보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석

요약

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

초록

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

서문

박테리아 클로 스트 리듐 보툴리눔은 보툴리눔 신경 독소, ¹ 인간에게 알려진 가장 강력한 생물 독소 중 하나를 생성합니다. 7 별개의 본트 혈청 형 (본트 / AG)이 있습니다. 본트는 / A-담즙으로 인해 SNARE 복잡한 단백질 분해 ^2,3에 신경 근육 접합부에서 마비를 유도한다. SNARE 단백질 분해는 신경 전달 물질 소포 - 막 융합을 방지하고, 따라서 블록은 신경 전달 ^물질을 세포 외 유출 ^(4). 특정 SNARE 목표 중독 과정에 참여 본트 특정 혈청 형에 의존한다. 본트 / A 및 본트 / E 클리브 SNAP-25 본트 / C의 절단 모두 SNAP-25과 신택 ⁵ 반면. 또한 소포 관련 막 단백질 (VAMP)라고 나머지 혈청 형 절단하고 시냅 토브 레빈은 (. 본트 / A는 그것이 자연적으로 발생하는 보툴리누스 중독의 높은 비율에 대한 책임으로 분석 개발을위한 선택과 작은 분자의 작용 ^6. 개발의 가장 긴 기간을 가지고 있었다 본트 / A에 대한 치료제는 주요 목표이다우리의 약물 발견 및 ^{프로그램은, 8-10은} 활성 부위의 단백질 분해 효소 억제제 ^(7)를 식별하는 기존의 목표 기반의 방법을 이용했다. 그러나, 다수의 혈청 형과 노광 후 효능에 대해 넓은 스펙트럼의 활성을 갖는 활성 부위 억제제의 생성 가능성이 문제가 될 것이다.

따라서 우리는 본트 매개 운동 신경 중독을 차단할 수있는 작은 분자를 식별하는 기능을 엔드 포인트로 본트 SNAP-25의 절단을 사용하는 혁신적인 표현형 신약 개발 접근 방식을 구현했습니다. SNAP-25은 생체 내에서 마비와 치사의 예측이다 SNAP-25의 저하와 같은 신경 전달 물질의 방출이 필요합니다. 예를 들어, 세포 기반 스크리닝은 독소를 불 활성화 또는 표적 세포 내 독소 경로의 억제에 대한 책임 세포 요소의 새로운 변조기의 발견으로 이어질 수 있습니다. 표현형 분석 발달에 중요한 요인은 생리적으로 중요한 생물학적 모델의 선택이다. W전자 등은 SNAP-25 ^{11 - 13의} 발현을 포함한 일차 운동 신경 세포의 면역 학적 특성을 요점을 되풀이 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 유래 운동 신경을 설명했다. 중요한 것은, 이러한 셀룰러 시스템은 본트 / A 중독에 매우 민감하고 독소 ^{11, 12의} 농도 증가에 대한 응답으로 SNAP-25의 용량 의존적 분열을 보여줍니다. 차별화 운동 뉴런은 고 스루풋 플레이트 기반 분석 충분 셀룰러 분석법 어레이의 설계를 허용 양이 생산된다.

표현형 분석은 본트 / 마우스 운동 신경 문화의 중독시 내생 적으로 표현 된 전체 길이 SNAP-25의 분열을 정량화하는 두 가지 항체를 이용한 면역 형광 방법입니다. 단지 전체 길이 SNAP-25를 인식 카복실 말단 본트 / A 분열에 민감한 (BACS) 항체는 SNAP-25의 본트 / A 매개 단백질 분해의 평가를 할 수 있습니다마우스 모터의 발현은 ¹⁰ 뉴런. HCI 분석의 개략도는도 1에 도시된다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

플레이트 20,000 차별화 된 마우스 ES 세포 (MES) / 웰 96 웰 폴리 D 라이신 코팅 된 플레이트에 5-7 일 운동 신경 터미널 차별화 미디어에서 유지한다.

본트 / A 1. 복합 관리 및 중독

CDC / NIH 가이드 라인을 준수하기 위해 BSL2 인클로저에 다음과 같은 모든 작업을 수행합니다.

1. 폴리 프로필렌 96 웰 플레이트에 100 % DMSO의 각 라이브러리 화합물의 10 mM의 재고 솔루션을 준비합니다. 원하는 검사 농도보다 10 배입니다 중간 희석 판을 준비하기 위해 10 mM의 주식을 사용합니다. 96 웰 플레이트에 10 mM의 주식을 분배 100 μM의 중간 판을 준비하고 문화 미디어를 사용하여 100 μM의에 희석. 셀 ^(11)에 미디어의 90 μL에 화합물의 10 μl를 분배. 10 μM의 최종 농도에서 시험 화합물 0.5 %를 초과하지 않는 DMSO의 최종 비율을 확인.
2. 모든 스터드를 수행바이오 안전성 수준이 조건에서 살아있는 세포 활성 독소를 활용 이거 야. 신선한 터미널 차별화 미디어의 80 μL은 12 채널 매뉴얼 피펫을 이용하여 96 웰 플레이트에서 기존 미디어를 교체합니다. 흡입을 수행하고 주위 공기에 용지없이 세포의 노출을 방지하기 위해 행함으로써 단계를 분배.
3. (2 회) 종래 흡인 혼합하여 12 채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트에서 10 배 화합물 10 ㎕를 첨가하여 독소의 애플리케이션 화합물과 세포를 전처리. 각 96 웰 플레이트를 들어, 높은 신호와 낮은 신호 제어를 제공하기 위해 미디어에 희석 10 배 DMSO 6 우물의 두 열을 취급합니다. 본트의 처리없이 열은 전체 길이 SNAP-25 (높은 신호 제어)의 최고 수준을 나타낸다. 낮은 신호 제어와 같은 (어떤 화합물없이) 혼자 본트와 다른 열을 처리합니다. (BACS 항체와 SNAP-25의 검출 본트 절단의 효율성을 관찰하기 위해 그림 2의 컨트롤을 사용하여).
4. 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 및 6 % CO _2의 화합물과 세포를 부화.
5. 인산염에 1 ㎎ / ㎖ 상용 소스에서 보툴리눔 신경 독소 A를 준비 터미널 차별화 미디어 희석하여 최종 10 배 근무하는 식염수 (PBS)를 버퍼.
6. 멀티 채널 피펫 (그림 2)를 사용하여 치료 및 낮은 신호 컨트롤에 대해 지정된 우물에 10 배 본트 / A 주식의 10 μl를 추가하여 중독을 시작합니다. 형 미디어와 높은 제어로 지정된 우물을 취급합니다.
7. 20 분 이상 물에 0.825 % 차아 염소산 용액에서 침수로써의 연구 기간 동안 본트 / A와 접촉하는 모든 플라스틱 구조물 및 기타 일회용 오염을 제거. 바이오 안전성 캐비닛의 모든 절차를 수행하고 이전과 같은 MICROCHEM 솔루션으로 5 % 세제 살균제 청소기로 실험 전후에 작업 지역의 오염을 제거.
8. 독소 사용 incub을 나타 내기 위해 명확하게 번호판을 레이블먹었다 플레이트 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 4 시간과 6 % CO _2는 1nm / L가 본트 / A로 처리 하였다. 독소는 실험실에서 사용 중임을 동료들에게 알려 적절한 간판을 표시합니다.
9. 정지 본트 / 메탄올 고정하여 단백질 분해 절단. 멀티 채널 피펫 각 우물에서 독소 및 화합물을 포함하는 미디어를 제거하고 10 % 표백제 용액에 버린다. 각 웰에 직접 얼음 냉 메탄올 (100 μL)를 추가합니다.
10. 정착이 발생할 수 있도록, 실온 (RT)에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션.
11. 고정 후, 안전하게 바이오 안전성 레벨 1 프로토콜을 폐기 시약 (중화 간주)을 처리하고 그에 따라 폐기하십시오.
12. 메탄올을 취소하고 세포를 씻어 면역 염색하기 전에 그들을 재수하는 PBS 100 μl를 사용합니다. 두 개의 추가 PBS 세척을 수행합니다.
13. 최종 세척 한 후, 분석 할 때까지 4 ° C에서 마이크로 접착 필름 및 저장소와 우물, 인감 플레이트에 PBS를 둡니다. 4 ° C의 FO에서 보관 판며칠 r에.

