Botulinum nörotoksininin önleyicilerinin tanımlanmasına daha yüksek bir miktarda Görüntüleme Deneyi

Özet

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Özet

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Giriş

Clostridium botulinum Botulinum nörotoksin, ¹ adam bilinen en güçlü biyolojik toksinlerin birini üretir. 7 farklı BoNT serotipleri (BoNT / AG) vardır. BoNT / A-Safra nedeniyle tuzak karmaşık proteoliz ^2,3 için nöromüsküler kavşakta felce neden. Tuzak proteoliz nörotransmitter vezikül membran füzyonu önleyen ve bu nedenle blok eksositoz ⁴ nörotransmitterlerle. Belirli bir tuzak hedef zehirlenme işlemde söz konusu olan belirli, BoNT serotip bağlıdır. BoNT / A ve BoNT / E cleave SNAP-25 BoNT / C yararak hem SNAP-25 ve sintaksin ⁵ oysa. Ayrıca veziküllü bağlı zar proteini (VAMP) olarak adlandırılan kalan serotipler, yarılma sinaptobrevin (., BoNT / A, doğal olarak oluşan bir botulizm yüksek bir kısmından sorumlu olduğu gibi tahlil geliştirme için seçilmiş ve küçük bir molekülün eylem ^6. Geliştirme en uzun kalış süresine sahip olan BoNT / A'ya karşı terapatikler için önemli bir hedeftirBizim ilaç keşfi programı ve ^8-10 aktif sitesi proteolitik inhibitörleri ⁷ tanımlamak için geleneksel hedef tabanlı yöntemler kullanmıştır. Ancak, çoklu serotipleri ve maruziyet sonrası etkinliğine karşı geniş spektrumlu aktiviteye sahip aktif sitesi inhibitörlerinin oluşturulması muhtemel zorlu olacak.

Bu nedenle BoNT-aracılı motor nöron zehirlenmeye engelleyebilirsiniz küçük molekülleri tanımlamak için fonksiyonel bir son nokta olarak BoNT SNAP-25 bölünme kullanan yenilikçi, fenotipik ilaç keşif yaklaşımı hayata geçirdik. SNAP-25 in vivo felç ve letalitesinin öngörü olduğunu SNAP-25 bozulması gibi, nörotransmitter salınımı için gereklidir. Örneğin, hücre bazlı tarama toksin ya da etkisiz hale hedef hücreler içinde toksin yollarının engellenmesi için sorumlu hücresel faktörlerin yeni modülatörlerinin bulunması beklenmektedir. Fenotipik tahlil gelişiminde önemli bir faktör, fizyolojik olarak uygun biyolojik modeller seçimidir. WE ve diğerleri, SNAP-25 ^{11 13} ekspresyonu dahil olmak üzere, primer motor nöron immünolojik karakterini özetlemek fare embriyonik kök (ES) hücresinden türetilmiş motor nöronları, tarif edilmiştir. Önemli olarak, bu hücresel sistemler, BoNT / A zehirlenmesine karşı oldukça duyarlıdır ve toksin ^11,12 konsantrasyonlarının artmasına tepki olarak SNAP-25 doza bağlı olarak bölünmesini göstermektedir. Farklılaşmış motor nöronlar, aynı zamanda yüksek miktarda levha göre analiz için yeterli olan ve hücresel tahlillerde bir dizi tasarıma izin verilen miktarlarda üretilmektedir.

Bir fenotipik tahlil, BoNT / fare motor nöron kültürü bir zehirlenmesi sırasında endojen olarak ifade edilen tam uzunlukta SNAP-25 bölünmesini ölçmek için iki farklı antikor kullanılarak bir imüno-yöntemdir. Sadece tüm uzunluğu boyunca SNAP-25 tanıyan bir karboksil terminal, BoNT / bir bölünme duyarlı (BACS) antikoru SNAP-25'in BoNT / A proteolizinin aracılı değerlendirilmesine olanak sağlamaktadırFare motora ifade ¹⁰ nöronlar. HCI deneyinin şematik bir diyagramıdır, Şekil 1 'de tasvir edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Plaka 20,000 farklılaşmış fare ES hücreleri (MES) / bir 96 Poly-D lisin kaplı plakalara ve 5-7 gün süre ile, motor nöron terminal farklılaşma ortam içinde muhafaza.

BoNT / A 1. Bileşik İdaresi ve Zehirlenme

CDC / NIH kurallarına uyum sağlamak için bir BSL2 kasada aşağıdaki tüm iş gerçekleştirin.

1. Polipropilen 96 oyuklu plakalar içinde,% 100 DMSO içinde her bir kütüphane bileşiğin 10 mM'lik stok çözelti hazırlayın. Arzu edilen tarama konsantrasyonunun daha yüksek 10-kat bir ara seyreltme plaka hazırlanması için 10 mM stok kullanın. 96 oyuklu bir plakaya 10 mM stok tevzi 100 uM'lik bir ara levha hazırlamak ve kültür ortamı ile 100 uM seyreltilmesi. Hücreler ¹¹ ortamın 90 ul üzerinde bileşiklerin 10 ul koyun. 10 uM nihai konsantrasyonda bileşiklerin test edin ve 0,5 ağırlık% nihai DMSO yüzdesi emin olun.
2. Tüm damızlık gerçekleştirinBiyogüvenlik düzeyi 2 şartlar altında canlı hücreleri ve aktif toksin kullanmak ler. Taze terminal farklılaşma ortam 80 ul bir 12 kanal kılavuzu pipet kullanılarak 96 oyuklu plakalar içinde eski medya değiştirin. Aspirasyon yürütmek ve ortam havasına medya olmadan hücrelerin maruz kalmasını önlemek için satırlara göre adımlar dağıtmak.
3. (Iki kez) önceden aspirasyon ile karıştırılması ve ardından 12 kanallı pipet kullanılarak kaynak plaka 10x bileşikler 10 ul eklenmesi ile toksin uygulanmasından bileşikleri ile ön işlemden geçirin hücreleri. Her bir 96-delikli plaka için, yüksek bir sinyal ve düşük sinyal kontrol hizmet için bir ortamda seyreltilir 10x DMSO ile 6 kuyu iki sütun tedavi. BoNT, tedavi olmaksızın Kolon tam uzunluğu, SNAP-25 (yüksek sinyal kontrol) en yüksek düzeyi sergiler. Düşük sinyal kontrol olarak (herhangi bir bileşik olmadan) tek başına BoNT'nin ile diğer sütun davranın. (BACS antikor ile SNAP-25 ve algılama BoNT bölünme etkinliğini gözlemlemek için Şekil 2 düşük kontrolünü kullanın).
4. Hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı ve% 6 _CO2 bileşikler ile inkübe hücreleri.
5. Fosfat içinde 1 mg / ml ticari bir kaynaktan botulinum nörotoksininin A Hazırlama terminal farklılaşma ortamı ile seyreltilerek nihai 10x çalışma stok için serum fizyolojik (PBS) ilave edilmeden önce.
6. Bir çok kanallı pipet (Şekil 2) kullanılarak tedavi ve düşük sinyal kontrolleri için belirlenen kuyuların içine 10x BoNT'nin / A stok 10 ul ekleyerek zehirlenmeye başlatın. Tek başına medya ile yüksek kontrol olarak belirlenmiş kuyu davranın.
7. En az 20 dakika boyunca suda% 0.825 toplam hipoklorit çözeltisi içine daldırma ile çalışma sırasında, BoNT / A ile temas eden tüm plastik eşya ve diğer tek kullanımlık arındırın. Biyogüvenlik dolapları tüm prosedürleri yerine önce ve böyle MicroChem çözüm olarak% 5 deterjan dezenfektan temizleyici ile deneyler sonrasında çalışma alanlarını temizleyiniz.
8. Toksin kullanımı ve inkubasyon göstermek için açık plakaları Etiketyedi plakalar, bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 4 saat ve% 6 _CO2 1 nm / L, BoNT / A ile muamele edilmiştir. Toksin laboratuvarda kullanımda olduğunu meslektaşlarını bilgilendirmek için uygun tabela görüntüler.
9. Dur Bont / metanol tespit ile bir proteolitik bölünme. Çok kanallı bir pipet ile, her kuyudan toksin ve bileşikleri ihtiva eden Ortamı çıkarın ve% 10 ağartıcı çözeltisi içinde atın. Her bir oyuğa, doğrudan buz soğukluğunda metanol (100 ul) eklenir.
10. Tespit yapılmasına izin vermek için oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca inkübe edin.
11. Fiksasyon sonra, güvenle biyogüvenlik düzeyi 1 protokolleri ile atılan reaktifleri (nötralize sayılır) idare ve buna göre atın.
12. Metanol atın ve hücreleri yıkayın ve immunosteyn önce onları rehydrate PBS 100 ul kullanın. İki ek PBS yıkama yapın.
13. Son yıkamadan sonra, analiz zamanına kadar 4 ° C'de mikro-yapışkan film ve mağaza ile kuyular, conta plakalarında PBS bırakın. 4 ° C Piazz saklayın plakalarbirkaç gün r.

2. immün

İmmünoboyama prosedür önemli Levha içi ve açıklarda oluşan değişkenlik potansiyel tanıtım yol açabilir tekrarlayan reaktif dağıtıcı / aspirat döngüleri ve geniş plaka yıkama içeren bir emek-yoğun, çok aşamalı bir işlemdir. Bir yarı-otomatik bir yaklaşım, laboratuar personelinin zamandan tasarruf tahlil verimi artırmak ve değişkenliği immünboyama en aza indirmek için uygulanır.

1. Bu protokol için modüler güvertede farklı yerlerde (Malzeme ve Ekipmanları bakınız) içine laboratuar aletlerinin taşımak için bir robot tutucu kol ile 250 ul ve entegre hacimleri transfer edebilecek 96-de kafa ile donatılmış otomatik bir iş istasyonu kullanın.
   1. Modüler güverte laboratuvar donatımı farklı türde ev sahipliği için ve herhangi bir anda 11 öğelere destekleyebilir tasarlanmıştır. Otomatik mikrolevha işleyicisi tutmak için bir çift dergi mikrolevha istifleyici ile donatılmıştır vedöngü başına 50 kalıba kadar manipüle.
   2. Otomatik iş istasyonu kısırlığa ve güvenliğini sağlamak amacıyla laboratuvar otomasyon cihazları için tasarlanan Sınıf II biyogüvenlik kabini içinde yer almaktadır. Gerektiğinde ve insan müdahelesi olmaksızın reaktif erişim sağlamak için, Şekil 3'te gösterildiği gibi otomatik immün için, güverte düzenlenmiştir.
2. Sıvı elleçleme operasyonları için gereken şekilde güverte plaka dergi ve transfer içine sabit hücreler içeren ön-yük plakaları. Aşağı 10 ul kuyulardan PBS aspire 250 ul ipuçları ile donatılmış 96 pipet başını kullanın. Permeabilizasyon tampon maddesi (% 0.1 Triton-X 100) kullanılarak hücre içi hedefleri antikor bağlanmasını kolaylaştırmak için hücre zarlarını geçirgenliği. De oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçkalama için mikroplaka istif bölmesine ikinci depolama dergisi plakaları dönmeden önce her birine permeabilizasyon tamponu (100 ul) koyun.
3. Permeabilizasyon tamponu ve pe KaldırPBS (iki defa) ile rform plaka yıkaması, daha önce adım 1.13 tarif edilmiştir.
4. Son yıkama aşamasından sonra, PBS tampon ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilmek üzere plaka dergisi bunları dönmeden önce mikroplakalara PBS içinde% 1 at serumu ve% 0.1 Tween 20 içeren blokaj tampon 100 ul dağıtmak çıkarın.
5. Immün için iki primer antikorlar kullanın: bir tavşan poliklonal anti-fare BACS antikoru, tam uzunlukta, SNAP-25 ve bir fare monoklonal anti-III tubulin antikor tespiti için nöronların (malzeme ve teçhizat bakınız) tespit edilmesi için. Kuluçkadan 60 dakika sonra, bloklama tamponunu çıkarın ve tüm plakalar halinde, bloke edici tampon içinde 4UG / ml BACS antikorun ve III-tubulin, 0.5 ug / ml, 50 ul dağıtmak.
6. RT% 0.05 Tween (PBST) içeren 100 ul PBS ile 3 kez primer antikorlar çıkarın ve yıkama de 1 saat süreyle inkübe edin.
7. Alexa F ile etiketlenmiş III tübülin ve anti-tavşan IgG görselleştirmek için Alexa Fluor 647 ile etiketlenmiş bir anti-fare IgG kullanınluor 568 BACS antikor görselleştirmek için. Bloke edici tampon içinde bir 2 ug / ml dilüsyon olarak antikorları hazırlamak ve her oyuğa, karışımın 50 ul dağıtmak.
   Not: immün için seçilen ikincil antikorlar Yüksek İçerik Imager detektör içinde farklı kanal kullanılarak farklı dalga boylarında salınan fluoresan algılanmasına izin vermek için, farklı flüorofor ile etiketlenir.
8. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. İkincil antikorlar aspire ve PBST içinde 100 ul 3 kez yıkayın.
9. Son yıkamadan sonra, çekirdekler tespiti için DNA leke içeren PBS Hoechst boya (32 uM) 100 ul ilave edin.
10. Işıkla ağartma gelen florofor korunması için bir ışık geçirmeyen film tabak mühürleyin. Plakalar 4 ° C'de saklanabilir   Sinyalin önemli bir kayıp olmadan haftalarca ° C.

3. Görüntüleme

NOT: Yüksek İçerik Görüntüleme Sys kullanarak görüntü alımı gerçekleştirintem (Malzeme ve Ekipmanları bakınız).

1. Yüksek İçerik Görüntüleyici Tanımlar Şartname:
   1. Seç Plaka tipi, düzen, alan sayısı, amacı: Greiner u berrak, 20X su sırasıyla 96 kuyu biçimi, 16.
   2. Kanalları seçin: nukleus uyarma EX: kanal 4 olarak 405 nm; sitoplazma EX: Kanal 2 olarak 644 nm; antijen spesifik antikor kanal Ex: 561 kanal 3 olarak mil ve her bir lazer ayarlama uyarım gücü, 2 etkisi başlıkları Ayar deney, 644 nm'de bir eksitasyon, 405 nm ve 561 nm'de iki uyarımları olan Pozlama 2 Pozlama 1. Bin2 olarak binning seçin.
   3. SNAP-25 kanal ve minimal yoğunluğu düşük kontrol kuyuları gibi maksimum yoğunlukta maruz optimizasyonu için yüksek kontrol kuyuları kullanın.
   4. Her kanalın yoğunluğu doyma seviyesi (2,000-2,500 göre ünite) yaklaşık yarısı olacak şekilde maruz kalma ayarlayın.
   5. Delta düzeltme script kullanarak hücre maske kanalda optimum Z uçağı tanımlayın. See Fiimmünoboyamayla ve görüntüleme sonra sonuçları için saat'in 5. Görüntü analiz yazılımı ikamet ediyor sunucuya İhracat verileri.

4. Görüntü Analizi (Şekil 6)

NOT: Aşağıdaki adımlar Columbus yazılım algoritmalarının uygulamasını açıklar.

1. Birincil nesneler (çekirdekleri) segmentine uygun bir algoritma seçin. Gerekirse, arka plan eşiği ve kontrast parametrelerini ayarlamak. Columbus Yazılım 4 çekirdekler algılama yöntemleri sağlar. Görsel Parçalara çekirdekleri incelenerek doğru kademeli çekirdekleri (F igure 6a yöntem M seçili) olduğunu yöntemini seçin.
2. Gerekirse, segment nevritlerle nörit algoritması (CSIRO Neurite Analizi 2) seçmek arka planı kaldırmak için arka plan eşik ve kontrast parametrelerini ayarlamak. Nevritlerle tespit etmek için kullanılan bir parametreler Şekil 6b.
3. Nevrit bölgeleri (nevrit segment) bas tespited β-III tubulin kanal maskesi (Şekil 6c) olarak (Alexa Un 640) bir -3 piksel açılımı kullanılarak ikincil nesneler (nevrotiler) üzerine.
4. Nevritler bölge ve β-III tubulin kanalı (Şekil 6d ve 6e) için sinyal kanallarının (SNAP-25, (Alexa unu 568) yoğunluğunu hesaplar.
5. Böyle bir nevrit uzunluğu, SNAP-25 ortalama yoğunlukları, β-III tubulin, çekirdekler numarası, nevrit segmenti numarası vb (Şekil 6f) gibi ihracat için istenen parametreleri seçin.
6. Görüntü alımı için Yüksek İçerik Imager içine robot ve yük kullanılarak plaka istifleyicilerden transfer plakaları.

5. Veri Analizi:

Tasarlanan tahlilin sağlamlığını değerlendirmek için, plaka bazlı deney, aşağıdaki parametrelerin hesaplanması.

1. Arka sinyal (S) (B): Düşük sinyal kontrolü S / B = ortalama /) yüksek sinyal kontrolü ortalama yoğunluğu yoğunluğu
sinyal ve arka Değişimi (CV) Katsayısı (özel sinyalinin tekdüzelik ölçmek için) reaktifler, vb
2. Gürültü Sinyal: S = - düşük kontrol / SD (sinyalin ortalama yoğunluğu düşük sinyal kontrolü ortalama yoğunluğu)
   1. Bir 96-yuvalı plaka yarısı ve diğer yarısı bir sahte zehirlenme zehirlenmesi ile Z 'faktör hesaplayın. Z '= 1 - 3 * (yüksek sinyal kontrol + düşük sinyal kontrolü SD SD) / (yüksek sinyal kontrolü anlamına - düşük sinyal kontrol ortalamasını). Eleme verilerinin daha fazla analiz için, bir plaka olarak, primer ham bazı parametrelerin karşılaştırılması plakaları arasında ve deneyler, farklı gün arasında izin vermek için normalize edilecektir.
3. % Yarılması =% 100 * (MEA: Tam uzunlukta olan SNAP-25'in spesifik antikor ile tespit (BACS) ile bağlantılı sinyalinin azalan yansıtan bölünme yüzdesi,yüksek sinyal kontrolü n yoğunluğu - numune yoğunluğu) / yüksek sinyal kontrolü ortalama yoğunluğu.
4. Parçalanmasının inhibisyonu yüzdesi:% İnhibisyon =% 100 * - / (- düşük sinyal kontrol ortalama yoğunluğu yüksek sinyal kontrol ortalama yoğunluğu) (örnek yoğunluğu düşük sinyal kontrol ortalama yoğunluğu).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yüksek ve düşük kontrolleri Veri 3 standart sapma (Şekil 7A) aşan iki medyan farkı ile iki ayrı popülasyonları yarattı. Tarama işleminin amacı, örneklem (Şekil 7B (i)) içerisinde normal dağılımı varsayılarak, daha yakın pozitif kontrol popülasyonuna değerleri ile örnek popülasyon içindeki bileşikler bulmaktır. Ortalama ötesinde 3 standart sapma veri noktaları gürültü istatistiksel olarak farklı kabul edilir ve aktif bir "hit" olarak sınıfla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Botulinum nevrotoksinlere ve silahlandırılması göreli kolaylığı, yüksek kuvvette Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri ABD tarafından Kategori A (en yüksek öncelik) biothreat maddeler olarak sınıflandırılması sonuçlandı. Ne yazık ki, hiçbir FDA toksin motor nöronlar tarafından içselleştirilmiş sonra BoNT'den zehirlenmelere karşı terapötikleri onaylanmış bulunmaktadır. BoNT zehirlenme nöronal iyileşme teşvik Herhangi druggable mekanizması bu biyolojik tehdide karşı silahlı hizm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack