Ein hoch reproduzierbare und einfache Methode, um Führen<em&gt; In Vivo</em&gt; Ocular Enukleation in der Maus nach Augenöffnung

Zusammenfassung

Die Entfernung der Augen, auch als Enukleation, bietet eine nützliche Strategie, um Aspekte der visuellen, Cross-Modal und Entwicklungs Plastizität entlang der Säugetier-visuelle System zu studieren, da es teilweise irreversible induziert (monokulare) oder komplett (Fernglas) Verlust der Sehkraft. Hier beschreiben wir eine hoch reproduzierbare und unkomplizierte Ansatz zur in vivo Enukleation durchzuführen.

Zusammenfassung

Enukleation oder die chirurgische Entfernung eines Auges kann in der Regel als Modell für Nerven Deafferentation berücksichtigt werden. Es stellt ein wertvolles Instrument, um die verschiedenen Aspekte der visuellen, Cross-modale Plastizität und Entwicklungs entlang der Säugetier-visuelle System ^1-4 zu studieren.

Hier zeigen wir, eine elegante und einfache Methode zur Entfernung von einem oder beiden Augen der Maus, die in den Mäusen 20 Tage alt bis zu Erwachsenen validiert wird. Kurz gesagt wurde eine desinfizierte gebogenen Pinzette wird verwendet, um den Sehnerv hinter dem Auge zu klemmen. Anschließend werden kreisende Bewegungen durchgeführt, um den Sehnerv zu verengen, und entfernen Sie den Augapfel. Die Vorteile dieser Technik sind eine hohe Reproduzierbarkeit, minimale bis keine Blutung, rasche postoperative Erholung und eine sehr geringe Lernschwelle für den Experimentator. Daher kann eine große Menge von Tieren manipuliert und mit minimalem Aufwand verarbeitet werden. Die Art der Technik kann leichte Schäden zu verandie Netzhaut während des Verfahrens. Diese Nebenwirkung ist diese Methode weniger geeignet, da im Vergleich zu Mahajan et al. (2011) ^5, wenn das Ziel ist, zu sammeln und zu analysieren, Netzhautgewebe. Auch ist unsere Methode zur postAugenÖffnung Altersgruppen (Maus: P10 - 13 an) beschränkt, da der Augapfel muss aus der Steckdose, ohne die Augenlider zu entfernen verschoben werden. Die in diesem Manuskript beschrieben in vivo Enukleation Technik wurde kürzlich erfolgreich mit geringfügigen Änderungen bei Ratten angewendet und scheint sinnvoll, die afferenten Sehbahn von Nagetieren im allgemeinen zu studieren.

Einleitung

Entfernen Sie ein Auge und damit irreversibel zerstörende die sensorische Empfangsfläche (Retina), erlegt einen erheblichen Verlust der sensorischen Eingangs entlang der Sehbahn. Die Enukleation Modell in der jugendlichen und erwachsenen visuelle System hat sich bewährt in das Verständnis der Entwicklung, Plastizität und Funktion der verschiedenen visuellen Zentren ^1-4 sein. Die molekularen, zellulären und physiologischen Folgen dieser sensorische Deprivation kann Einblicke in die normale Entwicklung, wie reguliert wird und wie etablierte kortikalen Schaltkreisen zu bewältigen und ändern ihre Struktur und Funktion in Reaktion auf eine solche umfassende Veränderung in der Erfahrung.

Verschiedene Methoden der visuellen Deprivation existieren und sie alle haben ihre spezifischen Vorteile in der Vision-Forschung haben. Zum Beispiel dunkel Aufzucht spezifisch eliminiert visuell getrieben Aktivität noch berührt sie nicht die spontane Netzhautaktivität. Ebenso Deckel Nähte oder Augenklappen entfernen gemusterten Visualisierungsl Eingabe ohne Spontanaktivität zu stören, sondern sie ermöglichen verteilten Lichteinfall durch die geschlossenen Augen. Diese Methoden sind reversibel und haben gezeigt, dass wertvolle für das Verständnis der Rolle der gemusterten Vision und Low-Level-Eingänge Korrelation von Fernglas in Bildhauerei kortikalen Schaltkreisen während der Entwicklung ^6-8 sein. In der Glaukomforschung, hat der Sehnerv verknallt Modell bei erwachsenen Tieren weit verbreitet, weil es wird ein fortschreitenden Verlust von retinalen Ganglienzelle Eingänge, die den Sehnerv bilden ^9,10. Auf der anderen Seite, Enukleation, wo das Auge und damit die Retina vollständig und sofort entfernt wird, ist die geeignete Wahl der Benachteiligung wenn das Ziel ist, irreversibel zu entfernen sowohl spontan als auch strukturierte Sicht auf einmal. Es induziert auch eine robuste intraokularen Aktivität Ungleichgewicht, welches das Signal-Rausch-Verhältnis der Aktivität Kartierungsstudien ^11,12 erweitern kann. Vergleichen funktionellen und strukturellen Veränderungen in Reaktion auf Enukleation mit those nach Entzug von weniger drastischen Methoden wie Deckel Naht zum Beispiel, könnte auch neue Einblicke in die Rolle der spontanen Aktivität der Netzhaut in beiden homöostatischen und synaptische Plastizität Typen aus.

Enukleation löst einen Verlust der trophischen Einflüsse in direkter Netzhaut Ziele. So sind beispielsweise BDNF-Spiegel signifikant in der seitlichen Kniehöcker (LGN) und Colliculus superior der erwachsenen Ratten entkernte ¹³ herunterreguliert. Reaktive Sauerstoffspezies, die als Botenstoffe fungieren, um strukturelle Umbau zu vermitteln, wurden auch in subkortikalen Strukturen der erwachsenen Ratte visuelle System ¹⁴ erfasst. Außerdem Mikroglia und Astroglia-Aktivierung in verschiedenen subkortikalen visuellen Zielstrukturen in der Maus treten in einem bestimmten Post-Ausschälung Zeitrahmen von einer Woche ^15. Zusammen, Optik Deafferentation Ergebnisse in verschiedenen subkortikalen Reaktionen an der Glia, strukturellen und molekularen Ebene. Trotz dieser subkortikalenEffekte, bedeutet dies nicht zwangsläufig implizieren Wirkungen an der kortikalen Ebene ^16. Bemerkenswert, verkehrsträgerübergreif kortikale Plastizität, einschließlich Änderungen in anderen Sinnesbereichen neben der Stärkung der nicht-visuelle Eingänge zum beraubt visuellen Kortex auftreten, nachdem sowohl monokulare (ME) ^3,4,17,18 und Fernglas (BE) ^1,17 Enukleation.

Neben dem Beitrag zur visuellen Neurowissenschaften, können Enukleation als eine Art Deafferentation verwendet werden, um die Balance zwischen neuroprotektiven ¹⁹ und neurodegenerative ^20-22 Eigenschaften des zentralen Nervensystems zu untersuchen.

Verschiedene Verfahren zur Enukleation durchführen, sind bereits in der Literatur beschrieben. Bestimmte Methoden zur in-vivo-ME bei Ratten und Mäusen sind weniger einfach durch unnötige Schnitte Orbital Muskeln und Gewebe ^23-25. Andere Publikationen wie Mahajan et al. (2011) ⁵ eine detaillierte Protokoll mit stumpf für ein Hochdurchsatz-Sammlung von Augen, die Genotyp-Phänotyp-Korrelationen, wahrscheinlich post-mortem zu studieren. Für ihren Zweck, ist das Verfahren schnell und bequem. Jedoch ist dieses Verfahren für die In-vivo-Enukleation weniger geeignet, wenn man entscheidet, den afferenten Sehbahn folgenden Enukleation (in lebenden Tieren) anstelle des Auges selbst zu studieren. In einer solchen Umgebung ist von großer Bedeutung, post-Enukleation Überleben. Auch minimale Schäden in vivo und die Erhaltung der Sehnerv und Augenhöhlengewebe ist günstig. Hier präsentieren wir eine alternative Methode Enukleation, mehr ähnlich dem von Faguet et al (2008) ^26, dass bestimmte vorteilhaften Eigenschaften bietet:. Sie mit einer schnellen postoperativen Erholung verbunden ist und sich durch eine sehr niedrige Schwelle Lern gekennzeichnet für Forscher. Im Allgemeinen sind die verschiedenen Methoden ergänzen je nach Schwerpunkt der späteren Forschung: Augen Morphologie oder Sehbahn Forschung.

ve_content "> In der Summe kann Ausschälung von der Vision der Forschung auf Untersuchungen von Homöostase und Cross-modale Plastizität des Gehirns, Glia-Antworteigenschaften und Stabilität Axon angewendet werden. In diesem visualisiert Artikel zeigen wir eine praktikable und zuverlässige Methode zur in-vivo-Augen Enukleation in die Maus.

Protokoll

Alle Experimente wurden von der ethischen Forschungsausschuss der KU Leuven zugelassen und waren in strikter Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie des Rates vom 22. September 2010 (2010/63 / EU) und mit der belgischen Gesetzgebung (KB vom 29. Mai 2013). Jede mögliche Anstrengung wurde gemacht, um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der Tiere zu reduzieren.

1. Tier Behandlung und Anästhetika

1. Betäuben die Maus mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung von Ketamin-Hydrochlorid (75 mg / ml) und Medetomidin-Hydrochlorid (1 mg / kg) in Salzlösung.
2. Überprüfen Sie die Reflexe durch Kneifen Sie die Zehen mit einer Pinzette, um sicherzustellen, die Maus ist komplett sediert.
3. Gelten 70% Ethanol, die Augenlider und die Region rund um das Auge mit einem Wattestäbchen zu desinfizieren. Überprüfen Sie das Augenlid Reflex zusätzlich beurteilen den Grad der Sedierung.

2. Entfernen der Augen

1. Stellen Sie sicher, das Tier befindet sich auf einem ebenen, trockenen undglatte Oberfläche.
2. Sterilisieren eine Zange mit einer gebogenen, gezackten Spitze (bevorzugt Spitzengröße: 0,5 x 0,4 mm).
3. Drücken Sie vorsichtig auf die Augenwinkel (Augenwinkel) mit der Zange, bis der Augapfel aus der Steckdose verdrängt und der Sehnerv erreichbar ist.
4. Führen Sie die Zange hinter dem Auge. Drücken und halten Sie den Sehnerv fest, vorzugsweise mit dem Beginn der Kurve und nicht der Spitze der Zange. Dies wird helfen, die Welt aus der Steckdose zu heben und die komplette Sehnerv klemmen.
5. Machen Sie kreisende Bewegungen mit der Hand, die Zange in der Richtung mit dem geringsten Widerstand, während die Maus auf der flachen Oberfläche bleibt. Die Maus wird entlang der Oberfläche schwingt entsprechend der Richtung der Bewegung der Hand.
6. Führen diese Aktion mit allmählich zunehmender Geschwindigkeit, bis der Sehnerv in zwei schnürt (in der Regel zwischen 7 bis 15 Kreisbewegungen, etwa eine halbe bis eine volle Umdrehung pro Sekunde). Daher ist die freistehende Augapfelentfernt.

3. post-operative Betreuung

1. Im Falle von Blutungen (selten), füllen die Umlaufbahn mit einer viskosen Koagulat und blutstillendes Mittel.
2. Kehren Sie die Anästhesie durch Injektion von 1 mg / kg atipamezol Hydrochlorid in Kochsalzlösung intraperitoneal.
3. Verwalten 1 mg / kg Meloxicam intraperitoneal alle 24 Stunden, um Schmerzen zu lindern.
4. Augensalbe anwenden, um den verbleibenden Auge zu Austrocknung der Hornhaut zu verhindern.
5. Lassen Sie das Tier zurück auf einer Heizplatte oder wickeln Sie das Tier in Isoliermaterial in einem separaten Käfig, um die Körpertemperatur zu steuern.
6. Messen des Gewichts der Maus jeden Tag für mindestens 2 Tage. Gewichtsverlust kann Leiden zeigen und in diesem Fall weiterhin Meloxicam Behandlung, bis das Tier vollständig wiederhergestellt wird.

Ergebnisse

Figur 1 veranschaulicht die erfolgreiche Entfernung des Auges unter Verwendung des beschriebenen Protokolls und wird durch das Fehlen von Blutungen oder einem scheinbaren physikalischen Beschädigung der Orbitalgewebe oder die Augenhöhle (1A, 1B) ist. Darüber hinaus hat das Auge entfernt eine glatte Hornhaut, Aderhaut und Optical Disc, deutet auf einen völlig intakten Welt (Abbildung 1c). Da unser Protokoll umfasst die Klemmung der Sehnerv hinter dem Auge und mechanische Dreh ist der Sehnerv des Auges entfernt verengten an der Basis der Netzhaut (1D). Durchführung der beschriebenen Vorgehensweise führt zu einem sauberen Schnitt Sehnerv, ohne Schäden an der umgebenden Hirnbereich (1E).

Monokularen Enukleation in Kombination mit Aktivität Mapping (Abbildung 2), ermöglicht es, die Funktions scharf abzugrenzen oder Augen spezifischen Eingabebereiche in der kontralateralen Visualisierungsl Kortex der Maus ^12,27 oder sogar Augendominanz Spalten in höherer Ordnung Säugetiere wie Affen ^28.

In Experimenten mit Mäusen, die Entfernung von einem (ME) oder beider Augen (BE) mit gezielten visuellen Stimulation und der Detektion von mRNA oder Zif268 c-Fos Protein-Expressionsniveaus kombiniert angewendet, um regionale neuronale Aktivierung in der Sehrinde ^12,27 aufzudecken . Im Gegensatz zu optisch stimulierte Kontrollen (Figur 2A), zeigte BE Mäusen basale Aktivität in der Sehrinde aufgrund mangelnder visueller Eingang (2B) zu vervollständigen. Als solche wurden die Grenzen zwischen bildender mit nicht-visuellen Kortex (dh. Somatosensorischen Kortex bei mehreren vorderen Abschnitte und auditorischen Kortex in mehr hinteren Abschnitte) aufgedeckt. Ergebnisse von ME-Mäusen mit einer einwöchigen Überlebenszeit visualisiert die Augen bestimmte Eingabebereiche in der kontralateralen visuellen Kortex. Die beiden monokular angetrieben Regionen waren hypoaktiven und befindet medial und lateral der Mittel binokularen Zone (2C).

Abbildung 1. Qualitative Bewertung der post-Enukleation Zustand der Augenhöhle, die entfernt Auges und des Sehnervs. Nach Entfernung des Auges mit einer gebogenen Pinzette (A) kein Ausbluten oder Schäden in der Augenhöhle (B) beobachtet. Das entfernte Auge völlig intakt, wie durch einen normalen Erscheinungsbild der Hornhaut und der Aderhaut (C, D) reflektiert wird. Der Sehnerv ist an der Papille, wo es das Auge (D) lässt schnürt. Prüfung der ventralen Teil des Gehirns zeigt eine saubere Schnitt Sehnerv (Stern) und keine sichtbare Beschädigung an anderen Strukturen (E). Maßstabsbalken in C, D: 1 mm. Balken in E: 5 mm. A: vordere; L: links; P: posterior; R: Richtig.

Abbildung 2. Funktions Auge-Eingang spezifische Unterteilungen in der Maus visuellen Kortex durch Enukleation enthüllt. Schwarze und graue Linien, die die Augen und Kortex verbinden stellen die Überquerung der retinalen Afferenzen und das Auge bestimmten Eingangs Regionen. Neuronalen Aktivität auf koronalen Abschnitte der Kontrolle (A) visualisiert, BE (B) und ME (C) Mäusen durch radioaktive in situ Hybridisierung (ISH) für Zif268 (Graustufen) um -3,40 mm Bregma Ebene. In Kontrolltieren (A), der visuelle Kortex in beiden Hemisphären drückt eine hohe Aktivität für die visuelle Stimulation. Wenn eine oder beide Auge (n) ausgerottet werden, ist eine klare Abnahme der Aktivität in entsprechenden Signal beraubt kortikalen Regionen sichtbar. Monokular entkernte (C)-Mäuse zeigen eine Zone mit hoher Activität in der binokularen Region des visuellen Kortex durch eine verminderte Signal in den monokularen Zonen kontralateral zu der entfernten Auge umgeben. Maßstab: 2 mm. Mit Genehmigung von Van Brussel et al ¹² abgedruckt.

Diskussion

Um eine erfolgreiche Enukleation nach unserer Methode durchzuführen, die wichtigsten Schritte zu beachten sind: 1) mit einer Pinzette mit gebogener Spitze und gezackten der entsprechenden Größe; 2) die Durchführung der Enukleation auf eine glatte und trockene Oberfläche; und 3) nach und nach die Beschleunigung der kreisenden Bewegungen in die Richtung mit der geringsten Reibung.

Für eine effektive Ergebnis ist es wichtig, den geeigneten Zange gekennzeichnet durch einen gekrümmten und gezackten Spitze verwenden (bevorzugte Spitze Größe: Maus: 0,5 x 0,4 mm; Ratte: 2,15 x 1,3 mm). Die Krümmung ermöglicht eine gute Anbindung an den Sehnerv nach Augapfel Hubraum und ist für die korrekte Platzierung der Hand notwendig, wenn die Durchführung der kreisenden Bewegungen. Glatte Tipps sind nicht zu empfehlen, da sie nicht die notwendige Griff, wenn die Sehnerven. Wird der Sehnerv in den kreisenden Bewegungen richtig zu halten führt zu Bruch der Augenarterie, schlechte Ablösung des Auges und damit schlechte Reproduzierbarkeit.Daher ist es zum ersten Training am eingeschläfert Tiere für die Optimierung der Zange Handhabung, um eine maximale Tierschutz einmal die Anwendung der Methode in vivo zu gewährleisten wird empfohlen, diese Technik. Erfolgreicher Augen Enukleation kürzlich auch in der Ratte in unserem Labor unter Verwendung der gleichen Technik mit Ausnahme der Drehung des Tierkörpers manuell und halten die stationären Zange durchgeführt.

Eine Einschränkung der Technik ist, dass es möglicherweise die Netzhaut schädigen. Daher ist diese Methode für das Sammeln von Netzhaut der Histologie ⁵ ausführen weniger geeignet. Darüber hinaus ist unser Verfahren beschränkt auf Augenöffnung Alter veröffentlichen, da der Augapfel muss aus der Steckdose verlagert werden, ohne das Abtragen oder Schneiden die Augenlider.

Augen Enukleation in verschiedenen Arten, einschließlich Nagetiere, wird routinemäßig unter Verwendung von alternativen Verfahren, die häufig zur Folge der Entfernung der Augenlider und Schneiden des Sehnervs ^18,23-25. Diese Methods sind eher invasiv und haben eine höhere Lernkurve als die hier beschriebenen Technik. Ohne die Notwendigkeit zur Entfernung oder Vernähen der Augenlider, die nach der Operation Wiederherstellungszeit minimiert, was zu höheren Tierschutz und mehr reproduzierbare Ergebnisse.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine hydrochloride (Anesketin)	Dechra Veterinary Products (Eurovet)	BE-V136516
Medetomidine hydrochloride (Domitor)	Orion Corporation (Janssen Animal Health)	BE-V151742
Atipamezol hydrochloride (Antisedan)	Orion Corporation (Elanco Animal Health)	BE-V153352
Meloxicam (Metacam)	Boehringer Ingelheim Vetmedica	N/A
Eye ointment (Fucithalmic)	Leo Pharma nv-sa	BE 144654
Moria MC31 Forceps - Serrated Curved	Fine Science Tools	11370-31	For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Narrow Pattern Forceps - Curved	Fine Science Tools	11003-13	For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Hemostatic cotton wool	Qualiphar	N/A	Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products)