שיטה מאוד לשחזור וישיר לביצוע<em&gt; בVivo</em&gt; Ocular Enucleation בעכבר לאחר פתיחת העיניים

Summary

הסרת עיניים, המכונות גם אנוקלאציה, מספקת אסטרטגיה שימושית ללמוד היבטים של מודלי חוצי חזותיים,, ופלסטיות התפתחותית לאורך מערכת הראייה של יונקים שכן הוא גורם בלתי הפיך חלקית (משקפת) או אובדן ראייה (משקפת) מלא. כאן אנו מתארים גישה לשחזור וברורה מאוד לביצוע באנוקלאציה vivo.

Abstract

Enucleation או הסרה כירורגית של העין, בדרך כלל, יכול להיחשב כמודל לdeafferentation עצב. הוא מספק כלי רב ערך כדי ללמוד את ההיבטים השונים של, מודאלי חוצי החזותי ופלסטיות התפתחותית לאורך מערכת הראייה של היונקים ^1-4.

הנה, אנחנו מדגימים טכניקה אלגנטית ופשוטה להסרת אחד או בשני העיניים בעכבר, אשר קיבלה תוקף בעכברים של 20 ימים ההם עד מבוגרים. בקצרה, מלקחיים מעוקלים חיטוי משמש כדי לצבוט את עצב הראייה מאחורי העין. בהמשך לכך, תנועות סיבוביות מבוצעות כדי להצר את עצב הראייה ולהסיר את גלגל העין. היתרונות של שיטה זו הם שחזור גבוה, מינימאלי ללא דימום, התאוששות שלאחר ניתוח מהירה וסף למידה נמוך מאוד לניסוי. לפיכך, כמות גדולה של בעלי חיים ניתן להשפיע ומעובד עם כמות מינימאלית של מאמץ. הטבע של הטכניקה עשוי לגרום לניזק קל להרשתית במהלך ההליך. תופעת לוואי זו הופכת שיטה זו פחות מתאים לעומת Mahajan et al. (2011) ⁵ אם המטרה היא לאסוף ולנתח רקמת רשתית. כמו כן, השיטה שלנו היא רק לגילי הודעה מאיירים עיניים (עכבר: P10 - 13 ואילך) מאז גלגל העין צריכה להיות עקורה מהשקע מבלי להסיר את העפעפיים. לאחרונה in vivo טכניקת אנוקלאציה המתוארת בכתב היד הזה כבר מיושם בהצלחה עם שינויים קלים בחולדות ונראית שימושי כדי ללמוד את המסלול החזותי מביא מכרסמים באופן כללי.

Introduction

הסרת עין ובכך באופן בלתי הפיך בהרס המשטח החושי קולט (רשתית), מטיל אובדן ניכר של קלט חושי לאורך המסלול החזותי. מודל אנוקלאציה במערכת הראייה לנוער ומבוגרים הוכיח להיות יקר בהבנת ההתפתחות, הפלסטיות והתפקוד של מרכזים חזותיים השונים ^1-4. השלכות מולקולריות, תאיות ופיזיולוגיות של החסך החושי הזה יכול לספק תובנות על אופן בי פיתוח מוסדר וכיצד הוקם מעגלים בקליפת המוח להתמודד ולשנות את המבנה והתפקוד שלהם בתגובה לשינוי נרחב כזה בניסיון.

