ボツリヌス神経毒素阻害剤の同定のためのハイコンテントイメージングアッセイ

要約

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

要約

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

概要

細菌ボツリヌス菌はボツリヌス神経毒、男¹に知られている最も強力な生物毒素の1を生成します。 7明確なのBoNT血清型（のBoNT / AG）があります。のBoNT / A-ガルによりSNARE複雑なタンパク質分解^2,3に神経筋接合部で麻痺を誘発する。 SNAREタンパク質分解は、神経伝達物質小胞の膜融合を防止し、したがって、ブロックはエキソサイトーシス^4神経伝達物質。特定のSNAREターゲットは中毒過程に関与する特定のBoNT血清型に依存します。のBoNT / AおよびBoNT / E切断するSNAP-25のBoNT / Cを切断SNAP-25およびシンタキシン⁵両方のに対し。また、小胞関連膜タンパク質（VAMP）と呼ばれる残りの血清型クリーブシナプトブレビンは（。BoNT / Aには、それが天然に存在するボツリヌス中毒の割合が高いために責任があるとして、アッセイ開発のために選択された小分子の作用^6。開発の最長持続時間を有した。 BoNT / A型に対する治療薬はのための主要な目標である創薬プログラムと活性部位のタンパク質分解阻害剤^7、8-10を識別するために、従来のターゲットベースの方法を利用している。しかし、複数の血清型と、露光後の有効性に対する広域スペクトル活性を有する活性部位阻害剤の作成が困難な可能性が高いであろう。

したがって、我々は、のBoNT媒介運動ニューロン中毒をブロックすることができる小分子を同定するための機能的なエンドポイントとしてのBoNT SNAP-25の切断を使用して、革新的な、表現型の創薬アプローチを実施しています。 SNAP-25の分解はin vivoでの麻痺や致死性の予測となるようにSNAP-25は、神経伝達物質放出のために必要とされる。例えば、細胞ベースのスクリーニングは、毒素の不活化または標的細胞内部で毒素経路の阻害に関与する細胞因子の新たな調節因子の発見につながる可能性があります。表現型アッセイの開発における重要な因子は、生理学的に関連する生物学的モデルを選択することである。 WEなどは、SNAP-25 ^{11- 13}の発現を含む一次運動ニューロンの免疫学的性質を再現するマウス胚性幹（ES）細胞由来の運動ニューロンを、説明してきた。重要なことに、これらのセルラーシステムは、BoNT / A中毒に非常に敏感であり、毒素^11,12の濃度を増加さに応じて、SNAP-25の用量依存的切断を実証している。分化した運動ニューロンはまた、ハイスループットプレートベースの分析のために十分であり、細胞アッセイのアレイの設計を可能にした量で産生される。

表現型のアッセイは、BoNT /マウスの運動ニューロン培養物の中毒の間内因的​​に発現完全長SNAP-25の切断を定量化するために二つの別個の抗体を利用する免疫蛍光法である。唯一の完全長SNAP-25を認識し、カルボキシル末端のBoNT / A切断感受性（BACS）抗体は、BoNT / Aの評価は、SNAP-25のタンパク質分解を仲介できますマウスの運動ニューロンにおける発現^10。 HCIアッセイの概略図を図1に示されている。

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プロトコル

プレート2万差別化マウスES細胞（MES）/ 96ウェルポリ-D-リジンコーティングしたプレートに5〜7日間運動ニューロン分化培地中で維持する。

のBoNT / A 1.化合物投与と中毒

CDC / NIHガイドラインの遵守を維持するために、BSL2エンクロージャに以下のすべての作業を実行します。

1. ポリプロピレン製96ウェルプレートに100％DMSO中の各ライブラリー化合物の10mMストック溶液を調製する。所望のスクリーニング濃度よりも10倍大きい中間希釈プレートを調製するために10mMのストックを使用する。 96ウェルプレートに10 mMストックを分配することによって100μMの中間板を準備し、培養培地を使用して、100μMのに希釈する。セル¹¹上のメディアの90μlの上の化合物の10μlを分注する。 10μMの最終濃度で化合物を試験し、DMSOの最終的な割合が、0.5％を超えないように保証する。
2. すべてのスタッドを実行バイオセーフティーレベル2の条件で、生細胞と活性毒素を利用IES。 12チャネルのマ​​ニュアルピペットを用いて、新鮮な最終分化培地を80μlの96ウェルプレートで古いメディアを交換してください。吸引を行い、外気にメディアを使用せず細胞の曝露を避けるために、行単位でのステップを分注する。
3. 吸引（2回）によって混合した12チャンネルピペットを使用してソースプレートからの10倍の化合物10μlを添加することにより、従来の毒素の適用化合物で細胞を前処理する。各96ウェルプレートの場合は、のような高信号と低信号のコントロールを提供するために培地で希釈し、10倍のDMSOで6ウエルの2つの列を扱う。のBoNT処理なしの列は、完全長SNAP-25（高信号制御）の最高レベルを示す。低信号制御などの（任意の化合物を含まない）を単独のBoNTを持つ他の列を扱います。 SNAP-25およびBACS抗体とその検出（ 図2ののBoNT切断の効率を観察するために低コントロールを使用して、）。
4. 細胞培養インキュベーター中で37℃で30分間、化合物および6％CO ₂で細胞をインキュベートする。
5. リン酸中1mg / mlの市販の供給源からのボツリヌス神経毒Aを調製ターミナル分化培地で希釈して、最終的な10倍ワーキングストックに緩衝食塩水（PBS）。
6. マルチチャンネルピ ​​ペット（ 図2）を用いた治療と低信号のコントロールのために指定ウェルに10倍のBoNT /株式10μlのを追加して中毒を開始します。培地単独で高いコントロールとして指定された井戸を扱う。
7. 少なくとも20分間、水中の0.825パーセントの次亜塩素酸溶液中に浸漬することにより、研究中のBoNT / Aと接触するすべてのプラスチックの構造および他の消耗品を除染。バイオセーフティキャビネット内のすべてのプロシージャを実行し、そのようなマイクロケム液として5％の洗剤除菌洗浄剤を用いた実験の前と後の両方の作業領域を除染。
8. 毒素の使用とincubを示すためにはっきりとプレートにラベルを付ける細胞培養インキュベーター中でCO _2、37℃で4時間および6％を1nM / LのBoNT / Aで処理されたプレートを食べた。毒素は、実験室で使用されていることを同僚に知らせるために、適切な看板を表示する。
9. ストップBONT /メタノール固定によるタンパク質分解切断。マルチチャンネルピペットで各ウェルから毒素および化合物を含む培地を取り出し、10％の漂白剤溶液中に捨てる。各ウェルに直接氷冷メタノール（100μl）を追加します。
10. 固定が起こることを可能にするために室温（RT）で15分間、プレートをインキュベートする。
11. 固定後、無事に1プロトコルバイオセーフティーレベル（中和考えられる）廃棄された試薬を処理し、それに応じて捨てる。
12. メタノールを捨て、細胞を洗浄し、免疫染色前にそれらを再水和するために100μlのPBSを使用しています。二つの追加PBS洗浄を行います。
13. 最終洗浄後、分析まで4℃でマイクロプレート接着フィルムや店舗を有するウェル、シールプレート内のPBSを残す。 4℃FOで保存プレート数日rを。

2.免疫染色

免疫染色手順は、反復的な試薬の分注/吸引サイクルと重要な内陸地震と変動の潜在的な導入につながる可能性が大規模なプレート洗浄を含む労働集約型、多段階の操作です。半自動化されたアプローチは、実験者の時間を節約するアッセイのスループットを増加させ、免疫染色のばらつきを最小限にするために適用される。

1. このプロトコルのモジュラーデッキ上の異なる場所（材料および機器を参照）に実験器具を移動するために、ロボットグリッパアームで最大250μLまでと一体化ボリュームを転送できる96ウェルヘッドを備えた自動化されたワークステーションを使用してください。
   1. モジュラーデッキは実験器具の異なるタイプをホストするように設計されており、一度に最大11項目をサポートすることができる。自動マイクロプレートハンドラーは保持するために、デュアルマガジンマイクロプレートスタッカーを備えているとサイクル当たり50プレートまで操作する。
   2. 自動化されたワークステーションは、無菌性と安全性を提供するために、実験室の自動化機器用に設計されたクラスIIバイオセーフティキャビネットの内側に位置しています。自動免疫染色のために、デッキは、 図3に示すように、必要に応じて試薬のアクセスを可能にするために配置され、人間の介入なしている。
2. 液体取扱い業務のために必要に応じてデッキにプレート雑誌や転送に固定された細胞を含む予圧プレート。ダウン10μlに井戸からPBSを吸引する250μlの先端装備96ピペットヘッドを使用してください。透過化緩衝液（0.1％のTriton-X 100）を用いて細胞内標的に結合する抗体を容易にするために、細胞膜を透過性にする。室温（RT）で15分間のインキュベーションのためにマイクロプレートスタッカーの第保管マガジンにプレートを返す前に、各ウェルに透過化緩衝液（100μl）を分配する。
3. 透過化バッファとPEを削除PBS（2回）とrformプレート洗浄は、先にステップ1.13に記載されて。
4. 最後の洗浄工程の後、PBS緩衝液を除去し、すべてにPBS中1％ウマ血清および0.1％Tween 20を含むブロッキング緩衝液100μlを分注RTで1時間インキュベートし、プレートマガジンに戻す前に、マイクロプレート。
5. （材料および機器を参照）神経細胞の検出のための完全長SNAP-25マウスモノクローナル抗IIIチューブリン抗体の検出のために、ウサギポリクローナル抗マウスBACS抗体：免疫染色のための2つの一次抗体を使用する。インキュベーションの60分後、ブロッキングバッファー削除し、すべてのプレートにブロッキングバッファー中BACS抗体の4ug / mlの50μlの及びIIIチューブリン0.5μgの/ mlに分注する。
6. RTで1時間インキュベートした一次抗体を除去し、0.05％のTween（PBST）を含むPBS100μlで3回洗浄する。
7. アレクサFでタグ-IIIチューブリンおよび抗ウサギIgGを可視化するアレクサフルオロ647標識抗マウスIgGを使用BACS抗体を可視化するluor 568。ブロッキング緩衝液中2μg/ mlの希釈として両方の抗体を調製し、各ウェルに混合液50μlを分注する。
   NOTE：免疫染色のために選択された二次抗体は、ハイコンテントイメージャの検出器内の異なるチャネルを使用して異なる波長で、その発せられた蛍光の検出を可能にするために、異なる蛍光体で標識されている。
8. 室温で1時間インキュベートする。二次抗体を吸引し、PBST100μlで3回洗浄する。
9. 最終洗浄後、核を検出するためのDNAを染色するためにHoechst色素（32μM）を含む100μlのPBSを追加。
10. 光退色から蛍光団を保護するために、光透過性フィルムでプレートをシール。プレートを4で保存することができる 信号の有意な損失なしに数週間のために、Cを°。

3.イメージング

注：ハイコンテントイメージングのSysを使用して画像取得を実行TEM（材料および装置を参照してください）​​。

1. ハイコンテントイメージャ定義の仕様：
   1. セレクトプレートタイプ、レイアウト、フィールドの数、目的：グライナーU澄んだ、20X水をそれぞれ96ウェルフォーマット、16、。
   2. セレクトチャンネル：核励起EX：チャンネル4としては405nm。細胞質EX：チャネル2と644 nmの。抗原特異的抗体チャンネルEX：561チャンネル3としてnmおよび各レーザのセットアップ励起パワー、2エクスポージャーとしてセットアップ実験、644 nmで1励起、405 nmおよび561 nmにおける2励起による露光2の露光1。ビン2としてビニングを選択します。
   3. SNAP-25チャネルおよび最小強度のための低対照ウェルのような最大強度の露出を最適化するために、高いコントロールウェルを使用する。
   4. 各チャネルの強度が飽和レベル（2,000〜2,500相対単位）の約半分になるように、露出を調整する。
   5. デルタ補正スクリプトを使用して、細胞マスクチャネルに最適なZ平面を識別する。 Fiを提供して参照してください。免疫染色およびイメージング後の結果のためのグレ5。画像解析ソフトが常駐しているサーバへデータをエクスポートします。

4.画像解析（図6）

注：次の手順は、コロンバスソフトウェアアルゴリズムの適用を説明します。

1. プライマリ·オブジェクト（核）セグメントに適切なアルゴリズムを選択します。必要に応じて、背景閾値及びコントラストパラメータを調整する。コロンブス·ソフトウェアは、4核検出法を提供する。視覚的に（Mが選択されているF igure 6aの方法で）セグメント化された核を検査することによって、正確にメソッドそのセグメント核を選択します。
2. 必要に応じて、セグメントに神経突起を神経突起アルゴリズム（CSIRO神経突起分析2）を選択して背景を削除するには、バックグラウンドのしきい値とコントラストのパラメータを調整する。神経突起を検出するために使用されるパラメータについて、図6bを参照してください。
3. 神経突起領域（神経突起セグメント）浅を識別マスク（ 図6c）として、β-IIIチューブリンチャネル（アレクサ小麦粉640）の-3画素拡張を使用して、セカンダリ·オブジェクト（神経突起）に編。
4. 神経突起領域およびβ-IIIチューブリンチャネル（ 図6d＆6E）用の信号チャネル（SNAP-25、（アレクサ小麦粉568）の強度を計算します。
5. そのような神経突起の長さが、SNAP-25の平均強度は、β-IIIチューブリン、核数、神経突起セグメント番号等 （ 図6F）などの輸出用必要なパラメータを選択します。
6. 画像取得のためのハイコンテントイメージャへのロボットとロードを使用して、プレートスタッカからの転送プレート。

5.データ分析：

設計されたアッセイの頑健性を評価するために、プレートベースの実験から、以下のパラメータを計算する。

1. バックグラウンド信号（B）から（S）：S / B = Hの信号制御の平均強度）/ロー信号制御の強度を意味する
<液体ハンドリングの変動を決定するために、CV =（標準偏差（SD）のサンプル/平均値）×100（％）：LI>シグナルとバックグラウンドの変動係数（CV）は、（特定の信号の均一性を測定する）試薬など
2. ノイズに対する信号：Sは、= - 低コントロールの/ SDを（信号の強さを意味する低い信号制御の強度を意味する）
   1. 1 96ウェルプレートの半分、残りの半分のモック中毒の中毒とのZ '係数を計算。 Z '= 1 - 3 *（低信号制御の高信号制御+ SDのSD）/（高信号制御の平均 - 低信号制御の平均を）。スクリーニングデータの更なる分析のために、プレート間および実験の異なる日の間の比較を可能にするためにプレート毎に主原料いくつかのパラメータを正規化する。
3. ％胸の谷間= 100％*（MEA：全長SNAP-25特異的抗体によって検出された（BACS）に関連する信号の減少を反映して切断のパーセント、高い信号制御のn個の強度 - 試料の強度）/高い信号制御の強度を意味する。
4. 切断の阻害のパーセント：％阻害= 100％*（サンプルの強度 - 低信号制御の平均強度）/（高信号制御の強度を意味する - 低信号制御の強度を意味する）。

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結果

ハイとローのコントロールからのデータは、3標準偏差（図7A）を超える2中央値の差が2の異なる集団を作成しました。スクリーニングプロセスの目標は、サンプル集団（ 図7B（i））を内正規分布を仮定し、近い正の対照集団に対する値とサンプル集団内の化合物を見出すことである。平均の3標準偏差を超えているデータ点は、ノイズ統計的に異なると考えられ、ア?...

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ディスカッション

ボツリヌス神経毒とその兵器の相対的な容易さの高い効力は、米国疾病管理予防センターによるカテゴリーA（最優先）biothreat剤としてのそれらの分類をもたらした。残念ながら、FDAは毒素が運動ニューロンによって内在された後のBoNT中毒に対抗するための治療薬を承認していないがあります。のBoNT中毒から神経細胞の回復を促進する任意のドラッガブルメカニズムが、この生物学的脅威に?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack