Um método altamente reprodutível e fácil de executar<em&gt; In Vivo</em&gt; Ocular Enucleação no Rato após a abertura dos olhos

Resumo

A remoção de olhos, também chamada de enucleação, fornece uma estratégia útil para estudar aspectos do visual, cross-modal, e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos, uma vez que induz irreversível parcial (monocular) ou completo (binocular) a perda da visão. Aqui nós descrevemos um método altamente reprodutível e fácil de realizar in vivo enucleação.

Resumo

Enucleação ou a remoção cirúrgica de um olho pode ser geralmente considerado como um modelo para deaferentação nervo. Ele fornece uma ferramenta valiosa para estudar os diferentes aspectos do visual, cross-modal e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos ^1-4.

Aqui, demonstramos uma técnica elegante e simples para a remoção de um ou ambos os olhos no rato, que é validado em ratinhos de 20 dias de idade até adultos. Resumidamente, um desinfectadas pinças curvas é utilizado para fixar o nervo óptico atrás do olho. Subsequentemente, os movimentos circulares são realizadas para comprimir o nervo óptico e retirar o globo ocular. As vantagens desta técnica são de alta reprodutibilidade, o mínimo de sangramento, recuperação pós-operatória rápida e um limiar de aprendizagem muito baixo para o experimentador. Assim, uma grande quantidade de animais pode ser manipulado e processado com uma quantidade mínima de esforço. A natureza da técnica pode induzir danos ligeiros ada retina durante o procedimento. Este efeito secundário torna este método menos adequado em comparação com Mahajan et al. (2011) ^5, se o objetivo é coletar e analisar tecido da retina. Além disso, o nosso método é limitado a pós-olho abrindo as idades (rato: P10 - 13 em diante) desde o globo ocular precisa ser deslocado do soquete sem a remoção das pálpebras. A técnica in vivo enucleação descrito neste manuscrito foi recentemente aplicado com êxito com modificações menores em ratos e parece útil para o estudo da via visual aferente de roedores em geral.

Introdução

Remoção de um olho e, assim, de forma irreversível destruindo a superfície receptor sensorial (retina), impõe uma perda considerável de informações sensoriais ao longo da via visual. O modelo de enucleação no sistema visual juvenil e adulta tem provado ser valiosos para compreender o desenvolvimento, plasticidade e função de diferentes centros visuais ^1-4. As conseqüências moleculares, celulares e fisiológicos desta privação sensorial pode fornecer insights sobre como o desenvolvimento normal é regulada e como estabelecido circuitos corticais enfrentar e mudar sua estrutura e função em resposta a uma extensa tal alteração na experiência.

Existem diferentes métodos de privação visual e todos eles têm suas vantagens específicas em pesquisas relacionadas à visão. Por exemplo criação escuro especificamente elimina impulsionado visualmente atividade, no entanto, não afeta a atividade da retina espontâneo. Da mesma forma, suturas tampa ou tapa-olhos remover modelada vil entrada sem perturbar a atividade espontânea, mas eles permitem a penetração da luz dispersa através dos olhos fechados. Esses métodos são reversíveis e têm mostrado ser úteis para a compreensão do papel de visão e de baixo nível de correlação modelado de entradas binocular em esculpir circuitos corticais durante o desenvolvimento ^6-8. Na pesquisa de glaucoma, o modelo de esmagamento do nervo óptico em animais adultos, tem sido amplamente utilizado porque estabelece uma perda progressiva das entradas de células do gânglio retinal que formam o nervo óptico ^9,10. Por outro lado, a enucleação, em que o olho e a retina é completamente removido e, instantaneamente, é a escolha apropriada de privação quando o objectivo é o de remover irreversivelmente visão tanto espontânea e modelado de uma só vez. Ela induz também um desequilíbrio actividade intra-ocular robusta que pode melhorar a relação sinal-ruído em estudos de mapeamento de actividade ^11,12. Comparando as mudanças funcionais e estruturais em resposta a enucleação com those após a privação por métodos menos drásticas, como sutura tampa por exemplo, também pode expor novos insights sobre o papel da atividade da retina espontâneo em ambos os tipos de homeostase e de plasticidade sináptica.

Enucleação desencadeia uma perda de influências tróficas em alvos diretos da retina. Por exemplo, os níveis de BDNF são significativamente downregulated no núcleo lateral geniculado (LGN) e colículo superior de ratos adultos enucleadas ^13. Espécies reativas de oxigênio, que funcionam como moléculas mensageiras para mediar remodelação estrutural, também foram detectados em estruturas subcorticais do rato adulto sistema visual ^14. Além disso, microglia e ativação astrocitária através de diferentes estruturas alvo visuais subcorticais no rato ocorrer em um período de tempo pós-enucleação específico de uma semana ^15. Juntos, os resultados desaferentação ópticas em diferentes respostas subcorticais no glial, nível estrutural e molecular. Apesar destes subcorticalefeitos, não implica necessariamente efeitos no nível cortical ^16. Notável, plasticidade cortical inter-modal, incluindo modificações em outras áreas sensoriais ao lado do fortalecimento de insumos não-visuais para o córtex visual privados ocorrer após tanto monocular (ME) ^3,4,17,18 e binocular (BE) ^1,17 enucleação.

Para além de contribuir para neuroscience visual, enucleação como um tipo de desaferentação pode ser utilizado para estudar o equilíbrio entre a ¹⁹ neuroprotectores e neurodegenerativos ^20-22 propriedades do sistema nervoso central.

Diferentes procedimentos para realizar a enucleação já descritos na literatura. Certas metodologias para in vivo ME em ratos e camundongos são menos simples devido ao corte desnecessário de músculos orbitais e tecido ^23-25. Outras publicações, tais como Mahajan et al (2011) ^5. Fornecer um protocolo detalhado usando dissecção romba para uma coleção de alto rendimento de olhos para estudar as correlações genótipo-fenótipo, provavelmente post-mortem. Para a sua finalidade, o método é rápido e conveniente. No entanto, este método é menos adequado para visualização in vivo, quando se opta enucleação para estudar o caminho visual aferentes a seguir a enucleação (em animais vivos) em vez do próprio olho. Em tal cenário, a sobrevivência pós-enucleação é de grande importância. Além disso, um mínimo de danos vivo e preservação do nervo óptico e do tecido orbital é favorável. Aqui, nós apresentamos um método alternativo enucleação, mais semelhante ao descrito por Faguet et al (2008) ^26, que oferece certas propriedades vantajosas:. Está associado com uma recuperação pós-operatória rápida e é caracterizado por um limite muito baixo de aprendizagem para os pesquisadores. Em geral, os métodos são complementares diferentes dependendo do foco de pesquisas subsequentes: morfologia do olho ou de investigação via visual.

ve_content "> Em suma, a enucleação pode ser aplicado a partir de pesquisas de visão para investigações de plasticidade homeostática e cross-modal cérebro, propriedades de resposta da glia, e estabilidade axônio. Neste artigo visualizados, demonstramos um método viável e confiável para in vivo enucleação do olho em o mouse.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da KU Leuven e estavam em estrita conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias de 22 de Setembro de 2010 (2010/63 / UE) e com a legislação belga (KB de 29 de Maio de 2013). Cada possível esforço foi feito para minimizar o sofrimento dos animais e para reduzir o número de animais.

1 Tratamento e Anestésicos Animais

1. Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (75 mg / ml) e cloridrato de medetomidina (1 mg / kg) em solução salina.
2. Confira os reflexos, beliscar os dedos dos pés com uma pinça para garantir o mouse é completamente sedado.
3. Aplicar álcool 70% para desinfecção das pálpebras e da região em torno do olho usando uma ponta de algodão. Confira o reflexo da pálpebra para avaliar adicionalmente o grau de sedação.

2 Retirar o Eye

1. Certifique-se de que o animal reside em um plano, seco esuperfície lisa.
2. Esterilizar uma pinça com uma curva, ponta serrilhada (tamanho da ponta preferido: 0,5 x 0,4 mm).
3. Pressione suavemente para o canto (canto do olho) com a pinça até que o globo ocular é deslocado do soquete e do nervo óptico é alcançável.
4. Guia da pinça por trás do olho. Pressione e segure o nervo óptico firmemente, de preferência com o início da curva e não na ponta da pinça. Isso vai ajudar a levantar o globo da tomada e apertar o nervo óptico completo.
5. Faça movimentos circulares com a mão que segurava a pinça na direção com o mínimo de resistência, enquanto o mouse permanece sobre a superfície plana. O rato vai oscilar ao longo da superfície de acordo com a direcção do movimento da mão.
6. Executar esta ação com um aumento gradual de velocidade até o nervo óptico é restrito em dois (geralmente entre 7 a 15 movimentos circulares, aproximadamente meia a uma volta completa por segundo). Por isso, o globo ocular é destacadaremovido.

Cuidado 3 Pós-operatório

1. Em caso de sangramento (raro), preencher a órbita com um coagular viscoso e agente hemostático.
2. Inverta a anestesia por injeção de 1 mg / kg de cloridrato de atipamezol em soro fisiológico por via intraperitoneal.
3. Administrar 1 mg / kg de meloxicam por via intraperitoneal a cada 24 horas, para aliviar a dor.
4. Aplicar pomada para o olho restante para evitar a desidratação da córnea.
5. Deixar o animal recuperar em uma placa de aquecimento ou envolva o animal em material isolante em uma gaiola separado para controlar a temperatura do corpo.
6. Medir o peso do rato a cada dia durante pelo menos 2 dias. A perda de peso pode indicar sofrimento e, neste caso, continuar o tratamento com meloxicam, até que o animal é completamente recuperado.

Resultados

A Figura 1 ilustra a remoção bem sucedida do olho, utilizando o protocolo descrito e é caracterizado pela ausência de sangramento ou danos físicos aparentes para o tecido orbital ou cavidade ocular (Figuras 1A, 1B). Além disso, o olho tem uma córnea removido suave, coróide e disco óptico, indicativo de um globo completamente intacto (Figura 1C). Uma vez que o nosso protocolo engloba o aperto do nervo óptico por trás do olho e viragem mecânica, o nervo óptico do olho é removida constrito na base da retina (Figura 1E). Realizando os resultados do procedimento descrito em um nervo óptico clean-cut, sem qualquer dano para a área cerebral circundante (Figura 1E).

Enucleação monocular, em combinação com o mapeamento de actividade (Figura 2), permite delinear acentuadamente as regiões funcionais de entrada ou no olho específicos vi contralaterall córtex do rato ^12,27 ou colunas de dominância ocular mesmo em mamíferos de ordem superior, como macacos ^28.

Em experiências com ratos, a remoção de um (ME) ou ambos os olhos (SER) combinado com estimulação visual alvejado e a detecção de ARNm de Zif268 ou c-Fos níveis de expressão da proteína foi aplicado para detectar a activação neuronal regional, no córtex visual ^12,27 . Em contraste com controles estimulados visualmente (Figura 2A), seja camundongos mostraram atividade basal no córtex visual devido à completa falta de input visual (Figura 2B). Como tal, as fronteiras entre o córtex visual com não-visual (ie. Córtex somatossensorial em mais seções anterior e córtex auditivo em mais seções posteriores) foram descobertos. Os resultados do ME camundongos com um tempo de sobrevivência de uma semana visualizados nas regiões de entrada específicos olho no córtex visual contralateral. As duas regiões foram acionados monocularmente hipoativo e localizado mediai e lateral da zona binocular central (Figura 2C).

Figura 1 avaliação qualitativa do estado pós-enucleação da cavidade ocular, o olho removido eo nervo óptico. Após a remoção do olho com uma pinça curva (A) sem sangramento ou dano é observado na cavidade ocular (B). O olho removido é completamente intacto como refletido por uma aparência normal da córnea e coróide (C, D). O nervo óptico, é constrangido no disco óptico onde sai o olho (D). A análise da parte ventral do cérebro revela um nervo óptico de corte limpo (asterisco) e nenhum dano aparente para outras estruturas (E). Barras de escala em C, D: 1 mm. Barra de escala em E: 5 milímetros. A: anterior; L: esquerda; P: posterior; R: direita.

Figura 2 subdivisões específicas olho-entrada funcionais no córtex visual do rato como reveladas por enucleação. Linhas pretas e cinzas que conectam os olhos eo córtex representam a travessia dos aferentes da retina e as regiões de entrada específicos do olho. A atividade neural é visualizada em cortes coronais de controle (A), BE (B) e ME (C) ratos por radioativo hibridização in situ (ISH) para Zif268 (escala de cinza) em torno do nível Bregma -3,40 mm. Em animais de controlo (A), o córtex visual em ambos os hemisférios expressa elevada actividade no seguimento da estimulação visual. Quando um ou ambos os olhos (s) são extirpados, uma clara diminuição na actividade do sinal é visível nas correspondentes regiões corticais privadas. Monocularmente enucleados (C) ratos mostram uma zona de alta actividade na zona binocular do córtex visual rodeado por uma diminuição de sinal em zonas monoculares contralateral ao olho removido. Barra de escala: 2 mm. Reproduzido com a permissão de Van Brussel et al ^12.

Discussão

Para realizar a enucleação de sucesso de acordo com o nosso método, os passos mais críticos a serem considerados são: 1) usando uma pinça com ponta curva e serrilhada de tamanho adequado; 2) realizar a enucleação em uma superfície lisa e seca; e 3) aumentando gradualmente a velocidade até os movimentos circulares no sentido com o mínimo de atrito.

Para um resultado eficaz, é imprescindível a utilização de uma pinça adequada, caracterizada por uma ponta curvada e dentada (tamanho do bico preferido: mouse: 0,5 x 0,4 mm; rato: 2,15 x 1,3 mm). A curvatura permite um fácil acesso ao nervo óptico após o deslocamento do globo ocular e é necessário para a colocação correta das mãos ao executar os movimentos circulares. Dicas lisos não são recomendadas, uma vez que não têm a aderência necessária ao segurar o nervo óptico. A falha em realizar o nervo óptico adequadamente durante os movimentos circulares resulta na ruptura da artéria oftálmica, pobre descolamento do olho e, por conseguinte, uma fraca reprodutibilidade.Por isso recomenda-se a primeira prática desta técnica em animais sacrificados para a otimização da pinça de manipulação para garantir bem-estar animal máximo uma vez a aplicação do método in vivo. Enucleação ocular sucesso tem sido, recentemente, também realizado no rato no nosso laboratório utilizando a mesma técnica, excepto para virar o corpo do animal e manter manualmente a pinça estacionário.

Uma limitação da técnica é que ela poderia danificar a retina. Portanto, este método é menos adequado para a recolha de retinas de realizar histologia ^5. Além disso, o nosso método é limitada para deixar a abertura do olho idades desde o olho tem de ser deslocado a partir da tomada, sem remoção ou corte das pálpebras.

Enucleação dos olhos de diferentes espécies, incluindo roedores, é rotineiramente realizado utilizando métodos alternativos, que frequentemente implicam a remoção das pálpebras e o corte do nervo óptico ^18,23-25. Estes metods tendem a ser mais invasivos e têm uma curva de aprendizagem mais elevada do que a técnica aqui descrita. Sem a necessidade de remover ou suturando as pálpebras, o tempo de recuperação pós-operatório é minimizado, resultando em maior bem-estar dos animais e os resultados mais reprodutíveis.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine hydrochloride (Anesketin)	Dechra Veterinary Products (Eurovet)	BE-V136516
Medetomidine hydrochloride (Domitor)	Orion Corporation (Janssen Animal Health)	BE-V151742
Atipamezol hydrochloride (Antisedan)	Orion Corporation (Elanco Animal Health)	BE-V153352
Antibiotics (cefazolin, Kefzol)	Eurocept Pharmaceuticals	BE 106267
Eye ointment (Fucithalmic)	Leo Pharma nv-sa	BE 144654
Moria MC31 Forceps - Serrated Curved	Fine Science Tools	11370-31	For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Narrow Pattern Forceps - curved	Fine Science Tools	11003-13	For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Hemostatic cotton wool	Qualiphar	N/A	Other hemostatic agents are equally suitable (e.g., Viscostat, #649, Ultradent Products)