דגם Murine של חסימת Ureteric חד-צדדית בלתי הפיכה והפיכה

Summary

The murine model of irreversible unilateral ureteric obstruction (UUO) is presented together with the model of reversible UUO in which the ureteric obstruction is relieved by anastomosis of the severed ureter into the bladder. These models enable the study of renal inflammation and scarring as well as tissue remodeling.

Abstract

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive nephropathy induced by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). In the irreversible UUO model, the ureter may be obstructed for variable periods of time in order to induce increasingly severe renal inflammation and interstitial fibrotic scarring. In the reversible R-UUO model the ureter is obstructed to induce hydronephrosis, tubular dilation and inflammation. After a suitable period of time the ureteric obstruction is then surgically reversed by anastomosis of the severed previously obstructed ureter to the bladder in order to allow complete decompression of the kidney and restoration of urinary flow to the bladder. The irreversible UUO model has been used to investigate various aspects of renal inflammation and scarring including the pathogenesis of disease and the testing of potential anti-inflammatory or anti-fibrotic therapies. The more challenging model of R-UUO has been used by some investigators and does offer significant research potential as it allows the study of inflammatory and immune processes and tissue remodeling in an injured and scarred kidney following the removal of the injurious stimulus. As a result, the R-UUO model offers investigators the opportunity to explore the resolution of kidney inflammation together with key aspects of tissue repair. These experimental models are of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract that requires decompression and are commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may lead to eventual end stage kidney failure.

Introduction

The overall aim of the experimental model described here is to induce obstructive nephropathy by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). A simple irreversible model of UUO is presented in which the left ureter is permanently obstructed by ligation with a suture or by the application of a ligating clip. This results in marked dilatation of the ureter together with reduced renal blood flow and glomerular filtration. Renal histology demonstrates tubular dilatation and increasingly severe interstitial renal inflammation and fibrosis. Irreversible UUO is a useful model and has been adopted by many researchers in the study of both renal inflammation and fibrosis.^1-4 Although the irreversible model of UUO requires some surgical expertise it is relatively straightforward and is often used to seek insights into the pathogenesis of interstitial renal injury and the ensuing fibrosis. Also presented is a less frequently used R-UUO model using a modification of the method originally described by Tapmeier et al.⁵ The R-UUO model has much future potential for the study of inflammatory and immune processes, cellular and tissue regeneration as well as the subsequent tissue remodeling following the removal of an injurious stimulus.

The more challenging R-UUO model has been used by a limited number of investigators with some groups employing a significantly different surgical technique to that described here^6,7 though with interesting results. In the R-UUO model presented, the ureter is ligated to induce complete ureteric obstruction for a period of time sufficient to induce the level of injury and fibrosis desired: 7 days of UUO was chosen in the method described here. The ureteric obstruction is reversed and the kidney is allowed to decompress for a period of time determined by the investigator before the mice are culled and the kidney removed for analysis: 7 days of decompression was chosen in the method described here though a longer period would be chosen if the resolution of inflammation and fibrosis was being studied. Although the method described here requires significant surgical expertise, it offers several advantages over other R-UUO models. The application of soft walled plastic tubing to the obstructed ureter prevents excessive ureteric dilation and this facilitates the subsequent manipulation and anastomosis of the ureter. Furthermore, in the described R-UUO model the ureter is divided thereby allowing the removal of any residual urinary sediment and debris. This confirms that the remaining ureter lumen is de-obstructed and patent prior to anastomosis to the bladder.

Experiments incorporating both the irreversible and reversible UUO models can provide researchers with a powerful insight into the molecular and cellular mechanisms of both injury and subsequent resolution and regeneration. Thus, the model of R-UUO described here would be highly relevant to researchers interested in post-inflammatory tissue remodeling and how this can be modulated.

Protocol

הדרכה כללית: ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ותקנות שהוטלו על ידי בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986. פרוטוקול זה והפרוטוקול הנלווה וידאו עבור שני UUO סטנדרטי וR-UUO, שיכול להתבצע על רבים זני עכבר. בסרטון הנלווה, שני ההליכים מתבצעים על C57BL / 6 עכברי זכרים בגילי 8 שבועות. הנתונים שהוצגו בסעיף תוצאות הנציג התקבלו מFVB / n עכברי זכרים.

הערה: פרוטוקול זה ונלווה פרטי וידאו כיצד לבצע UUO סטנדרטי וR-UUO ניצול השופכן השמאל, לעומת זאת יכול בקלות להיות מיושמת באותה הטכניקה כדי השופכן תקין.

1. הכנת בעלי החיים וlaparotomy

1. לבצע את כל ההליכים עם מכשירים סטריליים (autoclaved) ומתכלים.
2. להזריק קטמין הידרוכלוריד (70mg / kg) וhydrochloride medetomidine (1 מ"ג / קילוגרם) intraperitoneally להרדיםהעכבר. הערה: משך מטוס הרדמה וכתוצאה מכך הוא 4 שעות ולא נדרשת הרדמה משלימה.
3. אשר את עומק ההרדמה על ידי אובדן הרפלקסים למשל, קמצוץ הבוהן.
4. הסר את כל השיער המקיף את אזור החתך ולהכין את עור הבטן לניתוח באמצעות יישום של פתרון chlorhexidine לדלל.
5. הנח את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במצב שכיבה ולתקן את הגפיים לכרית באמצעות סרט דבק נמוך סימון.
6. במהלך ההליך, לפקח על העכבר לסימני כוויות תרמית כתוצאה מהכרית כירורגית המחוממת. אם אפשר להשתמש במקור חום לא חשמלי.
7. לנהל משכך כאבים על ידי הזרקה תת עורית של hydrochloride עצירות (0.06mg / קילוגרם) ולהחיל חומר סיכה העין כדי למנוע התייבשות של קרנית.
8. הפוך laparotomy קו האמצע וחתך של alba linea avascular באמצעות מספריים רקמה מפרידה כדי לקבל גישה לחלל הצפק.
9. לעטוף את העכבר והכנס COLIBRIמפשק לתוך החתך.

חסימת 2. חד-צדדי Ureteric

1. שימוש בניצני כותנה מעוקר לחשוף את השופכן שהותיר עקירת המעיים לכיוון הצד הימני של חלל הבטן ומכסה אותם עם וילונות לחים.
2. בעזרת מלקחיים זווית לבודד ולהרים את השופכן השמאל.
3. כדי ליצור חסימת ureteric, לקשור השופכן שמאל פעמיים עם 6 / O תפר משי שחור קלוע בכל מקום בין שלפוחית ​​השתן ואגן כליה. בניסויים לטווח ארוכים, להשתמש בתפר נספג עבור כל ניתוחי הבטן. לחלופין, קליפ ligating יכול להיות מיושם על השופכן.
4. כדי לבודד את שלפוחית ​​השתן משופכן, לחלק את השופכן בין שני התפרים.
5. להחליף את המעיים בזהירות לתוך חלל הצפק.
6. בצע את השלבים המפורטים בסעיף 4 - שחזור לאחר ניתוח וטיפול כדי לסגור את החתך ולהפוך את ההרדמה.

3. הכנה לReversiblחסימת הדואר חד צדדי Ureteric

1. הכן עכבר לניתוח ולבודד את השופכן השמאל כמפורט בשלבים 1.1-2.2 לעיל.
2. כדי ליצור חסימת ureteric שיכול להיות הפוכה, ולקשור השופכן שמאל פעמיים עם 6 / O תפר משי שחור קלוע קרוב לשלפוחית ​​השתן. השאר קצה אחד של התפר העליון עוד זה ישמש לעגן את צינורות פלסטיק הרכים מוקפי חומה במקום סביב השופכן.
3. הפוך חריץ אורכי באורך 5 מ"מ של צינורות פלסטיק מוקפי חומה רך כזה שניתן פשק אותה פתוח כדי לאפשר לו להיות מיושם בדרכי השתן. כל צינורות פלסטיק סיליקון מוקפי חומה רכה, עם קוטר פנימי של 1 מ"מ וקוטר חיצוני של 2 מ"מ, ניתן להשתמש.
4. מניחים את צינורות פלסטיק מוקפי חומה הרכה בעדינות סביב השופכן. ודא שהתפר הארוך עולה ממרכז החריץ בצינור לאחר שהוא נסגר סביב השופכן.
5. מניחים באורך של 6 / O תפר משי שחור קלוע סביב הצינור המוקף חומה הרכה המקיף את השופכן ולקשורפעם אחת. עכשיו מקום סוף התפר הארוך, מתעורר ממרכז החריץ בצינור, longitudinally פני צינורות כך שהוא נמצא בחלק העליון של התפר קשור בעבר.
6. לקשור את התפר ממוקם סביב הצינור פעמיים כדי לעגן את צינורות וסופו של דבר התפר הארוך במקום סביב השופכן.
   הערה: כדי למנוע היווצרות הידבקות בשופכן וצינורות פלסטיק המוקף חומה הרכה, פתרון הפחתת הידבקות יכול להיות מיושם על האזור סביב הצינור.
7. להחליף את המעיים בזהירות לתוך חלל הצפק.

שחזור 4. לאחר ניתוח וטיפול

1. סגור את הצפק עם שמיכת תפר באמצעות 5 / O תפר משי שחור קלוע ולהתקרב לעור באמצעות קליפים עור מתכתיים.
2. כדי למזער את הסיכון לזיהום לאחר ניתוח, חל כגון חיטוי כתמיסת יוד / אלכוהול לעור הבטן.
3. חלקית הרדמה הפוכה עם hydrochloride atipamezole (2 מ"ג / קילוגרם) תת עורי.
4. לנהל נוזלים על ידי הזרקה תת עורית של 1 מיליליטר חימם מלוח.
5. לפקח על העכבר עד שהוא חזר להכרתו.
6. אפשר העכבר כדי להתאושש בקופסא מחוממת שמרה על 29 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. יכול להיות גם סיפק מזון טבול לעודד צריכת נוזלים ותזונה.
7. השאר את העכבר כדי להתאושש כדי לגרום לרמה רצויה של חסימה, בדרך כלל 7 ימים.
8. בניסויים התאוששות לטווח ארוך, לספק משככי כאבים מתמשכים. אם העכבר הוא להיות התאושש למשך זמן ארוך יותר מ -7 ימים, להסיר את סרטוני עור 7 ימים לאחר ניתוח.
9. ברגע שהרמה הרצויה של חסימה כבר מושרה, או להפוך את UUO, כפי שיתואר להלן, או להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ולאסוף את הכליות לניתוח histopathology.