שיטות שונות של קיפוח חזותי קיימות ולכולם יש יתרונות הספציפיים שלהם במחקר הקשור לחזון. לגידול כהה דוגמא ספציפית מבטל חזותי מונע פעילות עדיין זה לא משפיע על פעילות הרשתית הספונטנית. visua באופן דומה, תפרי מכסה או רטיות להסיר את הדוגמתקלט l מבלי להפריע פעילות ספונטנית אך הם מאפשרים חדיר אור מפוזר דרך עיניו הסגורות. שיטות אלה הן הפיכים והוכחו להיות בעל ערך בהבנת תפקידו של מתאם חזון ורמה נמוכה בדוגמת תשומות משקפת בפיסול מעגלים בקליפת המוח במהלך ההתפתחות ^6-8. במחקר גלאוקומה, המודל למעוך עצב הראייה בבעלי חיים מבוגרים כבר בשימוש נרחב משום שהוא קובע אובדן הדרגתי של תשומות תא הגנגליון ברשתית, המהוות את עצב הראייה ^9,10. מצד השני, אנוקלאציה, בו העין ובכך הרשתית נמחקה לחלוטין ומייד, היא הבחירה המתאימה של קיפוח כאשר המטרה היא להסיר את החזון שני ספונטני ובלתי הפיך בדוגמת בבת אחת. זה גם גורם לחוסר איזון בפעילות התוך עיני חזק שיכול לשפר את יחס האות לרעש במחקרי מיפוי פעילות ^11,12. השוואת שינויים תפקודיים ומבניים בתגובה לאנוקלאציה עם הOSE לאחר החסך בשיטות דרסטיים פחות כגון תפר מכסה למשל, עשויים גם לחשוף תובנות חדשות על תפקידה של פעילות רשתית ספונטנית בשני סוגים ההומיאוסטטית והסינפטי של פלסטיות.

Enucleation מפעיל אובדן של השפעות תזונתיות ביעדי רשתית ישירים. לדוגמא, רמות BDNF הם downregulated באופן משמעותי בגרעין לרוחב הברכיתיים (LGN) וcolliculus מעולה של חולדות enucleated מבוגרות ^13. מיני חמצן תגובתי, שמתפקדים כמולקולות שליח לתווך שיפוץ מבני, גם התגלו במבנים קורטיקליים של החולדה הבוגרת מערכת ראייה ^14. יתר על כן, microglial והפעלת astroglial פני מבני יעד שונים קורטיקליים חזותיים בעכבר מתרחשים במסגרת זמן ההודעה אנוקלאציה ספציפית של שבוע ¹⁵ אחד. יחד, תוצאות deafferentation אופטיות בתגובות קורטיקליים שונות בגליה, הרמה מבנית ומולקולרית. למרות קורטיקליים אלהאפקטים, זה לא בהכרח לסבך השפעות ברמת קליפת המוח ^16. פלסטיות ראויה לציון, צלב מודאלית בקליפת המוח, ובכלל זה שינויים באזורים חושיים אחרים הבא לחיזוקו של תשומות שאינן חזותיות לנשללה קליפת הראייה מתרחשת לאחר שתי המשקפת (ME) ^3,4,17,18 ומשקף (BE) ^1,17 אנוקלאציה.

מלבד תרומה למדעי מוח חזותי, אנוקלאציה כסוג של deafferentation יכולה לשמש כדי ללמוד את האיזון בין ^20-22 תכונות הגנה עצביות ¹⁹ וניווניות של מערכת העצבים המרכזית.

הליכים שונים לביצוע אנוקלאציה כבר תוארו בספרות. מתודולוגיות מסוימות לin vivo ME בחולדות ועכברים הן פחות ברורות בשל חתך מיותר של שרירים ורקמות ^23-25 ​​מסלולית. פרסומים אחרים כגון Mahajan et al. (2011) ⁵ מספקים פרוטוקול מפורט באמצעות נתיחה בוטה לאוסף תפוקה גבוהה של עיניים כדי ללמוד את מתאמי גנוטיפ, פנוטיפ, שלאחר המוות צפוי. למטרתם, השיטה נוחה ומהירה. עם זאת, שיטה זו היא פחות מתאימה לאנוקלאציה in vivo, כאשר אחד בוחר ללמוד במסלול החזותי מביא הבא אנוקלאציה (בבעלי חיים), ולא בעין עצמה. בסביבה כזו, הישרדות ההודעה אנוקלאציה-היא בעל חשיבות גבוהה. כמו כן, מינימאלי בנזק vivo ושימור של עצב הראייה ורקמות מסלולית הוא חיובי. כאן, אנו מציגים שיטת אנוקלאציה חלופית, יותר דומה לזה שתואר על ידי פאגה et al (2008) ^26, המציע מאפייני יתרון מסוימים:. זה קשור להתאוששות שלאחר ניתוח מהיר ומאופיין בסף למידה נמוך מאוד לחוקרים. באופן כללי, שיטות שונות משלימות בהתאם למוקד של המחקר הבא: מורפולוגיה עין או מחקר מסלול חזותי.

ve_content "> לסיכום, אנוקלאציה ניתן ליישם ממחקר חזון כלפי חקירות של פלסטיות ההומיאוסטטית וחוצת מודאלי מוח, מאפייני תגובת גליה, ויציבות האקסון. במאמר דמיין את זה, אנחנו מדגימים שיטה ריאלי ואמינה לin vivo אנוקלאציה עין ב העכבר.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי ועדת המחקר האתית של KU Leuven והיו בהתאם קפדן עם הקהילות האירופיות הנחיית המועצה של 22 ספטמבר 2010 (2010/63 / איחוד אירופי) ועם החקיקה הבלגית (KB של 29 מאי 2013). כל מאמץ אפשרי נעשה כדי למזער את הסבל של בעלי חיים ולצמצם את מספרם של בעלי החיים.

.1 בעלי החיים טיפול וחומרי הרדמה

1. להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של תערובת של קטמין הידרוכלוריד (75 מ"ג / מ"ל) וhydrochloride medetomidine (1 מ"ג / קילוגרם) בתמיסת מלח.
2. בדקו את הרפלקסים ידי צובט את קצות האצבעות עם מלקחיים כדי להבטיח את העכבר הוא מסומם לחלוטין.
3. החל 70% אתנול לחיטוי העפעפיים והאזור שמסביב לעין באמצעות קצה כותנה. בדוק את רפלקס העפעף כדי להעריך את מידת ההרגעה בנוסף.

2 הסרת עין

1. ודא בעלי החיים שוכנות ובשטוח, יבשמשטח חלק.
2. לעקר מלקחיים עם קצה משונן (גודל העדיף טיפ: 0.5 x 0.4 מ"מ) מעוקל,.
3. לחץ בעדינות על גבי canthus (פינה של העין) עם המלקחיים עד גלגל העין היא עקור מהשקע ועצב הראייה הוא נגיש.
4. מדריך המלקחיים מאחורי העין. לחץ והחזק את עצב הראייה בתקיפות, רצוי עם תחילת העקומה ולא את קצה קצהו של המלקחיים. זה יעזור להרים את העולם מהשקע ומהדק את עצב ראייה המלא.
5. לעשות תנועות מעגליות עם היד האוחזת במלקחיים בכיוון עם ההתנגדות לפחות בזמן שהעכבר נשאר על המשטח השטוח. העכבר יהיה נדנדה על פני השטח בהתאם לכיוון של תנועת הידיים.
6. לבצע פעולה זו במהירות הולכת וגוברת בהדרגה עד לעצב הראייה מכווץ בשני (בדרך כלל בין 7 עד 15 תנועות סיבוביות, כ חצי לסיבוב מלא אחד לשנייה). לפיכך, גלגל העין המנותק היאהוסר.

טיפול .3 לאחר ניתוח

1. במקרה של דימום (נדיר), למלא את המסלול עם להקריש צמיג וסוכן עוצר דמום.
2. הפוך את ההרדמה על ידי הזרקת 1 מ"ג / ק"ג atipamezol hydrochloride מלוחים intraperitoneally.
3. נהל 1 מ"ג / ק"ג Meloxicam intraperitoneally כל שעה 24 כדי להקל על כאב.
4. החל משחה עין לעין שנותרה על מנת למנוע התייבשות של הקרנית.
5. בואו החיה להתאושש על צלחת חימום או לעטוף את החיה בחומר בידוד בכלוב נפרד כדי לשלוט בטמפרטורת גוף.
6. מדוד את המשקל של העכבר בכל יום לפחות 2 ימים. ירידה במשקל של יכולה להצביע על סבל ובמקרה הזה, להמשיך את טיפול Meloxicam עד שהחיה הוא התאושש באופן מלא.

תוצאות

איור 1 מדגים את ההסרה המוצלחת של העין באמצעות הפרוטוקול המתואר ומאופיין בהעדר הדימום או כל נזק פיזי נראית לעין לרקמה מסלולית או שקע העין (איורים 1 א, 1 ב '). יתר על כן, יש לו את העין הוסרה קרנית חלקה, דמית העין ודיסק אופטי, מעיד על עולם שלם לחלוטין (תרשים 1C). מאז הפרוטוקול שלנו כולל ההידוק של עצב הראייה מאחורי העין ומפנה מכאניים, עצב הראייה של העין שהוסרה הוא מכווץ בבסיס של הרשתית (1D איור). ביצוע תוצאות ההליך המתואר בעצב ראייה ומסודר ללא כל נזק לאזור במוח שמסביב (איור 1E).

אנוקלאציה משקפת, בשילוב עם מיפוי פעילות (איור 2), מאפשרת לשרטט בחדות אזורי הקלט הפונקציונליים או עין ספציפית בvisua הנגדיקליפת l של העכבר ^12,27 או עמודות דומיננטיות אפילו עיניות ביונקים מסדר גבוה כמו קופים ^28.

בניסויים עם עכברים, הסרת אחד (ME) או בשני העיניים (להיות) בשילוב עם גירוי חזותי ממוקד וזיהוי של zif268 רמות ביטוי חלבון mRNA או c-Fos יושם לחשוף הפעלה עצבית אזורית בקליפת המוח הראייתית ^12,27 . בניגוד לבקרות מגורה מבחינה ויזואלית (איור 2 א), עכברי BE הראו פעילות בסיסית בראייה כתוצאה מהשלמת חוסר הקלט החזותי (איור 2) הקליפה. ככזה, הגבולות בין חזותי עם שאינה קליפת ראייה (כלומר. קליפה החושית במקטעים נוספים קדמי וקליפת מוח השמיעתית במקטעים נוספים אחורי) נחשפו. תוצאות מעכברי ME עם זמן הישרדות של שבוע דמיינו אזורי קלט מסוימים עין בנגדית קליפת הראייה. שני האזורים מונעים monocularly היו hypoactive וממוקמים Medi אל ורוחב של האזור המשקפת המרכזי (איור 2 ג).

איור 1 הערכה איכותית של מדינת פוסט אנוקלאציה-של שקע העין, העין הוסרה ועצב הראייה. לאחר הסרת עין עם מלקחיים מעוקלים () אין דימום או נזק הוא ציין בשקע העין (B). עין שהוסרה היא שלמה לחלוטין כפי שמשתקף במראה רגיל של הקרנית ודמה העין (C, D). עצב הראייה הוא מכווץ בדיסק האופטי שבו הוא עוזב את העין (ד '). בדיקה של החלק הגחוני של המוח מגלה עצב חתך נקי אופטי (כוכבית) ולא נגרם נזק ניכר למבנים אחרים (E). ברים סולם בC, D: 1 מ"מ. סרגל קנה מידה בE: 5 מ"מ. : קדמי; L: שמאל; P: אחורי; R: תקין.

"Jove_content" FO: לשמור-together.within-page = "תמיד">
איור 2 יחידות משנה פונקציונליות עין קלט ספציפית בעכבר קליפת המוח הראייתית כפי שנחשפו על ידי אנוקלאציה. קווים שחורים ואפורים המחברים את העיניים וקליפת המוח מייצגים את המעבר של מעל afferents רשתית ואזורי קלט הספציפיים עין. פעילות עצבית היא מדמיין על סעיפי העטרה של שליטה (), BE (B), וME עכברים (C) על ידי רדיואקטיביים בכלאה באתר (ISH) לzif268 (בסולם אפור) סביב רמת גבחת -3.40 מ"מ. בבעלי חיים שליטה (), קליפת המוח הראייתית בשני חצי הכדור מבטאת פעילות גבוהה בעקבות גירוי חזותי. כאשר עין אחת או בשני (ים) הושמדה, ירידה ברורה באות הפעילות גלויה במקביל אזורים בקליפת המוח מקופחים. Monocularly enucleated עכברים (C) להראות אזור הגבוה activity באזור המשקפת של החזותית מוקפות אות ירד באזורים המשקפים נגדי לעין שהוסרה הקליפה. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. הודפס מחדש באישור ומאן בריסל et ¹² אל.

Discussion

כדי לבצע אנוקלאציה מוצלחת על פי השיטה שלנו, השלבים הקריטיים ביותר שיש לשקול הם: 1) שימוש במלקחיים עם קצה מעוגל ומשונן בגודל המתאים; 2) ביצוע אנוקלאציה על משטח חלק ויבש; ו 3) נהיגה במהירות מופרזת בהדרגה עד התנועות הסיבוביות בכיוון עם החיכוך לפחות.

לתוצאה אפקטיבית הוא חיוני לשימוש במלקחיים מתאימים מאופיינים בקצה מעוגל ומשונן (גודל קצה העדיף: עכבר: 0.5 x 0.4 מ"מ; חולדה: 2.15 x 1.3 מ"מ). העקמומיות מאפשרת גישה קלה לעצב הראייה לאחר עקירת גלגל העין ויש צורך ליד המיקום נכון בעת ​​ביצוע התנועות מעגליות. טיפים חלקים אינם מומלצים מכיוון שהם חסרים את האחיזה ההכרחית כאשר מחזיקים את עצב הראייה. כישלון להחזיק את עצב הראייה כראוי במהלך התנועות הסיבוביות תוצאות בקרע של עורק העיניים, ניתוק עני של העין ושחזור עני ומכאן.לכן מומלץ לאימון ראשון בטכניקה זו על בעלי חיים מורדמים לאופטימיזציה של המלקחיים טיפול על מנת להבטיח את רווחת בעלי חיים מקסימלי פעם יישום שיטת in vivo. אנוקלאציה עין המוצלחת לאחרונה גם בוצעה בעכברים במעבדה שלנו משתמשת באותה הטכניקה, פרט להפיכת הגוף של בעלי החיים באופן ידני ושמירה נייחת מלקחיים.

מגבלה אחת של הטכניקה היא שזה יכול לגרום נזק לרשתית. לכן שיטה זו היא פחות מתאימה לאיסוף רשתיות לבצע היסטולוגיה ^5. יתר על כן, השיטה שלנו היא מוגבל לפרסם גילאי עין פתיחה מאז גלגל העין צריכה להיות עקורה מהשקע מבלי להסיר או חיתוך העפעפיים.

אנוקלאציה עין במינים שונים, ביניהם מכרסמים, מבוצעת באופן שוטף תוך שימוש בשיטות חלופיות, אשר לעתים קרובות כרוכה בהסרה של העפעפיים וחיתוך עצב הראייה ^18,23-25. metho אלהds נוטה להיות פולשנית יותר ויש להם עקומה למידה גבוהה יותר מאשר הטכניקה המתוארת כאן. ללא צורך בהסרה או תפירת העפעפיים, זמן ההחלמה לאחר ניתוח הוא ממוזער, וכתוצאה מכך לרווחת בעלי חיים גבוהה יותר ותוצאות לשחזור יותר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine hydrochloride (Anesketin)	Dechra Veterinary Products (Eurovet)	BE-V136516
Medetomidine hydrochloride (Domitor)	Orion Corporation (Janssen Animal Health)	BE-V151742
Atipamezol hydrochloride (Antisedan)	Orion Corporation (Elanco Animal Health)	BE-V153352
Meloxicam (Metacam)	Boehringer Ingelheim Vetmedica	N/A
Eye ointment (Fucithalmic)	Leo Pharma nv-sa	BE 144654
Moria MC31 Forceps - Serrated Curved	Fine Science Tools	11370-31	For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Narrow Pattern Forceps - Curved	Fine Science Tools	11003-13	For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Hemostatic cotton wool	Qualiphar	N/A	Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products)