2. 면역 염색

면역 염색 과정은 상당한 intraplate과 interplate 변화의 잠재적 인 도입으로 이어질 수 반복 시약 분배 / 대기음주기와 폭 넓은 플레이트 세척을 포함하는 노동 집약적, 다단계 작업입니다. 반자동 방식은 실험실 요원의 시간을 절약 분석 처리량을 증가시키고, 면역 염색 변동성을 최소화하기 위해 적용된다.

1. 이 프로토콜에 대한 모듈러 갑판의 다른 위치 (재료 및 장비를 참조)로 실험 실용을 이동 로봇 그리퍼 아암 250 μL 및 집적 볼륨을 전송할 수있는 96- 웰 헤드를 갖춘 자동화 된 워크 스테이션을 사용한다.
   1. 모듈 형 데크 실험 실용의 다른 유형을 개최하고 한 번에 최대 11 항목에 지원할 수있는 설계되었습니다. 자동 마이크로 처리기가 유지하기 위해 이중 잡지 마이크로 플레이트 스태커를 구비하고,사이클 당 50 판까지 조작 할 수 있습니다.
   2. 자동화 된 워크 스테이션은 불임과 안전을 제공하기 위해 실험실 자동화 장비를 위해 설계된 클래스 II 생물 안전 캐비닛의 내부에 있습니다. 필요에 따라 인간의 개입없이 시약 액세스 할 수 있도록도 3에 도시 된 바와 같이 자동 면역 염색을 위해, 갑판 배치된다.
2. 액체 처리 동작에 필요한 갑판 플레이트 잡지 및 전송로 고정 된 세포를 포함하는 사전로드 플레이트. 아래로 10 μL로 우물에서 PBS를 대기음 250 μL 팁 장착 (96) 피펫 헤드를 사용합니다. 투과성으로 완충액 (0.1 % 트리톤 X-100)으로 세포 내 표적에 결합하는 항체를 용이하게 세포막을 Permeabilize 하시려면. 웰을 실온 (RT)에서 15 분 배양 용 마이크로 플레이트 스태커의 제 2 저장 잡지 판을 반환하기 전에 각으로 투과성으로 완충액 (100 μL)를 분주한다.
3. 투과성으로 버퍼와 PE를 제거PBS (2 회)와 rform 플레이트의 세척은 이전 단계 1.13에 설명.
4. 마지막 세척 단계 후, PBS 완충액 및 RT에서 1 시간 인큐베이션 판 잡지에 반환하기 전에 모든 마이크로 플레이트에 PBS에 1 % 말 혈청, 0.1 % 트윈 20을 함유하는 블로킹 완충액 100 ㎕를 분배 제거.
5. 면역 염색에 대한 두 가지 기본 항체를 사용하여 토끼 폴리 클로 날 항 - 마우스 BACS 항체를, 전체 길이 SNAP-25와 마우스 단일 클론 항 III 튜 불린 항체의 검출 뉴런 (재료 및 장비를 참조)의 검출. 인큐베이션 60 분 후, 블로킹 완충액 제거하고 모든 플레이트에 블로킹 완충액에 4ug / ㎖ BACS 항체 및 III-tubulin의 0.5 ㎍ / ml의 50 μl를 분배.
6. RT는 0.05 % 트윈 (PBST)을 포함하는 PBS 100 ㎕로 3 회 차 항체를 제거하고 세척에서 1 시간 동안 품어.
7. 알렉사 F 태그 -III의 tubulin 및 안티 - 토끼 IgG를 시각화하는 알렉사 플 루어 647 표지 항 마우스 IgG를을 사용하여luor 568 BACS 항체를 시각화합니다. 버퍼를 차단에 2 ㎍ / ㎖의 희석 등 모두 항체를 준비하고 각 우물에 혼합물의 50 μl를 분배.
   참고 : 면역 염색으로 선택 이차 항체는 높은 함량 이미 저의 검출기 내에서 서로 다른 채널을 사용하여 서로 다른 파장에서 그들의 방출되는 형광 빛을 감지 할 수 있도록 서로 다른 형광 물질로 표시되어 있습니다.
8. 실온에서 1 시간 동안 품어. 이차 항체를 대기음 PBST 100 ㎕로 3 회 씻는다.
9. 최종 세척 후, 핵 탐지를위한 DNA를 얼룩 PBS 포함 훽스트 (Hoechst) 염료 (32 μM) 100 μL를 추가합니다.
10. photobleaching에에서 형광을 보호하기 위해 빛 투과성 필름 판을 밀봉합니다. 플레이트는 4 저장할 수 있습니다   신호의 상당한 손실없이 주 동안 C를 °.

3. 영상

참고 : 높은 콘텐츠 이미징 sys 인을 사용하여 이미지 수집을 수행TEM (재료 및 장비를 참조하십시오).

1. 고 함량 이미 저 정의의 사양 :
   1. 선택 플레이트 형, 레이아웃, 필드의 수, 목적 : 그레이 너 U 분명, 20 배의 물을 각각 96 웰 형식, 16,.
   2. 선택 채널 : 핵 여기 EX : 채널 4와 같은 405 nm의; 세포질 EX : 채널 2와 같은 644 nm의; 항원 특이 항체 채널 EX : 561 채널 3과 나노 각 레이저의 설정 여기 전원, 2 노출로 설정 실험, 644 nm에서 하나 여기, 405 nm의 561 nm에서 두 음원 정보와 노출 2 노출 1. BIN2으로 비닝 (binning)을 선택합니다.
   3. SNAP-25 채널과 최소한의 강도에 대한 낮은 제어 우물로 최대 강도와 노출 최적화를 위해 높은 제어 우물을 사용합니다.
   4. 각 채널의 강도가 포화 레벨 (2,000-2,500 상대 단위)의 약 절반이되도록, 노출을 조정한다.
   5. 델타 보정 스크립트를 사용하여 셀 마스크 채널에 최적의 Z 평면을 식별합니다. 참조 인터넷면역 염색 및 이미징 후 결과를 gure 5. 이미지 분석 소프트웨어가 상주하는 서버에 데이터를 내 보냅니다.

4. 이미지 분석 (그림 6)

주 : 다음 단계는 콜럼버스 소프트웨어 알고리즘의 응용 프로그램을 설명합니다.

1. 기본 객체 (핵) 세그먼트에 대한 적절한 알고리즘을 선택합니다. 필요한 경우, 배경 임계 값 및 대비 매개 변수를 조정합니다. 콜럼버스 소프트웨어는 4 핵 검출 방법을 제공한다. 시각적으로 분할 핵을 검사하여 정확하게 세그먼트 핵 (F igure의 6A 방법 M에서 선택한 경우)하는 방법을 선택합니다.
2. 필요한 경우, 세그먼트에 신경 돌기를 신경 돌기 알고리즘 (CSIRO 신경 돌기 분석 2) 선택 배경을 제거하기 위해 배경 임계 값 및 대비 매개 변수를 조정합니다. 신경 돌기를 감지하는 데 사용 매개 변수도 6b를 참조하십시오.
3. 신경 돌기 지역 (신경 돌기 세그먼트) BAS를 확인ED β-III 튜 불린 채널 마스크 (그림 6C)와 같은 (알렉사 밀가루 640)의 -3 픽셀 확장을 사용하여 보조 객체 (신경 돌기)에.
4. 신경 돌기 영역 및 β-III 튜 불린 채널 (그림 6D 및 6E)에 대한 신호 채널 (SNAP-25 (알렉사 밀가루 568)의 ​​강도를 계산합니다.
5. 이러한 신경 돌기의 길이, SNAP-25의 평균 강도, β-III의 튜 불린, 핵 번호, 신경 돌기 세그먼트 번호 등 (그림 6 층) 등의 수출에 원하는 매개 변수를 선택합니다.
6. 이미지 획득을위한 고 함량 이미 저에 로봇과 부하를 사용하여 플레이트 스태커에서 전송 접시.

5. 데이터 분석 :

설계된 분석의 견고성을 평가하기 위해, 플레이트 기반 실험으로부터 다음과 같은 파라미터를 계산한다.

1. 배경에 신호 (S) (B) : 낮은 신호 제어의 S는 / B = 의미 /) 높은 신호 제어의 강도를 의미 강도
<액체 취급에 변동을 결정하는, CV = (표준 편차 (SD) 시료 / 평균) * 100 (%) : 리> 신호와 배경의 변동 (CV)의 계수 (특정 신호의 균일 성을 측정) 시약 등
2. 잡음 신호 : S는 = - 낮은 제어 / SD을 (신호의 강도를 의미하는 낮은 신호 제어의 강도를 의미)
   1. 하나의 96- 웰 플레이트의 절반 및 나머지 절반의 모의 중독 중독과 Z '팩터를 계산한다. Z '= 1 - 3 * (높은 신호 제어 + 낮은 신호 제어의 SD의 SD가) / (높은 신호 제어의 의미 - 낮은 신호 제어의 평균). 스크리닝 데이터의 추가 분석을 위해, 플레이트에 기초 기본 원료 일부 파라미터 비교 판 사이 실험의 다른 일 사이 있도록 정상화.
3. 쪼개짐 % = 100 % * (MEA : 전체 길이 SNAP-25 특이 적 항체에 의해 검출 (BACS)와 연관된 신호의 감소를 반영하는 분열의 퍼센트,높은 신호 제어 n 개의 강도 - 시료의 강도) / 고 신호 제어의 강도를 의미한다.
4. 분열의 억제 백분율 : 억제 % = 100 % * - / (- 낮은 신호 제어의 강도를 의미하는 높은 신호 제어의 강도를 의미) (샘플의 강도는 낮은 신호 제어의 강도를 의미한다).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

높고 낮은 컨트롤의 데이터는 3 표준 편차 (그림 7A)를 초과하는 두 중간 값의 차이가 별개의 두 집단을 만들었습니다. 선별 과정의 목적은 샘플 모집단 (도 7b, (ⅰ)) 내의 정규 분포를 가정하여, 가까이 양성 대조군 인구 값 샘플 모집단 내의 화합물을 찾는 것이다. 평균 이상 3 표준 편차이다 데이터 포인트는 소음에서 통계적으로 다른 생각과 활성 "히트"로 분류된?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

보툴리눔 신경 독소와 무기화의 상대적 용이성의 높은 효능 미국 질병 통제 예방 센터에 의해 분류 (가장 높은 우선 순위) biothreat 에이전트로서의 분류 가져왔다. 불행하게도 FDA는 독소는 운동 신경에 의해 내면화 된 후 본트 중독에 대응하기 위해 치료제를 승인하지 있습니다. 본트 중독에서 신경 세포의 회복을 촉진 모든 druggable 메커니즘이 생물학적 위협에 대한 군사 및 공공 모두를 보호하기 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack