Высоковоспроизводимого и простой метод, чтобы выполнить<em&gt; В Vivo</em&gt; Глазные Энуклеация в Мауса после Eye Открытие

Резюме

Удаление глаз, также называемый энуклеация, обеспечивает полезную стратегию для изучения аспектов визуального, кросс-модального и пластичности развития вдоль млекопитающих зрительной системы, так как это вызывает необратимое частичное (монокуляр) или полную (бинокулярное) потерю зрения. Здесь мы опишем хорошо воспроизводимый и простой подход к выполнению в естественных условиях энуклеации.

Аннотация

Энуклеация или хирургическое удаление глаза в целом можно рассматривать как модель для нервов деафферентации. Она обеспечивает ценный инструмент для изучения различных аспектов визуального, кросс-модальных и пластичности развития вдоль млекопитающих зрительной системы ^1-4.

Здесь мы демонстрируем элегантный и простой метод для удаления одного или обоих глаз у мышей, которая подтвержденным мышей 20 дней до взрослых. Вкратце, вылеченный пинцетов используется для зажима зрительный нерв за глаза. Впоследствии, круговые движения выполняются сжиматься зрительный нерв и удалить глазное яблоко. Преимущества этого метода являются высокая воспроизводимость, минимальный ни к какому кровотечения, быстрое послеоперационное восстановление и очень низкий порог обучения для экспериментатора. Таким образом, большое количество животных можно манипулировать и обработаны с минимальным количеством усилий. Характер техники могут вызывать незначительное повреждениесетчатки во время процедуры. Этот побочный эффект делает этот метод менее пригоден, по сравнению с Mahajan соавт. (2011) ^5, если цель состоит в сборе и анализе ткани сетчатки. Кроме того, наш метод ограничен после глазных открытия возрастов (мыши: P10 - 13 года), так как глазное яблоко должно быть смещены из розетки, не снимая веки. Естественных техника в энуклеация описано в этой рукописи был недавно успешно применяется с незначительными изменениями в крыс и окажется полезным для изучения афферентный зрительный путь грызунов в целом.

Введение

Удаление глаз и тем самым необратимо разрушая сенсорную поверхность рецептора (сетчатки), накладывает значительную потерю сенсорного ввода вдоль зрительного пути. Энуклеация модель в отношении несовершеннолетних и взрослых зрительной системы оказалась ценным в понимании развития, пластичность и функции различных зрительных центров ^1-4. Молекулярные, клеточные и физиологические последствия этого сенсорной депривации могут помочь в понимании, как нормальное развитие регулируется и как установлено, корковых схемы справиться и изменить их структуру и функцию в ответ на такой обширной изменения в опыте.

Различные методы визуального лишения существуют и все они имеют свои специфические преимущества в исследования зрения, связанных с. Например темно разведение специально исключает визуально приводом деятельность все же это не влияет на спонтанную сетчатки деятельность. Аналогично, крышка швы или глазные пятна удалить рисунком visuaл вход, не нарушая спонтанной активности, но они позволяют дисперсную проникновение света через закрытые глаза. Эти методы являются обратимыми и, как было показано, чтобы быть ценным в понимании роли рисунком видения и низкого уровня корреляции бинокулярного входов в скульптуры корковых цепей в процессе разработки ^6-8. В глаукомы исследований, зрительный нерв давка модель у взрослых животных широко используется, потому что он устанавливает прогрессивную потерю входов сетчатки ганглиозных клеток, которые составляют зрительный нерв ^9,10. С другой стороны, энуклеации, где глаз и, таким образом, сетчатка полностью и немедленно удаляют, является подходящим выбором лишения, когда цель состоит в том, чтобы необратимо удалить как спонтанное и рисунком видение сразу. Это также вызывает устойчивую внутриглазного деятельности дисбаланс, который может увеличить отношение сигнала к шуму в картографическая деятельность исследований ^11,12. Сравнивая функциональные и структурные изменения в ответ на энуклеации с гоOSE после лишения менее радикальных методов, таких как крышки шва например, может также выставить новому взглянуть на роль спонтанного сетчатки деятельности в обоих гомеостатических и синаптических типов пластичности.

Энуклеация вызывает потерю трофических влияний в прямых сетчатки целей. Например, уровни BDNF значительно подавляется в латерального коленчатого тела (LGN) и верхний бугорок взрослых энуклеированными крыс ^13. Активные формы кислорода, которые функционируют как молекул мессенджеров посредничать структурную перестройку, также были обнаружены в подкорковых структурах взрослой крысы зрительной системы ^14. Кроме того, микроглии и активации астроглиальных в различных подкорковых зрительных целевых структур у мышей происходит в определенном после энуклеации времени от одной недели ^15. Вместе, оптические результаты деафферентации в различных подкорковых ответов на глиальных структурной и молекулярном уровне. Несмотря на эти подкорковыхэффекты, это не обязательно вовлечь эффекты на корковой уровне ^16. Обращает на себя внимание, кросс-модальный корковых пластичность, в том числе изменений в других сенсорных областей рядом с укреплением невизуальными входов в лишенного зрительной коры происходят после как монокуляр (ME) ^3,4,17,18 и бинокулярное (BE) ^1,17 энуклеация.

Помимо содействия визуального неврологии, энуклеация как тип деафферентации может быть использован для изучения баланса между нейропротективных ¹⁹ и нейродегенеративных ^20-22 свойств центральной нервной системы.

Различные процедуры для выполнения энуклеации уже описано в литературе. Некоторые методики в естественных условиях ME в крыс и мышей менее очевидны в связи с излишней срезов орбитальных мышц и тканей ^23-25. Другие публикации, такие как Mahajan и соавт. (2011) ⁵ обеспечивает подробный протокол с помощью тупым для высокой пропускной коллекции глазами для изучения генотип-фенотип корреляции, вероятно посмертно. Для их цели, метод удобно и быстро. Тем не менее, этот метод является менее подходящим для энуклеации в естественных условиях, когда один выбирает для изучения афферентный путь визуального следующую энуклеации (в живых животных), а не самим глазом. В такой обстановке, выживание после энуклеации имеет большое значение. Кроме того, минимальное в естественных повреждений и сохранения зрительного нерва и орбитальной ткани выгодно. Здесь мы представляем альтернативный метод энуклеации, более похожий на тот, описанной Faguet соавт (2008) ^26, что дает определенные выгодные свойства:. Он связан с быстрым послеоперационной реабилитации и характеризуется очень низким порогом обучения для исследователей. В общем, разные методы дополняют друг друга в зависимости от направленности последующих исследований: глаз морфологии или визуального исследования, затрагивающего пути.

ve_content "> В общем, энуклеация может применяться от исследований видения к расследований гомеостатического и кросс-модального пластичности мозга, глиальных свойств реагирования и стабильности аксонов. В этом визуализируется статье мы демонстрируем посильную и надежный метод в естественных глаз энуклеации в мышь.

протокол

Все эксперименты были одобрены этической исследовательской комиссии KU Leuven и были в строгом соответствии с Директивой Совета Европейских Сообществ от 22 сентября 2010 года (2010/63 / ЕС) и с бельгийским законодательством (KB от 29 мая 2013 года). Каждый возможно была сделана попытка свести к минимуму страданий животных и уменьшить количество животных.

1 Животное Лечение и анестетики

1. Обезболить мыши путем внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина гидрохлорида (75 мг / мл) и гидрохлорида медетомидина (1 мг / кг) в физиологическом растворе.
2. Проверьте рефлексы, зажимая пальцами с пинцетом, чтобы заверить, что мышь полностью в отключке.
3. Применить 70% этанола для дезинфекции веки и область вокруг глаз, используя наконечник хлопка. Проверьте век рефлекс дополнительно оценить степень седации.

2 Снятие Eye

1. Убедитесь, что животное находится на ровной, сухой игладкая поверхность.
2. Стерилизовать пинцетом с изогнутым, зубчатые наконечника (предпочтительный размер наконечника: 0,5 х 0,4 мм).
3. Аккуратно нажмите на глазной щели (угол глаза) при помощи щипцов, пока глазное яблоко не перемещенных из розетки и зрительный нерв достижим.
4. Руководство щипцы позади глаза. Нажмите и удерживайте зрительный нерв твердо, предпочтительно с начала кривой, а не на самом кончике пинцета. Это поможет поднять шар из розетки и зажать полный зрительный нерв.
5. Сделайте круговые движения рукой держа щипцы в направлении с наименьшего сопротивления, а мышь остается на плоской поверхности. Мышь будет качаться вдоль поверхности в соответствии с направлением движения руки.
6. Выполнение этого действия с постепенным увеличением скорости до тех пор, зрительный нерв не сжимается в двух (как правило, от 7 до 15 круговых движений, приблизительно от половины до один полный оборот в секунду). Таким образом, отдельно глазное яблокоудалены.

3 Послеоперационный уход

1. В случае кровотечения (редко), заполнить орбиту с вязкой коагулята и кровоостанавливающее средство.
2. Обратный анестезии путем введения 1 мг / кг atipamezol гидрохлорида в солевом растворе внутрибрюшинно.
3. Администрирование 1 мг / кг Мелоксикама внутрибрюшинно каждые 24 ч, чтобы облегчить боль.
4. Применение глазную мазь с оставшимся глазом, чтобы предотвратить дегидратацию роговицы.
5. Пусть животное восстановить на плитке или обернуть животное в изоляционного материала в отдельной клетке, чтобы контролировать температуру тела.
6. Измеряют вес мыши каждый день в течение по крайней мере 2 дней. Потеря веса может указывать страданий и в этом случае, продолжать лечение мелоксикам, пока животное не будет полностью восстановлена.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует успешное удаление глаза, используя описанный протокол и характеризуется отсутствием кровотечений или любой видимой физического повреждения орбитальной ткани или глазницы (1А, 1В). Кроме того, удаляется глаз имеет гладкую роговицы, сосудистая оболочка и оптический диск, ориентировочный для совершенно нетронутыми миру (Рисунок 1C). Так как наш протокол включает в себя зажим зрительного нерва позади глаз и механической токарной обработки, зрительный нерв из удаленного глаза сжимается в нижней части сетчатки (рисунок 1d). Выполнение описанных результатов процедур в чистой резки зрительного нерва без ущерба для окружающей области мозга (Рисунок 1E).

Монокуляр энуклеация, в сочетании с отображением деятельности (рисунок 2), позволяет резко разграничить функциональные или глаз отдельные входные регионы в противоположной visuaл кора мыши ^12,27 или даже глазных доминантным колонкам в высших млекопитающих, как обезьяны ^28.

В экспериментах с мышами, удаление одного (ME) или оба глаза (BE) в сочетании с целевой визуальной стимуляции и обнаружения zif268 мРНК или с-Fos уровней экспрессии белка применялась для выявления региональной нейронов активацию в зрительной коре ^12,27 . В отличие от визуально стимулированных управления (Рисунок 2А), BE мыши показали базальную активность в зрительной коре вследствие полного отсутствия визуального ввода (Рисунок 2B). Таким образом, границы между визуальным с не-зрительной коры (т.е.. Соматосенсорной коры в более передних отделов и слуховой коры в более заднего отделов) были обнаружены. Результаты от меня мышей с временем выживания одну неделю визуализируются конкретные входные регионы глаз в противоположной зрительной коры. Два монокулярно приводом регионы были гипоактивное и расположен MediAl и боковой центральной зоны бинокулярного (фиг.2С).

Рис.1 Качественная оценка после энуклеации состоянии глазницы, снятой глаза и зрительного нерва. После удаления глаза с изогнутым пинцетом (А) не кровотечение или повреждение не наблюдается в глазницу (B). Удаленный глаз полностью нетронутыми, как отражение в нормальный вид роговицы и сосудистой оболочки (C, D). Зрительный нерв сжимается в диск зрительного нерва, где он выходит из глаз (D). Экспертиза брюшной части мозга показывает чистый срез зрительный нерв (звездочка) и без видимых повреждений других структур (E). Шкала баров в C, D: 1 мм. Бар Шкала в E: 5 мм. : Передняя; L: левая; P: задний; R: правой.

Рис.2 Функциональная глаз входные конкретные подразделения в мыши зрительной коры как выявленные энуклеации. Черные и серые линии, соединяющие глаза и мозга представляют перехода через сетчатки афферентов и конкретных входных регионах глаз. Нейронная активность визуализируется на корональных секций управления (A), BE (B), и ME (C) мышей на радиоактивный в гибридизация (МОГ) для zif268 (шкалы серого) вокруг уровня брегмы -3,40 мм. У контрольных животных (А), зрительная кора в обоих полушариях выражает высокую активность следующий визуальной стимуляции. Если один или оба глаза (ы) искоренены, явное снижение сигнала деятельности видна в соответствующих лишенных областях коры. Монокулярно энуклеировали (C) мышей показывают зону высокой ActiVity в бинокулярного зоны зрительной коры в окружении снижению сигнала в монокулярных зон контралатеральных к снятой глаза. Шкала бар: 2 мм. Печатается с разрешения Ван Брюсселе соавт ^12.

Обсуждение

Для успешного энуклеацию согласно нашему методу, наиболее важные шаги, чтобы рассмотреть: 1) с помощью щипцов с криволинейным и зубчатым наконечником соответствующего размера; 2) выполнения энуклеации на гладком и сухую поверхность; и 3) постепенно ускоряя круговыми движениями в направлении с наименьшим трением.

Для эффективного результата необходимо использовать соответствующие щипцы характеризующиеся изогнутой и зубчатым наконечником (предпочтительный размер наконечника: мышь: 0,5 х 0,4 мм; крыса: 2,15 х 1,3 мм). Кривизна позволяет для легкого доступа к зрительному нерву после глазного яблока перемещения и необходимо для правильного размещения рук при выполнении круговых движений. Гладкие чаевые не рекомендуется, так как они не имеют необходимого сцепление при проведении зрительный нерв. Неспособность удерживать зрительный нерв должным образом во время круговых движений приводит к разрыву глазной артерии, плохое отряда глаза и, следовательно, плохой воспроизводимости.Поэтому рекомендуется первой практике эту технику на эвтаназии животных для оптимизации пинцетом обработки, чтобы гарантировать максимальную защиту животных один раз применения метода в естественных условиях. Успешное глаз энуклеация недавно также были выполнены на крысах в нашей лаборатории используя ту же технику для поворота тело животного вручную и держать в неподвижном щипцов исключением.

Одним из ограничений метода является то, что она могла бы повредить сетчатку. Поэтому этот способ не очень подходит для сбора сетчатки для выполнения гистологию ^5. Кроме того, наш метод ограничен пост глазные открытия возраст, так как глазное яблоко должно быть смещены из розетки без обработки или резки веки.

Глаз энуклеация у разных видов, в том числе грызунов, рутинно выполняется с использованием альтернативных методов, которые часто влекут за собой удаление век и резки зрительный нерв ^18,23-25. Эти метоDS имеют тенденцию быть более агрессивным, и имеют более высокую, чем обучения методике, описанной здесь. Без необходимости удаления или ушивание веки, после операции время восстановления сводится к минимуму, что приводит к повышению благосостояния животных и более воспроизводимых результатов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine hydrochloride (Anesketin)	Dechra Veterinary Products (Eurovet)	BE-V136516
Medetomidine hydrochloride (Domitor)	Orion Corporation (Janssen Animal Health)	BE-V151742
Atipamezol hydrochloride (Antisedan)	Orion Corporation (Elanco Animal Health)	BE-V153352
Antibiotics (cefazolin, Kefzol)	Eurocept Pharmaceuticals	BE 106267
Eye ointment (Fucithalmic)	Leo Pharma nv-sa	BE 144654
Moria MC31 Forceps - Serrated Curved	Fine Science Tools	11370-31	For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Narrow Pattern Forceps - curved	Fine Science Tools	11003-13	For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Hemostatic cotton wool	Qualiphar	N/A	Other hemostatic agents are equally suitable (e.g., Viscostat, #649, Ultradent Products)