbeitsbereiche vor und nach Experimenten mit 5% Detergens Desinfektionsreiniger wie MicroChem Lösung.
8. Beschriften Sie die Platten eindeutig Toxin Gebrauch und Incub bezeichnenaß Platten mit 1 nM / L BoNT / A für 4 h bei 37 ° C und 6% CO ₂ in einem Zellkulturbrutschrank behandelt. Anzeige entsprechende Beschilderung an Kollegen, dass Toxin in den Einsatz im Labor zu informieren.
9. Stopp BoNT / A proteolytischen Spaltung durch Methanol-Fixierung. Entfernen Sie das Medium Toxin und Verbindungen, die aus jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette und entsorgen in 10% Bleichlösung. Hinzufügen eiskaltem Methanol (100 ul), die direkt in jede Vertiefung.
10. Platten für 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, damit Fixierung auftritt.
11. Nach der Fixierung sicher zu handhaben, die verworfen Reagenzien (legte neutralisiert) mit Sicherheitsstufe 1 Protokolle und entsorgen entsprechend.
12. Entsorgen Methanol und verwenden 100 ul PBS, um die Zellen zu waschen und vor deinen Durst sie Immunfärbung. Führen Sie zwei zusätzliche PBS Wäschen.
13. Nach dem letzten Waschen, lassen PBS in den Vertiefungen, Dichtungsplatten mit Mikroklebefolie und lagern bei 4 ° C bis zur Analyse. Store-Platten bei 4 ° C for mehrere Tage.

2. Immunfärbung

Die Immunfärbung Prozedur ist eine arbeitsintensive, mehrstufigen Vorgang, der sich wiederholenden Reagenz Abgabe / absaugen Zyklen und umfangreiche Plattenwäsche, die der mögliche Einführung von signifikanten Intra und Interplate Variabilität führen kann, schließt. Eine halbautomatische Ansatz angewendet, um die Zeit des Laborpersonals speichern Assay Durchsatz zu erhöhen und die Immunfärbung Variabilität zu minimieren.

1. Verwenden Sie eine automatisierte Arbeitsstation mit einem 96-Loch-Kopf ermöglicht das Übermengen von bis zu 250 & mgr; l und integriert mit einem Roboter-Greifarm, um Laborgeräte in verschiedenen Orten auf dem modularen Deck (siehe Material und Ausrüstung) für dieses Protokoll zu bewegen ausgestattet.
   1. Die modulare Plattform wird entworfen, um verschiedene Arten von Laborgeräte hosten und kann bis zu 11 Artikel zu einem beliebigen Zeitpunkt zu unterstützen. Das automatisierte Mikro Handler ist mit einem Dual-Magazin Mikroplatten-Stacker, um zu halten ausgestattet undmanipulieren bis zu 50 Platten pro Zyklus.
   2. Die automatisierte Arbeitsstation innerhalb einer Klasse II Biosicherheitswerkbank für die Laborautomatisierung Ausrüstung, die der Sterilisation und Sicherheit bieten entfernt. Für Immunfärbeautomaten wird das Deck angeordnet ist, wie in 3 gezeigt, um den Zugang Reagenz nach Bedarf und ohne menschlichen Eingriff zu ermöglichen.
2. Pre-load-Platten, die fixierten Zellen in das Plattenmagazin und Transfer zum Deck wie für Liquid Handling benötigt. Nutzen Sie die 96 Pipettenkopf mit 250 ul Tipps versehen, um PBS aus den Vertiefungen auf 10 ul absaugen. Durchdringbar Zellmembranen zu Antikörper-Bindung an intrazelluläre Ziele mit Permeabilisierung Puffer (0,1% Triton-X 100) zu erleichtern. Verzichtet Permeabilisierung Puffer (100 ul) in jede Vertiefung der Platten vor der Rückkehr zu dem zweiten Speichermagazin der Mikrostapel für eine 15 min Inkubation bei Raumtemperatur (RT).
3. Entfernen Permeabilisierung Puffer und perform Waschen der Platte mit PBS (zweimal), wie zuvor in Schritt 1.13.
4. Nach dem letzten Waschschritt entfernt das PBS-Puffer zubereitet, und 100 & mgr; l Blockierungspuffer, enthaltend 1% Pferdeserum und 0,1% Tween 20 in PBS in alle Mikrotiterplatten, bevor er sie an den Plattenmagazin 1 h Inkubation bei RT.
5. Verwenden Sie zwei primäre Antikörper für Immunfärbung: einen polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper BACS, für den Nachweis von Volllängen-SNAP-25 und einem monoklonalen Maus-Anti-III Tubulin-Antikörper zum Nachweis von Neuronen (siehe Material und Ausrüstung). Nach 60 min Inkubation entfernen Blocking-Puffer und 50 ul verzichtet 4UG / ml des Antikörpers GA und 0,5 ug / ml III-Tubulin in Blockierungspuffer in alle Platten.
6. Inkubieren für 1 h bei RT Entfernen der primären Antikörper und wasche 3mal mit 100 ul PBS, enthaltend 0,05% Tween (PBST).
7. Verwenden eines Anti-Maus-IgG mit Alexa Fluor 647 markiert die -III-Tubulin und Anti-Kaninchen-IgG mit Alexa F markiert visualisierenluor 568 die BACS-Antikörper sichtbar zu machen. Vorbereitung sowohl Antikörper als 2 & mgr; g / ml-Verdünnung in Blockierungspuffer und abzug 50 ul der Mischung in jeder Vertiefung.
   HINWEIS: Die sekundären Antikörper für die Immunfärbung ausgewählt werden mit verschiedenen Fluorophoren markiert, um den Nachweis der emittierten Fluoreszenzlicht bei unterschiedlichen Wellenlängen mit unterschiedlichen Kanälen innerhalb des Detektors der hohen Gehalt Imager ermöglichen.
8. Inkubation für 1 h bei RT. Saugen Sie die Sekundärantikörper und 3x waschen mit 100 ul PBST.
9. Nach dem letzten Waschen werden 100 & mgr; l PBS, das Hoechst-Farbstoff (32 uM), um die DNA für die Kerne Erfassungs färben.
10. Dichten Sie die Platten mit einer lichtundurchlässigen Folie, um die Fluorophore von Photobleaching zu schützen. Platten können bei 4 gelagert werden   ° C wochenlang ohne signifikanten Verlust des Signals.

3. Imaging

HINWEIS: Führen Sie die Bildaufnahme mit High Content Imaging System (siehe Materialien und Ausrüstung).

1. Spezifikation der High Content Imager Definitionen:
   1. Wählen Plattentyp, Layout, Anzahl der Felder, Ziel: Greiner u klar, 96-Well-Format, 16, 20X Wasser auf.
   2. Kanäle auswählen: Kern Anregungs EX: 405 nm als Kanal 4; Zytoplasma EX: 644 nm als Kanal 2; Antigen-spezifische Antikörper Kanal EX: 561 nm, wie Kanal 3 und Set up Erregerleistung jedes Lasers, Setup-Experiment als 2 Expositionen, Belichtung 1 mit einer Anregung bei 644 nm, Belichtung 2 mit zwei Anregungen bei 405 nm und 561 nm. Wählen Binning als BIN2.
   3. Verwenden Sie qualitativ Kontrollvertiefungen für Belichtungsoptimierung mit maximaler Intensität wie SNAP-25-Kanal und geringe Kontrollvertiefungen für minimale Intensität.
   4. Einstellung der Belichtung, so daß die Intensität von jedem Kanal beträgt etwa die Hälfte der Sättigungspegel (2000-2500 relativen Einheiten).
   5. Identifizieren Sie die optimale Z-Ebene auf die Zellmaskenkanal mittels Delta-Korrektur-Skript. Siehe FiAbbildung 5 für Ergebnisse nach Immunfärbung und Imaging. Exportieren von Daten an den Server, wo die Bildanalyse-Software ist wohnhaft.

4. Bildanalyse (Abbildung 6)

HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben die Anwendung der Columbus Software-Algorithmen.

1. Wählen Sie einen geeigneten Algorithmus zur Segmentierung des Primärobjekte (Kerne). Falls erforderlich, passen Sie Hintergrundschwelle und Kontrast-Parameter. Das Columbus-Software bietet 4 Kerne Nachweismethoden. Wählen Sie die Methode, dass die Segmentkerne genau durch Sichtprüfung segmentiert Kerne (in B ild 6a Verfahren M ausgewählt ist).
2. Wählen Sie das Neuriten-Algorithmus (CSIRO Neuriten Analyse 2) zum Segment der Neuriten Falls erforderlich, passen Sie Hintergrundschwelle und Kontrast-Parameter in den Hintergrund zu entfernen. Siehe Abbildung 6b für Parameter verwendet, um Neuriten erkennen.
3. Identifizieren Sie die Neuriten Regionen (Neuriten Segmente) based auf Sekundärobjekte (Neuriten) unter Verwendung eines Pixel -3 Expansion des β-III-Tubulin-Kanal (Alexa Flour 640) als Maske (6c).
4. Berechnen Intensität der Signalkanäle (SNAP-25 (Alexa Flour 568) für das Neuriten-Region und β-III-Tubulin-Kanal (6d & 6e).
5. Wählen Sie die gewünschten Parameter für den Export, wie Neuritenlänge, mittleren Intensitäten des SNAP-25, β-III-Tubulin, Kernzahl, Neuriten Segmentnummer usw. (6f).
6. Übertragungsplatten aus Plattenstapler mit dem Roboter und Last in die High Content Imager für die Bilderfassung.

5. Datenanalyse:

Um die Robustheit des Assays entwickelt beurteilen, Berechnen der folgenden Parameter von der Plattenbasis Experiments.

1. Signal (S) in den Hintergrund (B): S / B = mittlere Intensität hohe Signalsteuerung) / mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung
2. Variationskoeffizient (CV) von Signal und Hintergrund (um die Einheitlichkeit des spezifischen Signals messen): CV = (Standardabweichung (SD) / Mittelwert der Stichprobe) * 100 (%), um die Variabilität in Liquid Handling bestimmen, Reagenzien usw.
3. Signal to Noise: S = (mittlere Intensität des Signals - mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung) / SD niedriger Steuer
   1. Der Z-Faktor "Berechnen mit Intoxikation von einer Hälfte einer 96-Well-Platte und einem Mock Rausch der anderen Hälfte. Z '= 1-3 * (SD hoher Signalsteuerung + SD der niedrigen Signalsteuerung) / (Mittelwert der hohen Signalkontrolle - Mittel der niedrigen Signalsteuerung). Für die weitere Analyse der Screening-Daten, zu normalisieren einige der Primärrohstoffe Parameter auf einem Teller Grundlage zum Vergleich zwischen den Platten und zwischen den verschiedenen Tagen der Experimente zu ermöglichen.
4. Prozent der Spaltung, was die Reduzierung des Signals mit voller Länge SNAP-25 durch spezifische Antikörper nachgewiesen (BACS) zugeordnet:% Dekolleté = 100% * (mean Intensität von Hochsignalsteuerung - Intensität der Probe) / mittlere Intensität hohe Signalsteuerung.
5. Prozent der Inhibition der Spaltung:% Hemmung = 100% * (Intensität der Probe - mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung) / (mittlere Intensität hohe Signalsteuerung - mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung).

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Ergebnisse

Daten aus hohen und niedrigen Kontrollen erstellt zwei verschiedene Populationen mit der Differenz zweier Mittelwerte von mehr als 3 Standardabweichungen (7A). Das Ziel des Screenings ist, um die Verbindungen in der Probenpopulation mit Werten näher positive Kontrollpopulation zu finden, unter der Annahme einer Normalverteilung innerhalb der Probenpopulation (7B, (i)). Datenpunkte, die drei Standardabweichungen über dem Mittelwert liegen werden als statistisch von dem Lärm und als ak...

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Diskussion

Die hohe Wirksamkeit von Botulinum Neurotoxine und der relativen Leichtigkeit ihrer Bewaffnung hat in ihrer Einstufung als Kategorie A (höchste Priorität) biothreat Agenten von den US Centers for Disease Control and Prevention geführt. Leider gibt es keine von der FDA zugelassenen Therapeutika zur BoNT-Intoxikation zu begegnen, nachdem das Toxin von den Motoneuronen verinnerlicht worden. Alle druggable Mechanismus, der neuronalen Wiederaufnahme von BoNT-Intoxikationen fördert könnte in Richtung der Entwicklung eine...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack