ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

Summary

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

Abstract

פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת משמש בדרך כלל כדי לחקור פונקצית שרשרת הובלת אלקטרונים. אנו מתארים שיטה לקבלת דגימות של lateralis vastus האנושי, בידוד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של רקמת שריר שלד, ופרופיל respirometric מבוסס צלחת באמצעות מנתח שטף תאי (XF). השוואה של פרופילי respirometric שהושגו באמצעות 1.0, 2.5 ו 5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה עולה כי 1.0 מיקרוגרם מספיק כדי למדוד נשימה וכי 5.0 מיקרוגרם מספק תוצאות עקביות ביותר המבוסס על השוואה של סטיות התקן. ניתוח כתם המערבי של מיטוכונדריה המבודדת לסמן המיטוכונדריה COX IV וGAPDH סמן רקמה שאינה המיטוכונדריה מצביע על כך שיש זיהום שאינה מוגבל במיטוכונדריה שימוש בפרוטוקול זה. היכולת ללמוד respirometry המיטוכונדריה קטנה כמו 20 מ"ג של רקמת שריר מאפשרת למשתמשים לנצל ביופסיות פרט לנקודתי קצה מחקר מרובים בקליניפרויקטי מחקר.

Introduction

המיטוכונדריה הם אתרי ייצור האנרגיה העיקריים בתא ויש לי תפקידים חשובים בהזדקנות, כמו גם גיל הקשורות בהפרעות שונות כמו מחלות לב וכלי דם, מחלת אלצהיימר, סוכרת, סרטן, השמנת יתר ו. פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת מספק ניתוח ישיר של שרשרת הובלת אלקטרונים פונקציה (ETC) ותרם באופן משמעותי להבנת ביולוגיה של המיטוכונדריה שלנו ותפקידה בבריאות ובחוליים. מיטוכונדריה המבודדת משמשות ללמוד היבטים שונים של יו-אנרגיה כמו, תחבורת מצע, פעילות synthase ATP, דליפת פרוטון, וכו 'המתודולוגיה שתוארה בכתב היד הזה כבר מותאמת כדי לאפשר ניתוח respirometric של מיטוכונדריה מבודדת מביופסיות רקמות שריר שלד התקבלו מבני אדם. פרוטוקול הביופסיה שתואר בכתב היד הזה נוצל על ידי צוות שלנו במשך 12 השנים האחרונות. הקבוצה שלנו ביצעה מעל 700 נהלים במבוגרים בגילים שונים,עד 90 שנים ישנות, ועם תנאי מחלה כרוניים שונים ללא כל בעיות בטיחות שליליות. היבט מרכזי של פרוטוקול זה הוא שזה תוכנן במיוחד כדי לנצל את הכמויות מינימליות של רקמה, ובכך להקל על השימוש בה במחקרים קליניים.

פרוטוקולים שונים פותחו לבידוד המיטוכונדריה. פרננדז-Vizarra et al. ^1,2 תאר שיטה לבידוד המיטוכונדריה מרקמות עכברוש שונות, כמו גם תאים בתרבית. גרסיה-Cazarin et al. ³ דיווח שיטה לבידוד המיטוכונדריה משרירי שלד מחולדה ועכבר. שיטה לבידוד המיטוכונדריה ממוח חולדה כבר דווח על ידי איגלסיאס-גונזלס et al. ⁴ גרוס, et al. ⁵ דיווחו שיטה של בידוד המיטוכונדריה באמצעות barocycler ו / או מגרסת PCT. לאחרונה, פרנקו ואח '. ⁶ דווח שיטה של בידוד המיטוכונדריה מועשר באמצעות אנטי-TOM22 חרוזים מגנטיים.

בעוד הפרוטוקולים הללו להניב תוצאות מצוינות, דרישות גודל רקמה הן גבוהות בהשוואה לשיטה שתוארה בכתב היד הזה. לדוגמא, גרוס et al. ⁵ השתמש 1.5-1.8 גרם של שריר הגסטרוקנמיוס, וכ -2 גרם של רקמת הכליה. באופן דומה, פרנקו ואח '. ⁶ משמש 500 רקמת כבד עכבר מ"ג. מניסיוננו, תשואות אופייניות צפויות מביופסיה מחט percutaneous של שרירי שלד (lateralis vastus) נעות 100-200 מ"ג. היכולת להעריך את התפקוד המיטוכונדריה 20-50 מ"ג של רקמת שריר באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן מאפשרת למשתמשים לבצע הערכות מרובות לביופסיה ודגימות חנות לשימוש עתידי בניסויי ביולוגיה מולקולריים אחרים. זוהי תכונה קריטית במחקר קליני ומחקרים אחרים הדורשים שימוש חרוץ של דגימות. יש לציין כי בעבר המיטוכונדריה קפוא לא טובה ללימוד נשימה בשילוב בשל outer נזק קרום המיטוכונדריה ואובדן פעילות ציטוכרום C. השיטה שלנו הותאמה ושונה מהשיטה שפורסמה על ידי צ'פל ופרי ^7.

שימוש בשיטות שתוארו בכתב היד הזה, יש לנו לאחרונה דווח כי פרופיל respirometric של מיטוכונדריה מבודדת מvastus אדם lateralis מתואם ישירות עם יכולת פיזית, נמדדה כמהירות הליכה ^8.

Protocol

הערה: הפרוטוקול המתואר אושר על ידי מועצת המנהלים מוסדי הסקירה של בית הספר ווייק פורסט לרפואה. הסכמה מדעת הושגה בכתב. כל המשתתפים היו מבוגרים בריאים מבוגרים (65-79 שנים) משני המינים, עם BMI שנע 23-35.

1. ביופסיה של שריר שלד

1. כפי שתואר לעיל, ⁹ לבצע את כל הביופסיות בשעתי הבוקר המוקדמות לאחר O / N מהיר. שאל את הנושאים להימנע מנטילת אספירין, מרשם ותרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידים מעבר לדלפק, או תרכובות אחרות שעשויים להשפיע על דימום, טסיות דם, או שטפי דם בשבוע שלפני הביופסיה. שאל את המשתתפים להימנע גם מכל פעילות מאומצת במשך לפחות 36 שעות לפני הביופסיה.
   הערה: שריר מתקבל מvastus lateralis באמצעות טכניקת ביופסית מחט percutaneous עם מחט מלעורית בהרדמה מקומית עם לידוקאין 1%. אין סיבוכים רפואיים או oיס דיווח על תופעות לוואי מהתהליך שהתרחשו ביחידת המחקר הקלינית שלנו.
2. הערה: הליך הביופסיה תאר מותאמת מזה של Bergstrom ^10.
   1. בקצרה, באופן מקומי לנהל בלטפל ידוקאין 1% לא לחדור לשריר. בצע את זה עם תקופת ההמתנה 10 דקות כדי לאפשר אלחוש מספיק.
   2. קח את הביופסיות מהבטן של השריר (אזור אמצע השריר בין ההכנסה ומוצא) הימנעות אזורי subfascial וmyotendonous.
      1. השתמש במחט מלעורית (מכשיר לשימוש חוזר יניקה סייעה בצד חיתוך חלון וגליל חיתוך פנימי) ומעקב "פופ" fascial או התנגדות של fascia כמדריך.
      2. לאמוד את העומק עם מחט ההרדמה, ואז שוב מרגיש את זה עם להב סכין המנתחים הצר ולעשות חתך 4-5 מ"מ דרך fascia. לקדם את המחט דרך החתך עד שמוכנס לתוך השריר.
      3. אסוףדגימות מרובות עם החלון פנו לכיוונים שונים. החל יניקה רציפה באמצעות מזרק 60 סמ"ק תוך קידום ונסיגת דגימות שריר לתוך מחט percutaneous 03:58 פעמים בכיוונים שונים. להפסיק את השאיבה ולהסיר את המחט.
         הערה: כל מעבר (הכנסה והוצאה של מחט) לא צריכה לקחת פחות מדקה.
      4. יש לך עוזר להפעיל לחץ משרד לנקב אתר במשך 5 דקות כדי להקים עצירת דימום. נתק מחט מצינור יניקה ולהסיר בזהירות דגימות שריר מהחלון והחבית.
   3. הפוך לעבור שני אם יש צורך יותר שרירים על ידי חזרה על ההליך לעיל.
   4. הסר את כל קרישי דם גלויים ממדגם השרירים באמצעות מלקחיים, לשקול את המדגם, ואת המקום באופן מיידי בצינור המכיל DPBS קר כקרח.
      הערה: התשואה הממוצעת באמצעות מתודולוגיה זו היא 150 ± 20 מ"ג.

2. בידוד מיטוכונדריאלי

1. טרי להכין Chappel-פרי (CP) ומאגרי מיטוכונדריאלי Assay הפתרון (MAS) (טבלה 1) ביום של הניסוי, או aliquot ולאחסן אותם ב -20 ° C. הכן את התרכובות בsulfoxide דימתיל בריכוז של 2.5 מ"מ וaliquot ולאחסן ב -20 ° C. השתמש בaliquots החיץ והמתחם המאוחסן ב -20 ° C בתוך 2 חודשים מיום ההכנה.
2. הסר רקמת חיבור גלויה מהמדגם באמצעות מספריים ופינצטה חדים; במידת צורך שימוש במיקרוסקופ על הצעד הזה. ביסודיות לשטוף דגימות 3-4 פעמים עם חיץ DPBS קר כקרח כדי להסיר דם. שמור את הדגימות על DPBS קר כקרח ותהליך בהקדם האפשרי, נזהר שלא יעלו על יותר מ -45 דקות מביופסיה. לנקוט אמצעי זהירות כדי להסיר בזהירות כל גידים או רקמת שומן מן מדגם השריר.
3. מייד קוצצים את רקמת השריר לחתיכות דקות באמצעות זוג סטרילי מספריים ולהשעות ב 500 μl ליחסי ציבור המכילים 1 מיליליטר מדד המחירים לצרכןoteinase (Nagarse) בריכוז של רקמה / g 0.2 מ"ג. בצע את זה עם דגירה 5 דקות ב RT ולאחר מכן להעביר לקרח.
4. Homogenize הרקמות טחונות שטופלו בNagarse באמצעות homogenizer אוטומטי. שמור את המדגם על קרח לאורך כל התהליך הזה. Homogenize כל דגימת רקמה ארבע פעמים, כל פעם לדופק של 2 שניות, באמצעות homogenizer האוטומטי בהגדרת מהירות של 10,000 סל"ד. שטוף את הבדיקה עם אתנול 70% ואחריו מים מזוקקים בין רקמות.
5. שטוף את הרקמה הומוגני עם נפח שווה של CP אני (500 μl עד 1 מיליליטר) ונפח 2x של CP השני (1 מיליליטר 2 מ"ל), ולאסוף את התוכן בצינור צנטריפוגות ו צנטריפוגות ב 600 XG, 4 ° C ל 10 דקות. להעביר את supernatant דרך בד גבינה רטוב, לאסוף התסנין וזורקים את הכדור, ובכך להסיר את רוב השברים שאינן במיטוכונדריה.

3. כביסה המיטוכונדריה

1. צנטריפוגה supernatant מהצעד מעל גיל 10, 000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להשעות את גלולה ב 4 מיליליטר של חיץ CP II ו צנטריפוגות נוספת ב10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: במקרים נדירים, גלולה דקה של דם נוצר מתחת לגלולה של המיטוכונדריה. במקרה זה, להסיר את גלולה המיטוכונדריה על ידי שאיפה עדינה עם חיץ CPII. ניתן להימנע בשלב זה על ידי שטיפה יסודית דם בשלב 2.
2. להשעות את גלולה שהתקבלה ב2ml שלי CP חיץ. בשלב זה להשתמש aliquot קטן מהשעיה זו להערכת חלבון. Resuspend המדגם שנותר בCP אני חיץ צנטריפוגות כאמור לעיל. להשעות את גלולה הסופית בסכום מינימאלי (200 μl) של מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS).
   הערה: חלבון assayed בשלב זה כי אני CP חיץ אין BSA, ואילו MAS בי הדגימות תהיה מאוחר יותר הופסקה אין לי BSA בזה.

4. הערכת תוכן מיטוכונדריאלי על ידי מדידת ריכוז חלבון באמצעות ערכת assay חלבון BCA

class = "jove_content"> הערה: השתמש ריכוז זה כדי לחשב את כמות המיטוכונדריה המשמשת לטעינה על microplate 24 גם למדידות respirometric, או לניסויי כתם מערביים. קח בחשבון את הגורם לדילול (10) לחישוב ריכוז החלבון.

5. בצעו את מבחני XF כפי שתואר על ידי רוג'רס, GW, et al. ¹²

הערה: דמיין את צריכת שיעור O ₂ (OCR) בpmoles O ₂ / min, או רמות מוחלטות של O ₂ ו- pH בפלט נתונים.

1. השתמש 1x MAS להכין תרכובות להיות מוזרק. הוסף ריכוז 10x של התרכובות לספירה היציאות לתת ריכוז סופי כדלקמן: נמל, ADP ['אדנוזין 5 -diphosphate, 2 מ"מ, 50 μl]; היציאה B, oligomycin (2 מיקרומטר, 55 μl); הנמל C, FCCP [4 phenylhydrazone קרבוניל ציאניד (trifluoromethoxy), 6 מיקרומטר, 60 μl]; והיציאה D, 2 מיקרומטר antimycin-A (65 μl). הכןנפח מספיק של תרכובות למספר הנדרש של בארות.
2. לקבוע את הכמות האופטימלית של המיטוכונדריה על ידי טיטרציה. לדוגמא, עומס 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה בכל טוב ב-50 μl נפח של MAS 1x קר כקרח המכיל מצע. כדי למזער את השונות בין בארות, לדלל 10x המיטוכונדריה ראשון במצע 1x MAS + קר. בשלב הבא, לספק 50 μl של השעיה זו היטב כל אחד (מלבד בארות תיקון רקע).
3. צנטריפוגה הצלחת XG ב 2000, 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, בעדינות להוסיף 450 μl של succinate 1x MAS + (10 מ"מ) וrotenone (2 מיקרומטר) (תנאים ראשוניים; ראה להלן) זה טוב. הצג את המיטוכונדריה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח עמידה הומוגני וללפני העברת הצלחת למנתח XF.
   הערה: תנאים הראשוניים המשמשים יהיה תלוי אם הנשימה היא מונעת על ידי שני המורכבים ETC או מורכב II. לנשימה מונחה השנייה מורכבת, להשתמש succinate (10 מ"מ) וrotenone (2 מיקרומטר) כתנאים ראשוניים. בלוקים Rotenone אני וsuccinate המורכבים מספק דלק למורכב II (dehydrogenase succinate). ללמוד נשימה מונעת על ידי מורכב, השתמש באחת פירובט וmalate, כל בריכוז סופי של 5 מ"מ או גלוטמט וmalate כל בריכוז סופי של 10 מ"מ כתנאים ראשוניים. האחרון יכול לסייע בהבחנה בין תפקוד לקוי של מעגל חומצת tricarboxylic ותחבורה מצע. ללמוד נשימה מונעת על ידי גם אני וגם מורכב השני מורכבים, כולל פירובט וsuccinate ללא rotenone או malate כתנאים ראשוניים. השתמש קרניטין palmitoyl כמצע לβ-חמצון.
4. רצף למדוד את הנשימה המיטוכונדריאלי בזמן אמת באמצעות respirometer ידי תכנות כפי שתואר קודם לכן ^12. השתמש בהגדרות לrespirometer ניתן בטבלה 2.
   הערה: הסבר קצר על מדינות נשימה המיטוכונדריאלי שונות הן כדלקמן:
5. מדינה 2 = מדינה בשילוב עם הווה מצע; מדינה 3 = phosphorylating נשימה בנוכחות להרוות ADP; = שאינה phosphorylating נשימה המדינה _o 4 הנגרמת על ידי oligomycin; 3U מדינה = נשימה כשהתיר מקסימאלי מגורה על ידי FCCP uncoupler; נשימה = נשימה שאינה המיטוכונדריה הנותרת לאחר מורכב עיכוב III על ידי antimycin-. כמו כן יש לציין כי, באורך של מדידת OCR בשילוב עם ריכוז המיטוכונדריה יכול להשפיע על נתונים על ידי המדלל את החמצן בתקופות המדידה.

6. מערבי כתם

הערה: קבע את סמן המיטוכונדריה COX IV וGAPDH רקמה השלם על ידי מערבי סופג כדי להבטיח העשרה של המיטוכונדריה במדגם הסופי

1. הפרד את המיטוכונדריה מבודדת ותמצית רקמה שלמה על ידי ג'לים polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן 12%.
2. העבר את החלבונים על הממברנה פלואוריד polyvinylidene (PVDF).
3. דגירה עם נוגדן COX IV (1: 20,000), ואחריו peroxidase חזרת (HRP) -conjugated נוגדנים משני. לקביעת GAPDH, להפשיט את הכתם ובדיקה עם נוגדנים חד שבטי GAPDH (1: 2,000).
   הערה: אם הבדלים בזיהום ER הם בעלי העניין, כוללת סמני ER כגון ERp72, calnexin, או calreticulin בניתוח.

תוצאות

איור 1 מתאר תרשים זרימה מפורטת של כל הפרוטוקול.

פרופילי כתם מערביים של COX IV / GAPDH (איור 2) מתארים את הביטוי של חלבון המיטוכונדריה, COX IV, והסמן שאינה המיטוכונדריה, GAPDH. ביטוי של שני COX IV וGAPDH ניכרים בכל lysate השריר. לאחר המיטוכונדריה מבודד באמצעות הטכניקה שתוארה בפרוטוקול זה, להקות COX IV עדיין ניכרו תוך GAPDH נעדר באותו החשיפה. חשיפות ארוכות יותר עשויות לחשוף להקת GAPDH קלושה. כתמים אלה מצביעים על כך שיש לי מיטוכונדריה המבודדת זיהום שאינה המיטוכונדריה מינימאלית. יתר על כן, ביטוי COX IV במיטוכונדריה המבודדת הוא עקבי בין דגימות.

איור 3 מראה פרופילים אופייניים respirometric מונעים על ידי מורכב II (succinate וrotenone) באמצעות 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה. כצפוי, OCR הכולל הוא גדל wה- i כמויות גדולים יותר של מיטוכונדריה. היחס מחושב הנשימה השליטה (RCR) assay זה הוא 7.95, מצביע על כך שההכנה של המיטוכונדריה היא באיכות גבוהה. יתר על כן, 3U המדינה OCR הוא מעט גבוה יותר מזה של המדינה 3, המאשר את איכות של המיטוכונדריה.

על מנת להשוות עקביות של תוצאות כאשר פרופיל כמויות שונות של מיטוכונדריה, ביצענו ניתוח שונה (ניתוח שונה) וחישבתי את הסכום של ריבועים (SS) כערכים בפועל של שונות באמצעות 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה נטען ל היטב (איור 4). SS מוצג למדינה 2, 3 מדינה, 3U המדינה, antimycin, וRCR. למדינת 2 ומדינת 3 מדידות, דרך אחד ANOVA היה מובהק סטטיסטי (p <0.01 וp <0.05, בהתאמה). באופן דומה, הדרך אחד ANOVA היה משמעותי מבחינה סטטיסטית לantimycin וRCR (p <0.01 וp <0.0001, בהתאמה. אין הבדל משמעותי ראה 3U המדינה בין קבוצות. Thתוצאות מצביעות על כך שESE 5.0 מיקרוגרם של מיטוכונדריה לכל גם נתן SS הנמוך ביותר בהשוואה לריכוז אחר והוא את הכמות האופטימלית לשימוש במערכת XF 24 עם האוכלוסייה של משתתפים שלנו.

איור 5 משמש כמדריך כדי לציין כיצד ניתן לצפות מדי חלבון המיטוכונדריה מבוסס על גודל מדגם שריר הראשוני. כצפוי יש קשר חזק בין כמות השריר (מ"ג) מעובד והתוכן הכולל של המיטוכונדריה החלבון (מ"ג) של המדגם הסופי.

מאגר Chappel-פרי אני (מדד המחירים לצרכן)
כימיה	ריכוז
KCl	100 מ"מ
מגבים	50 מ"מ
EDTA	1 מ"מ
4 MgSO	5 מ"מ
ATP	1 מ"מ
pH	7.4
מאגר Chappel-פרי II (CPII)
כימיה	ריכוז
KCl	100 מ"מ
מגבים	50 מ"מ
EDTA	1 מ"מ
4 MgSO	5 מ"מ
ATP	0.2 מ"מ
חומצות שומן חופשי BSA	0.50%
pH	7.4
מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS) (2X)
כימיה	ריכוז
סוכרוז	35 מ"מ
מניטול	110 מ"מ
KH 2 PO 4	2.5 מ"מ
MgCl 2	2.5 מ"מ
HEPES	1.0 מ"מ
EGTA	0.5 מ"מ
חומצות שומן חופשי BSA	0.10%
pH	7.4
מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS) עם II תנאים ראשוניים מורכבים
כימיה	ריכוז
1X MAS
Succinate	10 מ"מ
Rotenone	2 מיקרומטר
pH	7.4
מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS) עם אני תנאים ראשוניים מורכבים
כימיה	ריכוז
1X MAS
פירובט	5 מ"מ
Malate	5 מ"מ
pH	7.4
* כל המאגרים שיש לתת במים ללא יונים

שולחן פתרון 1. ומתכונים חיץ.

צעדים פרוטוקול
StartProtocol
פיקוד	זמן (דקות)	נמל
לכייל	0.00
חכה	10.00
מערבבים	1.00
חכה	3.00
מערבבים	1.00
חכה	3.00
מערבבים	0.50
מדד	3.00
מערבבים	1.00
מדד	3.00
מערבבים	0.50
הזרק
מערבבים	1.00
מדד	6.00
מערבבים	1.00
הזרק		B
מערבבים	1.00
מדד	3.00
מערבבים	1.00
הזרק		C
מערבבים	1.00
מדד	3.00
מערבבים	1.00
הזרק		D
מערבבים	1.00
מדד	3.00
EndProtocol

>

טבלת 2. מערבבים, למדוד, ולערבב הגדרת מחזור לrespirometer.

איור 1. תרשים זרימה של כל הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg "/>
איור 2. כתם מערבי נציג לרקמת שריר שלד כולו, כמו גם מיטוכונדריה מבודדת. תמצית רקמה שלמה, כמו גם מיטוכונדריה מבודדת היו immunoblotted עם נוגדן COX IV כסמן המיטוכונדריה ונוגדן GAPDH לשליטה שאינה במיטוכונדריה. אין להקת GAPDH נצפתה במיטוכונדריה המבודדת המצביעה על זיהום קטן או לא ממקורות שאינן במיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. פרופיל respirometric נציג של מיטוכונדריה מבודדת מvastus אדם lateralis. שלושה ריכוזים של מיטוכונדריה המבודדת, 5.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו1.0 מיקרוגרם מחדש המשמש assay זה. ריכוזים סופיים של תרכובות לאחר זריקות נמל היו 2 מ"מ ADP (יציאה); 2 oligomycin מיקרומטר (יציאה ב '); 6 מיקרומטר FCCP (C נמל); ו -2 מיקרומטר antimycin (D נמל). RCR שחושב לטווח זה היה 7.95. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. הסכום של ריבועים. הסכום של ריבועים למדינות השונות במיטוכונדריה הנשימה וRCR באמצעות 5.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו1.0 מיקרוגרם מיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ig5highres.jpg "/>
איור 5. זה יכול לשמש כמדריך להעריך את כמות חלבון המיטוכונדריה שניתן לצפות על סמך ניתוח רגרסיה שרירים מדגם משקל ההתחלתי:. מהסכום של שריר (מ"ג) ותשואה הכוללת של המיטוכונדריה חלבון (מ"ג). כצפוי, קיים קשר חיובי ישיר בין כמות השריר וחלבון המיטוכונדריה הכוללת שהושג.

Discussion

מיטוכונדריה המבודדת לעתים קרובות מנוצלות במחקרים הבוחנים את תפקידה של פונקצית ETC, כמו גם פעילויות אחרות במיטוכונדריה, הכולל טיסת מצע ותפקוד מחזור TCA. מבחני Respirometric באמצעות אברונים מבודדים מאפשרים בדיקה ישירה של תהליכים בסיסיים של זרחון חמצוני ומאפיינים פנימיים של וכו ' פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת בהשוואה לתאים שלמים או סיבי שריר permeabilized יש את היתרונות של פרשנות נתונים קלה יחסית והעדר "הפרעות" מתהליכים או שינויים שאינן המיטוכונדריה במסה / biogenesis המיטוכונדריה. נורמליזציה של הנתונים מבוססת על תכולת חלבון במיטוכונדריה, ובכך לאפשר השוואה צולבת פשוטה של ​​המיטוכונדריה בין דגימות. פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת הוא גישה מועדפת כאשר מטרת המחקר היא לקבוע מנגנוני יסוד וזיהוי מטרות ספציפיות כגון רכיב ETCs / מתחמים, או מנגנוני תחבורה המיטוכונדריה.

תאר הוא פרוטוקול לביופסיה של שריר ובידוד של המיטוכונדריה תפקודית מדגימות רקמה קטנות. שיטה זו מניבה תוצאות לשחזור בין המשתמשים עקב ניצול homogenizer אוטומטי לעומת יד מופעלת homogenizers dounce. בידוד של המיטוכונדריה יכול להתבצע עם קטן כמו 20 מ"ג של רקמת שריר. כמות המיטוכונדריה מבודדת שניתן להשיג מגודל מדגם זה היא מספיק כדי לרוץ respirometry מבוסס צלחת סוסון הים תוך השארת המיטוכונדריה עודפת לניסויים אחרים ואחסון עבור ניתוחים מולקולריים נוספים. ניתן לציין כי שיטה זו יכולה להיות מתורגמת לXF 96, שבו כמויות קטנות עוד יותר של מיטוכונדריה יכולות לשמש (1-2 מיקרוגרם לכל טוב).

כמה פרוטוקולים למיטוכונדריה בידוד להסתמך על homogenizers dounce לשיבוש רקמות ראשוני. חסרון של שיטה זו הוא הידיים על טבעה של הרקמה הראשוניתהומוגניזציה. הכוח והמהירות של העלי בhomogenizer יכולים להשתנות באופן משמעותי בין מפעילי ^6. זה יכול לגרום לוריאצית ניסוי לניסוי, כמו גם וריאציה מעבדה למעבדה, ומוביל לקושי בהשוואת הנתונים בין ניסויים. זה מדאיג במיוחד במחקרי התערבות אנושיים כאשר נתונים ממשתתפים נאספו בנקודות זמן שונות, בדרך כלל לפני ואחרי הטיפול, ובאופן פוטנציאלי באתרים מרובים. אנו משתמשים בhomogenizer אוטומטי לגישה עקבית יותר שמניבה תוצאות לשחזור יותר עם וריאציה אדם לאדם מוגבלת. המהירות של הכנה גם עושה גישה זו מתאימה לטיפול בדגימות מרובות באותו הזמן. בדרך כלל, ניתן לבצע עד שלושה ניסויים ביום אחד.

מגבלות אפשריות של הטכניקה המתוארת כאן נובעות מהשימוש באברונים מבודדים והשימוש בפורמט המבוסס על צלחת. לדוגמא, פיקארד et al. יש לי שדstrated שהמיטוכונדריה מבודדת בעלי מאפיינים פונקציונליים שונים במהותו מאלה של המיטוכונדריה שלמה בmyofibers permeabilized. הם הציעו כי טכניקות בידוד המיטוכונדריה לגרום לתפקוד bioenergetic שהשתנה, כגון RCR גדל באופן משמעותי בהשוואה לmyofibers permeabilized מלווה בייצור מיני חמצן תגובתי יותר ^13. בהשוואה לסיבי שריר permeabilized, בידוד של המיטוכונדריה דורש זמן הכנה ארוך יותר. כמו כן, אובדן התוכן סלולארי מפחית את הרלוונטיות פיסיולוגיות, משהו שנשמר בתאים שלמים וסיבים אפילו permeabilized. השימוש בrespirometry מבוסס צלחת עם היתרי טכניקה המתוארים לשכפל ריצות לדגימה. עם זאת, המיטוכונדריה חייבת לדבוק בתחתית כל הטוב. תצורה זו היא שונה מסביבת הרגילה שלהם ועלולה להשפיע על מאפיינים פונקציונליים. בנוסף, יש לציין כי שימוש בפרוטוקול זה לבידוד המיטוכונדריה יס,דואר עדיין עשוי להיות זיהום מreticulum endoplasmic (ER) בהכנת המיטוכונדריה. הבדלים בזיהום ER עשויים להשפיע על קביעת תוצאות תשואה וההשפעה של המיטוכונדריה.

לסיכום, מחקר זה מציג נתונים המאשרים מיטוכונדריה מבודדת מרקמות באמצעות הליך זה היא פונקציונלי פעילה וניתן להשתמש בם ללימודים / יישומים הדורשים מיטוכונדריה מבודדת באיכות גבוהה מסכום המינימלי של דגימות שרירי שלד. היתרון של שיטה זו הוא ש: i) אפשר לבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד, ii) ההליך הוא מהיר, iii) עם טכנולוגית הצלחת מבוססת, אפשר להריץ דוגמאות רבות באותו הזמן, וiv) יש מספיק רקמה עודפת ומיטוכונדריה המבודדת לאחר assay bioenergetic לאחסון מדגם וחקירות ביולוגיות מולקולריות אחרות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer Bio-Gen PRO200	BioExpress
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Fisher Scientific
Deepwell late Rotor	Fisher Scientific
6 mm University College Hospital Needle	Cadence
60 cc syringe	Fisher Scientific
96-well plate reader	Tecan (Genios-basic)
Seahorse XF 24-3 analyzer	Seahorse Biosciences, Inc.
Protein gel system	Life Technologies (Invitrogen)
Kodak Gel Logic 112	Carestream Health, Inc
Kodak camera assembly	Carestream Health, Inc
Consumables
XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge	Seahorse Bioscience	100850-001
100867-100
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich Co	221473
Hydrochloric acid (HCl)	Acros	12421-0010
Dulbecco's Phosphate buffered saline	Lonza	17-512F
Potassium chloride (KCl)	Fisher Scientific	P333
MOPS	Fisher Scientific	BP308
EDTA	Fisher Scientific	BP118
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich Co	M7506
ATP	Sigma-Aldrich Co	A9187
Fatty acid-free BSA	Calbiochem	126575
Sucrose	Sigma-Aldrich Co	S0389
Bacterial proteinase	Sigma-Aldrich Co	P-8038
D-Mannitol	Sigma-Aldrich Co	M9546
KH2PO4	Fisher Scientific	P284
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich Co	M9272
HEPES	Sigma-Aldrich Co	H3784
EGTA	Sigma-Aldrich Co	E3889
BCA protein assay kit	Sigma-Aldrich Co	PI23227
Succinic Acid*	Sigma-Aldrich Co	S3674
Pyruvic acid*	Sigma-Aldrich Co	P5280
Malic acid*	Sigma-Aldrich Co	2288
ADP(K+ salt)*	Sigma-Aldrich Co	A5285
XF Cell mito stress test kit	Seahorse Biosciences	101706
Tween-20	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-29113
NuPAGE 12% Bis-Tris Gel	Life Technologies (Invitrogen)	NP0343BOX
Immobilin Transfer Membranes (0.45 um)	Millipore	IPVH20200
MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml	Life Technologies (Invitrogen)	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter	Life Technologies (Invitrogen)	NP0006-1
Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)	Abcam	ab14734
Primary antibodies (mAB to GAPDH)	Abcam	ab9484
Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled	PerkinElmer	NEF822E001EA
Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled	PerkinElmer	NEF812E001EA
*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only