Une méthode hautement reproductible et facile à Effectuer<em&gt; In Vivo</em&gt; Oculaire énucléation chez la souris après ouverture des yeux

Résumé

La suppression des yeux, aussi appelé l'énucléation, fournit une stratégie utile pour étudier les aspects de visuel, multi-modal, et la plasticité du développement le long du système visuel des mammifères, car il induit irréversible partielle (monoculaire) ou complète (binoculaire) la perte de vision. Nous décrivons ici une approche hautement reproductible et simple à effectuer dans l'énucléation in vivo.

Résumé

Énucléation ou l'ablation chirurgicale de l'œil peuvent généralement être considérées comme un modèle pour nerf désafférentation. Il constitue un outil précieux pour étudier les différents aspects de visuel, intermodale et la plasticité du développement le long du système visuel des mammifères ^1-4.

Ici, nous démontrons une technique élégante et simple pour l'élimination d'un ou des deux yeux chez la souris, qui est validé chez la souris de 20 jours jusqu'à l'âge aux adultes. En bref, un désinfectés pince courbe est utilisée pour serrer le nerf optique derrière l'œil. Par la suite, les mouvements circulaires sont réalisés à la constriction du nerf optique et enlever le globe oculaire. Les avantages de cette technique sont une reproductibilité élevée, peu ou pas de saignement, la récupération post-opératoire rapide et un seuil très bas de l'apprentissage pour l'expérimentateur. Par conséquent, un grand nombre d'animaux peut être manipulée et traitée avec une quantité minimum d'effort. La nature de la technique peut induire des dommages légers àla rétine au cours de la procédure. Cet effet secondaire rend cette méthode moins convenable par rapport à Mahajan et al. (2011) ⁵ si le but est de recueillir et d'analyser le tissu rétinien. De plus, notre méthode est limitée à l'ouverture post-oculaires âges (souris: P10 - 13) à compter depuis le globe oculaire doit être déplacé de la prise sans enlever les paupières. Le vivo technique d'énucléation en décrit dans ce manuscrit a été récemment appliquée avec succès avec des modifications mineures chez le rat et semble utile d'étudier la voie visuelle afférente de rongeurs en général.

Introduction

Retrait d'un œil et ainsi autodestruction de manière irréversible la surface des récepteurs sensoriels (rétine), impose une perte considérable de l'entrée sensorielle le long de la voie visuelle. Le modèle d'énucléation dans le système visuel juvénile et adulte s'est avéré être utile pour comprendre le développement, la plasticité et la fonction des divers centres visuels ^4.1. Les conséquences moléculaires, cellulaires et physiologiques de cette privation sensorielle peuvent fournir des indications sur la façon dont le développement normal est régulée et comment établies circuits corticaux faire face et de changer leur structure et la fonction en réponse à une telle modification vaste expérience.

Différentes méthodes de privation visuelle exister et ils ont tous leurs avantages spécifiques dans la recherche liée à la vision. Par exemple élevage sombre spécifiquement élimine visuellement entraînée activité mais il n'affecte pas l'activité de la rétine spontanée. Visua même, sutures couvercle ou pansements oculaires supprimer modelésl entrée sans perturber l'activité spontanée mais ils permettent la pénétration de la lumière dispersée à travers les yeux fermés. Ces méthodes sont réversibles et ont été montré pour être utile dans la compréhension du rôle des motifs vision et à faible niveau de corrélation d'entrées jumelles dans la sculpture circuits corticaux au cours du développement ^6-8. Dans la recherche de glaucome, le modèle de l'écrasement du nerf optique chez les animaux adultes a été largement utilisée car elle établit une perte progressive des apports des cellules ganglionnaires de la rétine qui constituent le nerf optique ^9,10. D'autre part, l'énucléation, où l'œil et donc la rétine est complètement et instantanément supprimée, est le choix approprié de privation lorsque l'objectif est de supprimer de façon irréversible la vision à la fois spontanée et motifs à la fois. Il induit également une forte activité déséquilibre intra-oculaire qui peut améliorer le rapport signal sur bruit dans des études de cartographie d'activité ^11,12. Comparant les changements fonctionnels et structurels en réponse à l'énucléation avec eose après privation par des méthodes drastiques moins tels que couvercle suture par exemple, pourrait également exposer de nouvelles perspectives sur le rôle de l'activité rétinienne spontanée dans les deux types d'homéostasie et de la plasticité synaptique.

Énucléation déclenche une perte d'influences trophiques dans les objectifs de la rétine directs. Par exemple, les niveaux de BDNF sont fortement régulés à la baisse dans le noyau latéral géniculé (LGN) et colliculus supérieur de rats adultes énucléés ^13. Espèces réactives de l'oxygène, qui fonctionnent comme des molécules messagères de médiation remodelage structurel, ont également été détectés dans les structures sous-corticales du rat adulte du système visuel ^14. En outre, la microglie et l'activation des astrocytes dans les différentes structures sous-corticales visuelles cibles chez la souris se produisent dans un laps de temps après l'énucléation spécifique d'une semaine ^15. Ensemble, les résultats de la désafférentation optiques dans les différentes réponses corticales à l'gliale, niveau structurel et moléculaire. En dépit de ces sous-corticaleeffets, il ne soulève pas nécessairement des effets au niveau cortical ^16. Il convient de noter, la plasticité corticale intermodal, y compris les modifications dans d'autres domaines sensoriels à côté du renforcement des intrants non visuelles vers le cortex visuel privé surviennent après deux monoculaire (ME) ^3,4,17,18 et binoculaire (BE) ^1,17 énucléation.

En plus de contribuer à la neuroscience visuelle, énucléation comme un type de désafférentation peut être utilisé pour étudier l'équilibre entre les neuroprotecteurs ¹⁹ et ^{20 à 22} propriétés de neurodégénératives du système nerveux central.

Différentes procédures pour effectuer l'énucléation sont déjà décrites dans la littérature. Certaines méthodes pour in vivo ME rats et les souris sont moins simple en raison de sectionnement inutile de muscles orbitaux et les tissus ^23-25. Autres publications telles que Mahajan et al (2011) ^5. Fournissent un protocole détaillé à l'aide dissection pour une collection à haut débit de yeux pour étudier les corrélations génotype-phénotype, probablement post-mortem. Pour leur but, la méthode est pratique et rapide. Cependant, ce procédé est moins approprié pour énucléation in vivo lorsque l'on opte pour étudier la voie visuelle afférente suivant énucléation (dans les animaux vivants) plutôt que de l'oeil lui-même. Dans un tel contexte, la survie post-énucléation est d'une grande importance. En outre, un minimum de dommages vivo et la préservation du nerf optique et tissus de l'orbite est favorable. Ici, nous présentons une méthode alternative d'énucléation, plus semblable à celle décrite par Faguet et al (2008) ^26, qui offre certaines propriétés avantageuses:. Qu'il est associé à une récupération post-opératoire rapide et se caractérise par un seuil d'apprentissage très faible pour les chercheurs. En général, différentes méthodes sont complémentaires en fonction de l'objet de recherches ultérieures: la morphologie de l'œil ou de la recherche de la voie visuelle.

ve_content "> En somme, l'énucléation peut être appliquée à partir de la recherche de vision vers enquêtes de plasticité homéostatique et inter-modal cerveau, des propriétés de réponse gliales, et la stabilité de l'axone. Dans cet article, visualisé, nous démontrons une méthode réalisable et fiable pour in vivo l'énucléation de l'œil dans la souris.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvés par le comité d'éthique de la recherche de la KU Leuven et sont en stricte conformité avec la directive du Conseil Communautés européennes du 22 Septembre 2010 (2010/63 / UE) et à la législation belge (KB du 29 mai 2013). Tous les efforts possibles ont été faits pour minimiser la souffrance des animaux et de réduire le nombre d'animaux.

1. traitement des animaux et anesthésiques

1. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale d'un mélange de chlorhydrate de kétamine (75 mg / ml) et du chlorhydrate de médétomidine (1 mg / kg) dans une solution saline.
2. Vérifiez les réflexes en pinçant les doigts avec une pince à assurer la souris est complètement sous sédation.
3. Appliquer éthanol à 70% pour désinfecter les paupières et la région autour des yeux en utilisant un coton-tige. Vérifiez le réflexe de la paupière pour évaluer en outre le degré de sédation.

2 Retrait de l'oeil

1. Assurez-vous que l'animal se trouve sur un plat, sec etsurface lisse.
2. Stériliser une pince avec une courbe, pointe dentelée (taille de la pointe préféré: 0,5 x 0,4 mm).
3. Appuyez doucement sur la commissure (coin de l'œil) avec la pince jusqu'à ce que le globe oculaire est déplacé de la prise et le nerf optique est accessible.
4. Guide de la pince derrière l'œil. Appuyez et maintenez le nerf optique fermement, de préférence avec le début de la courbe et non la pointe de la pince. Cela aidera à soulever le globe de la prise et de serrer le nerf optique complet.
5. Effectuer des mouvements circulaires avec la main qui tient la pince dans la direction de la moindre résistance alors que la souris reste sur la surface plane. La souris se balancer le long de la surface en fonction de la direction du mouvement de la main.
6. Effectuer cette action lorsque la vitesse augmente progressivement jusqu'à ce que le nerf optique est resserré en deux (généralement entre 7 à 15 mouvements circulaires, d'environ un demi-tour à un tour par seconde). Par conséquent, le globe oculaire est détachésupprimée.

Soins 3 post-opératoire

1. En cas de saignement (rare), remplir l'orbite avec une coaguler visqueux et agent hémostatique.
2. Inverser l'anesthésie par injection de 1 mg / kg de chlorhydrate atipamezol dans du sérum physiologique par voie intrapéritonéale.
3. Administrer 1 mg / kg par voie intrapéritonéale de Meloxicam toutes les 24 heures pour soulager la douleur.
4. Appliquer une pommade ophtalmique à l'oeil qui reste pour éviter la déshydratation de la cornée.
5. Soit l'animal récupérer sur une plaque chauffante ou d'envelopper l'animal dans un matériau isolant dans une cage séparée de contrôler la température du corps.
6. Mesurer le poids de la souris chaque jour pendant au moins 2 jours. La perte de poids peut indiquer la souffrance et dans ce cas, poursuivre le traitement jusqu'à ce que Meloxicam l'animal est complètement rétabli.

Résultats

La figure 1 illustre la suppression réussie de l'oeil en utilisant le protocole décrit et se caractérise par l'absence de saignement ou de tout dommage physique apparent pour le tissu orbitaire ou orbite de l'oeil (figures 1A, 1B). En outre, l'énucléation a une cornée lisse, la choroïde et disque optique, indicatif pour un monde complètement intacte (figure 1C). Depuis notre protocole comprend le serrage du nerf optique derrière l'oeil et la rotation mécanique, le nerf optique de l'oeil est retiré rétrécie à la base de la rétine (figure 1D). Effectuer les résultats de la procédure décrites dans un nerf optique épuré sans aucun dommage pour la zone entourant le cerveau (figure 1E).

Énucléation monoculaire, en combinaison avec la cartographie de l'activité (figure 2), permet de délimiter nettement les régions fonctionnelles ou oculaire spécifique entrée dans la visua controlatérall cortex de la souris ^12,27 ou colonnes de dominance oculaire, même chez les mammifères d'ordre supérieur comme les singes ^28.

Dans les expériences avec des souris, l'élimination d'un (ME) ou les deux yeux (BE) en combinaison avec une stimulation visuelle cible et la détection d'ARNm ou de Zif268 pour c-Fos niveaux d'expression de protéine a été appliqué à découvrir activation neuronale régionale dans le cortex visuel ^12,27 . Contrairement aux témoins stimulés visuellement (Figure 2A), les souris ont montré une activité basale BE dans le cortex visuel du fait de l'absence de compléter entrée visuelle (figure 2B). En tant que tel, les frontières entre visuel avec cortex non visuel (c.. Cortex somatosensoriel à plusieurs sections antérieure et le cortex auditif dans plusieurs sections postérieures) ont été découverts. Résultats de ME souris avec un temps de survie d'une semaine de visualiser les régions d'entrée spécifiques de l'oeil dans le cortex visuel controlatéral. Les deux régions monoculaire entraînés étaient hypoactif et situés medial et latérale de la zone centrale binoculaire (figure 2C).

Figure 1: L'évaluation qualitative de l'état de l'orbite de l'œil, l'œil enlevé et le nerf optique post-énucléation. Après l'élimination de l'œil avec une pince courbe (A) pas de saignement ou les dommages sont observés dans l'orbite (B). L'œil est enlevé complètement intacte comme en témoigne une apparence normale de la cornée et de la choroïde (C, D). Le nerf optique est resserré au niveau du disque optique où elle laisse l'oeil (D). L'examen de la partie ventrale du cerveau révèle un nerf coupé propre optique (astérisque) et aucun dommage apparent à d'autres structures (E). Les barres d'échelle en C, D: 1 mm. La barre d'échelle dans E: 5 mm. A: antérieur; L: gauche; P: postérieur; R: droite.

Figure 2 fonctionnels des subdivisions spécifiques œil entrée dans le cortex visuel de la souris comme l'a révélé par l'énucléation. Les lignes noires et grises qui relient les yeux et le cortex représentent le croisement des fibres afférentes de la rétine et des régions spécifiques d'entrée de l'oeil. L'activité neuronale est visualisée sur des coupes coronales de contrôle (A), BE (B), et ME (C) chez la souris par radioactive hybridation in situ (ISH) dans des zif268 (échelle de gris) autour du niveau Bregma -3,40 mm. Chez les animaux témoins (A), le cortex visuel dans les deux hémisphères exprime une activité élevée suite à une stimulation visuelle. Quand un ou les deux yeux (s) sont disparues du pays, une nette diminution du signal d'activité est visible dans les régions corticales privées correspondant. Monoculaire énucléé souris (C) montrent une zone de haute activité dans la zone binoculaire du cortex visuel entouré par un signal de diminution dans les zones monoculaires à l'oeil controlatéral enlevé. Barre d'échelle: 2 mm. Reproduit avec la permission de Van Brussel et al ^12.

Discussion

Pour effectuer une énucléation réussie selon notre méthode, les étapes les plus importantes à prendre en compte sont les suivants: 1) à l'aide d'une pince avec une pointe recourbée et dentelée de la taille appropriée; 2) effectuer la énucléation sur une surface lisse et sec; et 3) en accélérant progressivement les mouvements circulaires de la direction avec le moins de frottement.

Pour un résultat efficace, il est essentiel d'utiliser une pince appropriées caractérisées par une pointe recourbée et dentelée (taille de la pointe préféré: la souris: 0,5 x 0,4 mm; rat: 2.15 x 1.3 mm). La courbure permet un accès facile vers le nerf optique après déplacement globe oculaire et est nécessaire pour le placement correct des mains lors de l'exécution des mouvements circulaires. Pointes lisses ne sont pas recommandés car ils n'ont pas la poignée nécessaire lors de la tenue du nerf optique. Défaut de tenir le nerf optique correctement pendant les mouvements circulaires en résulte une rupture de l'artère ophtalmique, pauvres détachement de l'œil et donc une mauvaise reproductibilité.Par conséquent, il est conseillé de commencer par la pratique de cette technique sur des animaux euthanasiés pour l'optimisation de la pince de manutention afin de garantir maximale bien-être animal, une fois l'application de la méthode in vivo. Énucléation de l'oeil a réussi récemment également été réalisée chez le rat dans notre laboratoire en utilisant la même technique, sauf pour faire tourner le corps de l'animal et en maintenant manuellement la pince stationnaire.

Une limitation de la technique est qu'elle pourrait éventuellement endommager la rétine. Par conséquent, ce procédé est moins approprié pour la collecte de rétines pour effectuer ⁵ l'histologie. De plus, notre méthode est limitée à poster âges d'ouverture des yeux depuis le globe oculaire doit être déplacé de la prise sans enlever ou couper les paupières.

énucléation des yeux chez les différentes espèces, y compris les rongeurs, est systématiquement effectuée en utilisant des méthodes alternatives, qui impliquent souvent l'ablation des paupières et en coupant le nerf optique ^18,23-25. Ces méthods ont tendance à être plus envahissantes et ont une courbe d'apprentissage plus élevé que la technique décrite ici. Sans la nécessité d'enlever ou suturer les paupières, le temps de récupération post-opératoire est réduite, ce qui entraîne plus de bien-être animal et des résultats plus reproductibles.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine hydrochloride (Anesketin)	Dechra Veterinary Products (Eurovet)	BE-V136516
Medetomidine hydrochloride (Domitor)	Orion Corporation (Janssen Animal Health)	BE-V151742
Atipamezol hydrochloride (Antisedan)	Orion Corporation (Elanco Animal Health)	BE-V153352
Meloxicam (Metacam)	Boehringer Ingelheim Vetmedica	N/A
Eye ointment (Fucithalmic)	Leo Pharma nv-sa	BE 144654
Moria MC31 Forceps - Serrated Curved	Fine Science Tools	11370-31	For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Narrow Pattern Forceps - Curved	Fine Science Tools	11003-13	For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Hemostatic cotton wool	Qualiphar	N/A	Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products)