A Çok Reproducible ve Kolay Yöntem gerçekleştir<em&gt; In Vivo</emGöz açılışı sonrası Mouse&gt; Göz Enükleasyon

Özet

Ayrıca enüklüeasyon denilen gözlerin kaldırılması, geri dönüşümsüz kısmi (monoküler) veya tam (binoküler) görme kaybına neden olduğundan memeli görme sistemi boyunca görsel, çapraz modal ve gelişimsel plastisite yönlerini incelemek için yararlı bir strateji sağlar. Burada vivo enükleasyonuna gerçekleştirmek için son derece tekrarlanabilir ve basit bir yaklaşım açıklar.

Özet

Enükleasyon ya da bir göz cerrahi olarak çıkarılması genel olarak sinir deafferentasyonu için bir model olarak kabul edilebilir. Bu memeli görsel sistemin ^1-4 boyunca görsel, çapraz modal ve gelişimsel plastisite farklı yönlerini incelemek için değerli bir araç sağlar.

Burada, biz yetişkinler kadar 20 gün eski farelerde doğrulandığında fare birinin kaldırılması veya her iki gözünde, bir zarif ve basit tekniği göstermektedir. Kısaca, bir dezenfekte eğri forseps göz arkasında optik sinir kilitlemek için kullanılır. Daha sonra, dairesel hareketler optik sinir daraltıyor ve göz küresinin kaldırmak için yapılır. Bu tekniğin avantajları hiçbir kanama minimal yüksek tekrarlanabilirlik, hızlı ameliyat sonrası iyileşme ve deneyci için çok düşük bir öğrenme eşiği vardır. Bu nedenle, hayvan büyük miktarda manipüle ve çaba en az bir miktarı ile işlenebilir. Tekniğinin doğası hafif hasarı uyarabilirİşlem sırasında retina. Mahajan diğ ile karşılaştırıldığında, bu yan etki bu yöntem daha az uygun hale getirir. (2011) ^5, amaç toplamak ve retina dokusu analiz ise. Göz küresi göz kapaklarını çıkarmadan prizden yerinden edilmesi gerekiyor çünkü: - Ayrıca, bizim yöntem sonrası göz açma yaş (13 ve sonrası P10 fare) ile sınırlıdır. Bu yazıda anlatılan in vivo enükleasyon tekniği geçtiğimiz günlerde başarıyla sıçanlarda küçük değişikliklerle uygulanan ve genel kemirgen afferent görsel yolu incelemek için yararlı görünür olmuştur.

Giriş

Bir göz çıkarma ve böylece geri dönüşümsüz duyusal reseptör yüzeyini (retina) tahrip, görsel yol boyunca duyusal girdi önemli bir kayıp getirir. Çocuk ve yetişkin görsel sistemdeki enüklüeasyon modeli farklı görme merkezlerinde ^1-4 geliştirilmesi, plastisite ve fonksiyonlarının anlaşılmasına değerli olduğu kanıtlanmıştır. Bu duyusal yoksunluk, moleküler, hücresel ve fizyolojik sonuçları kortikal devreler baş ve deneyim böyle kapsamlı bir değişikliğe tepki olarak kendi yapısını ve işlevini değiştirmek nasıl normal gelişim düzenlenir ve nasıl kurulur içgörü sağlayabilir.

Görsel yoksunluğa Farklı yöntemleri var ve bunlar bütün vizyonu ile ilgili araştırma kendi özel avantajlara sahip. Örnek koyu yetiştirme özellikle görsel olarak aktivitesi tahrik ortadan kaldırmak için, yine de, spontan retina aktivitesini etkilemez. Benzer şekilde, ameliyat dikiş iplikleri ya da göz kapağı yamalar desenli kaldır visual giriş spontan aktivitesini bozmadan ama onlar kapalı gözüyle dağılan ışık penetrasyonunu sağlar. Bu yöntemler, geri çevrilebilir ve gelişim ^6-8 sırasındaki kortikal devrelerin heykel binoküler girdi desenli vizyon ve düşük seviyeli korelasyon rolünün anlaşılmasında değerli olduğu gösterilmiştir. Bu optik siniri ^9,10 teşkil retina ganglion hücrelerinin girdi ilerici kaybı oluşturması nedeniyle glokom araştırmada, yetişkin hayvanlarda optik sinir ezilme modeli yaygın olarak kullanılmaktadır. Amaç geri dönüşümsüz bir kez spontan ve desenli hem vizyon kaldırmak için zaman göz ve böylece retina tamamen ve anında kaldırılır Öte yandan, enükleasyonu günü, yoksunluk uygun bir seçimdir. Ayrıca, aktivitesi haritalama çalışmaları ^11,12 gürültü oranı sinyal geliştirmek için güçlü bir göz içi aktivitesi dengesizliği neden olur. Th enükleasyonuna yanıt olarak yapısal ve işlevsel değişiklikler Karşılaştırılmasıose örneğin kapak sütür olarak daha az şiddetli yöntemlerle yoksunluğu sonra da plastisite hem homeostatik ve sinaptik türleri spontan retina aktivite rolüne yeni anlayışlar ortaya olabilir.

Enükleasyon doğrudan retina hedefleri trofik etkileri kaybı tetikler. Örneğin, BDNF düzeyleri anlamlı lateral genikulat nükleus (LGN'nin) ve yetişkin enüklee sıçanların ¹³ üstün colliculus downregülasyona edilir. Yapısal biçimlenme aracılık haberci moleküller olarak işlev Reaktif oksijen türleri, aynı zamanda yetişkin farenin görme sistemi ¹⁴ subkortikal yapılarda tespit edilmiştir. Buna ek olarak, fare çalışmalarındaki farklı subkortikal görsel hedef yapılar arasında ve mikroglial Astroglial etkinleştirme bir hafta ¹⁵ sonrası belirli bir zaman dilimi içinde enükleasyonu meydana gelir. Birlikte, glial, yapı ve moleküler düzeyde farklı subkortikal yanıtlarında optik deaferentasyon sonuçlanır. Bu subkortikal rağmenetkiler, mutlaka kortikal seviyesi ¹⁶ at etkilerini ima etmez. Sonraki yoksun görsel kortekse olmayan görsel girdilerin güçlendirilmesine, diğer duyusal alanlardaki değişiklikler de dahil olmak üzere kayda değer, çapraz-modal kortikal plastisite, hem monoküler sonra ortaya (ME) ^3,4,17,18 ve binoküler ^1,17 (BE) enüklüeasyon.

Yanı sıra görsel Nörobilimdeki katkıda gelen deafferentasyonu bir türü enükleasyonu merkezi sinir sistemi nöro-koruyucu ve ¹⁹ nörodejeneratif ^20-22 özellikleri arasında bir denge incelemek için kullanılabilir.

Enükleasyonu gerçekleştirmek için farklı prosedürler literatürde daha önce tarif edilmiştir. Sıçan ve farelerde in vivo ME için belirli yöntemler nedeniyle yörünge kas ve doku ^23-25 ​​gereksiz kısımlara daha az açıktır. Böyle Mahajan vd gibi diğer yayınlar. (2011) ⁵ kullanılarak ayrıntılı bir protokol sağlar genotip-fenotip ilişkisi, büyük olasılıkla otopsi incelemek için gözleri bir yüksek verimli koleksiyonu için künt diseksiyon. Amaçları için, yöntem uygun ve hızlı. Bir çok göz kendisinden daha (canlı hayvan) enükleasyonu aşağıdaki afferent görsel yolu seçmesi çalışma Ancak, bu yöntem, in vivo enükleasyonu için daha az uygundur. Böyle bir ortamda, post-enükleasyon sağkalım yüksek önem taşımaktadır. Aynı zamanda, in vivo hasar ve optik sinirin korunması ve yörünge dokusu içinde çok az uygundur. Burada, FAGUET et al birine, daha çok benzer alternatif bir yöntem mevcut enükleasyonu (2008) ^26, belirli avantajlı özellikler sunmaktadır:. Hızlı bir ameliyat sonrası iyileşme ile ilişkili olduğunu ve çok düşük bir öğrenme eşiği ile karakterize edilir araştırmacılar için. Göz morfolojisi veya görsel yolu araştırmada: Genel olarak, farklı yöntemler izleyen araştırma odak bağlı olarak tamamlayıcıdır.

Özetle ve_content ">, enükleasyon homeostatik ve çapraz-modal beyin plastisite, glial yanıt özellikleri ve akson istikrar araştırılması yönünde görüş araştırma uygulanabilir. Bu görsel yazıda, in vivo göz enükleasyon için uygulanabilir ve güvenilir bir yöntem olarak göstermek fare.

Protokol

Tüm deneyler KU Leuven etik araştırma komitesi tarafından onaylanmış ve Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi ile tam uyum içinde olduğunu gören 22 Eylül 2010 (2010/63 / AB) ve Belçikalı mevzuat (KB 29 Mayıs 2013). Her olası çaba hayvana acı en aza indirmek için ve hayvanların sayısını azaltmak için yapılmıştır.

1. Hayvan Tedavi ve anestezikler

1. Ketamin hidroklorür (75 mg / ml) ve tuzlu su içinde medetomidin hidroklorür (1 mg / kg) karışımı ile karından bir enjeksiyonla fare anestezisi.
2. Fare tamamen sedasyon sağlamak için bir forseps ile ayak kısma refleksleri kontrol edin.
3. Göz kapaklarını ve bir pamuk ucu kullanarak göz çevresini dezenfekte% 70 etanol uygulayın. Ayrıca sedasyon derecesini değerlendirmek için göz kapağı refleksi kontrol edin.

2. Göz Çıkarma

1. Emin olun hayvan bulunduğu bir düz ve kurupürüzsüz bir yüzey.
2. Kavisli, tırtıklı ucu (: 0.5 x 0.4 mm tercih ucu boyutu) ile bir forseps sterilize.
3. Yavaşça göz küresi prizden yerinden ve optik sinir ulaşılabilir kadar forseps ile canthus (gözün köşe) üzerine basın.
4. Gözün arkasında forseps yönlendirin. Basın ve tercihen eğrinin başında ve forseps değil çok ucuyla sıkıca optik sinir tutun. Bu prizden dünyayı kaldırmaya ve tam optik siniri kelepçe yardımcı olacaktır.
5. Fare düz yüzey üzerinde kalır el en az direnç ile yönünde forseps tutan dairesel hareketleri yapma. Fare, el hareketinin yönüne göre, yüzey boyunca katlanırlar.
6. Optik sinir iki daraltılmış kadar giderek artan bir hızla bu eylemi gerçekleştirmek (genellikle 7 ila 15 dairesel hareketler arasında, yaklaşık bir buçuk saniyede bir tam tur). Bu nedenle, müstakil küresi olduğukaldırıldı.

3. Post-operatif Bakım

1. (Nadir) kanama durumunda, yapışkan bir kolojen ve hemostatik bir madde ile yörünge doldurun.
2. Intraperitoneal tuzlu su içinde atipamezol hidroklorür, 1 mg / kg enjekte edilerek anestezi Ters.
3. Ağrıyı gidermek için intraperitonal, her 24 saat Meloksikamın, 1 mg / kg uygulayın.
4. Korneanın su kaybını önlemek için kalan göze göz merhemi sürün.
5. Hayvan bir ısıtma plakası üzerinde geri ve vücut sıcaklığının kontrol edilmesi için ayrı bir kafes içinde yalıtım malzemesi hayvanı kaydırma sağlar.
6. En az 2 gün boyunca her gün fare ağırlığını ölçün. Kilo kaybı acı işaret eder ve Hayvan tamamıyla iyileşti kadar, bu durumda, meloksikam tedaviye devam edebilir.

Sonuçlar

Şekil 1, tarif edilen protokol kullanılarak, gözün başarılı bir şekilde uzaklaştırıldığını göstermektedir ve kanama yokluğu veya yörünge dokusu veya göz soket (Şekil 1A, 1B) herhangi bir fiziksel hasar ile karakterize edilir. Bundan başka, göz çıkarıldı bütünüyle dokunulmamış dünya (Şekil 1C) göstergesi olan bir düz kornea, koroid ve optik diski vardır. Protokolümüz göz ve mekanik çevirme arkasında optik sinirin sıkılmasına içine aldığı, kaldırılan gözün optik sinir retina (Şekil 1D) tabanında kısıtlıdır. Çevredeki beyin alanına (Şekil 1E) herhangi bir zarar vermeden temiz bir kesim optik sinir açıklanan prosedür sonuçlarını Sahne.

Tek gözlü enüklüeasyon, eşleme aktivitesi (Şekil 2) ile kombinasyon halinde, bir keskin karşı Visua işlevsel ya da göz spesifik bir giriş bölgeleri ifade sağlarmaymunlar ²⁸ gibi yüksek mertebeden memelilerde fare ^12,27 hatta göz baskınlığı sütunların l korteks.

Fareler deney, biri kaldırılması (ME) ya da her iki gözün hedef görsel uyarı ve zif268 mRNA veya c-fos protein ekspresyon düzeylerinin saptanması ile birlikte (BE), görsel kortekse ^12,27 bölgesel nöronal aktivasyonunu ortaya çıkarmak için uygulanan . Görsel olarak uyarılmış kontrollere (Şekil 2A) aksine, BE farenin görsel giriş (Şekil 2B) eksikliği tamamlamak için bağlı görsel korteksteki temel aktivite gösterdi. Gibi, olmayan görsel korteksin (yani. Daha ön bölüm ve daha posterior bölümlerinde işitsel kortekste somatosensori korteks) ile görsel arasındaki sınırları ortaya çıkarılmıştır. Bir haftalık sağkalım süresi ile ME farelerin Sonuçları kontralateral görme korteksi göz spesifik giriş bölgeleri görüntülendi. İki tahrik monocularly bölge hipoaktif ve medi bulunduğuEl ve merkezi binoküler bölgesinde (Şekil 2C) lateral.

Göz soket, kaldırılır ve gözün optik sinirin sonrası enüklüeasyon devletin Şekil 1. Kalitatif değerlendirme. Kavisli bir forseps (A) herhangi bir kanama veya hasar göz soket (B) gözlenen ile gözün çıkarılmasından sonra. , Kornea ve koroid (C, D) normal bir görünüm ile yansıtılan çıkarılan göz tamamı ile faal olduğu. Optik sinir o göz (D) bırakır optik diskte daraltılır. Beynin ventral kısmının incelenmesi temiz bir kesim ve optik sinirin (yıldız) ve diğer yapıların (E) belirgin bir hasar ortaya koymaktadır. C, D Ölçek çubukları: 1 mm. E'deki ölçek çizgisi: 5 mm. A: ön; L: sol; P: Posterior; R: sağ.

: fo "jove_content"
Şekil enükleasyonla ortaya olarak fare görme korteksi 2. Fonksiyonel göz giriş özgü alt bölümleri. Gözleri ve korteks bağlamak siyah ve gri çizgiler retina afferentlerinden ve göz spesifik giriş bölgelerin üzerinde geçişini temsil eder. Sinirsel aktivite kontrolü (A) koronal bölümleri ¨orsellestirilen, (B) BE, ve zif268 (gri skala) in situ hibridizasyon (ISH) radyoaktif ME (C) farenin Bregma seviyesi etrafında -3.40 mm. Kontrol hayvanlarında (A), her iki yarıküre içindeki görsel korteks görsel uyarı aşağıdaki yüksek aktivitesini ekspres eder. Bir veya her iki göz (ler) kesilip zaman, sinyal aktivitesi belirgin bir azalmaya yol yoksun kortikal mukabil bölümlerine görülebilir. Monocularly (C) farenin yüksek AÇTI bir bölgeyi gösteriyor enükleekaldırılan göze karşı monoküler bölgelerinde bir azalma sinyali ile çevrili görsel korteksin binoküler bölgesinde vity. Ölçek çizgisi: 2 mm olmuştur. Van Brussel ark ¹² izni ile yayımlanmaktadır.

Tartışmalar

Bizim yöntemine göre başarılı bir enüklasyonu gerçekleştirmek için, dikkat edilmesi gereken en önemli adımlar şunlardır: 1) uygun büyüklükte bir kavisli ve tırtıklı ucu ile bir forseps kullanarak; 2) düzgün ve kuru bir yüzey üzerinde enükleasyonunu yapmak; ve 3) kademeli olarak en az sürtünme ile bir yönde dairesel hareketler hızlandırılması.

Etkili bir sonuç için bir eğri ve tırtıklı ucu ile karakterize uygun bir forseps kullanmak esastır (: fare: Tercih uç boyutu 0.5 x 0.4 mm; sıçan: 2.15 x 1.3 mm). Eğrilik küresi değiştirme sonrası optik sinir için kolay bir erişim sağlar ve dairesel hareketler gerçekleştirirken doğru el yerleştirilmesi için gereklidir. Optik sinir tutarken onlar gerekli tutuş olmadıklarıdan Pürüzsüz ipuçları tavsiye edilmez. Dairesel hareketleri sırasında düzgün optik siniri tutmak için başarısızlık oftalmik arter, gözün yoksul dekolmanı ve dolayısıyla kötü tekrarlanabilirlik yırtılması ile sonuçlanır.Bu nedenle, in vivo olarak bir kez uygulanması yöntemi maksimal hayvan bakımını temin etmek için işleme forseps optimizasyonu için ötenazi hayvanlar üzerinde ilk uygulama için bu tekniği tavsiye edilir. Başarılı göz enükleasyon yakın zamanda elle hayvan vücudu torna ve forseps sabit tutmak dışında aynı tekniği kullanarak bizim laboratuvar sıçan yapılmıştır.

Tekniğinin bir sınırlama muhtemelen retinaya zarar verebilecek olmasıdır. Bu yüzden, bu yöntem, histoloji ⁵ gerçekleştirmek retina toplanması için daha az uygundur. Ayrıca, bizim yöntem küresi kaldırma veya göz kapaklarının kesmeden prizden yerinden edilmesi gerekiyor çünkü göz açma yaş sonrası sınırlıdır.

Kemirgenler dahil olmak üzere farklı türlerde, Göz enükleasyon, rutin genellikle göz kapaklarının kaldırılmasını gerektirecektir alternatif yöntemleri kullanarak ve optik siniri ^18,23-25 ​​kesim yapılır. Bu yöntemiids daha invaziv olma eğilimindedir ve burada açıklanan tekniğe göre daha yüksek bir öğrenme eğrisi vardır. Kaldırma veya göz kapaklarının dikilmesi için gerek kalmadan, cerrahi sonrası iyileşme süresi daha yüksek hayvan refahı ve daha tekrarlanabilir sonuçlar elde simge edilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine hydrochloride (Anesketin)	Dechra Veterinary Products (Eurovet)	BE-V136516
Medetomidine hydrochloride (Domitor)	Orion Corporation (Janssen Animal Health)	BE-V151742
Atipamezol hydrochloride (Antisedan)	Orion Corporation (Elanco Animal Health)	BE-V153352
Meloxicam (Metacam)	Boehringer Ingelheim Vetmedica	N/A
Eye ointment (Fucithalmic)	Leo Pharma nv-sa	BE 144654
Moria MC31 Forceps - Serrated Curved	Fine Science Tools	11370-31	For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Narrow Pattern Forceps - Curved	Fine Science Tools	11003-13	For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Hemostatic cotton wool	Qualiphar	N/A	Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products)