חסימת 5. הפיך חד צדדי Ureteric

1. כדי לבצע R-UUO להכין עכבר, שעבר הכנה לR-UUO, לניתוח כפי שמתואר בשלבים 10.1-1.7.
2. אם הווה, להסיר את סרטוני העור ולחלק או להסיר את התפרים בהצפק כדי לקבל גישה לחלל הבטן. הערה: אם השופכן כבר חסום לקטעי עור ניסוי ארוך טווח צריך להיות מודח 7 ימים לאחר יישום.
3. הכן את העכבר ולבודד את השופכן השמאלי כמתואר בשלבים 1.8-2.2.
4. בעזרת מלקחיים זווית, לשחרר את צינורות פלסטיק הרכים מוקפי חומה מכל רקמת granulomatous שאולי נוצרה.
5. חותך את התפר מחזיק צינורות הפלסטיק סביב השופכן החסום עם אזמל ולהסיר את הצינור.
6. לאשר UUO המוצלח על ידי הערכה לנוכחות של הידרונפרוזיס בכליה השמאלית, הכליות אמורות להופיע חיוורות גם.
7. מחלקים את השופכן בין התפרים.
8. הנח את האורך הנותר של השופכן, שצורף לכליות, על פיסה קטנה של גזה סטרילית. זה ישמש כדי לאסוף את משקעי השתן ותאים מתים שיהיה לנקז מהשופכןnd אגן כליה אחת התפר הוסר.
9. מחלקים את השופכן לעיל, אך קרוב, התפר ולאפשר הכליות לניקוז על גבי הגזה. השאר את התפר התחתון, קרוב לשלפוחית ​​השתן, ללא פגע. זו היא להבטיח כי לא שתן ידלוף משלפוחית ​​השתן ולתוך חלל הצפק.
10. ברגע שהשופכן ואגן כליה כבר סחוט, להחיל תפר משי ארוך 6 / O שחור קלוע לסוף האורך הנותר של השופכן. זה ישמש כדי לסייע לשופכן להשקת שלפוחית ​​השתן שבוצעה מאוחר יותר.
11. בצע את השלבים הבאים לanastomose האורך הנותר של השופכן לתוך שלפוחית ​​השתן:
    1. הפעל השופכן כך שהוא נמצא קדמי למקומו המקורי ושקרים על הכליות.
    2. מניחים תפר Tacking יחיד 9 / O monofilament פוליאמיד 2 מ"מ מהקצה של השופכן כך שהוא עולה לכיוון שלפוחית ​​השתן. תשמור על מנת להבטיח שהתפר נשאר במעיל שרירי ולא להיכנס ללום שופכן. Wil תפר Tackingl לשמש כדי לעגן את השופכן בשלפוחית ​​השתן.
    3. ליצירת ערוץ דרך שלפוחית ​​השתן, לעבור מחט 21G באלכסון דרך שלפוחית ​​השתן כך שעם יציאתו לכיוון הקדמי הקיר (הגחון) של שלפוחית ​​השתן.
    4. לנוח מחט עיניים בשיפוע של מחט 21G. השתמש במחט 21G כדי להנחות את מחט העיניים דרך שלפוחית ​​השתן. מחט העיניים תשמש לקחת השופכן דרך שלפוחית ​​השתן.
    5. לעבור תפר Tacking 9 / O, שהוחל על שופכן בשלב 5.11.2, דרך החתך הראשון בשלפוחית ​​השתן והחוצה דרך קיר שלפוחית ​​השתן הסמוך לנקודת הכניסה. ברגע שהשופכן עובר דרך שלפוחית ​​השתן זה יהיה קשור לעגן את השופכן לשלפוחית ​​השתן.
    6. הנח את התפר הארוך 6 / O שחור קלוע המשי להחיל את הסוף של השופכן בשלב 5.10 דרך מחט העיניים.
    7. לסגת בזהירות את מחט העיניים מחוץ לשלפוחית ​​תוך הבטחה שהשופכן גם משך דרך שלפוחית ​​השתן.
    8. ברגע שהשופכן עולה מהשלפוחית ​​השתן דואר להוציא את מחט העיניים ולהחיל מהדק לתפר הארוך בסוף השופכן כדי למנוע נסיגה לאחור לתוך שלפוחית ​​השתן.
    9. לעגן את השופכן בתוך מקום בשלפוחית ​​השתן, לקשור את תפר נקודת סימון monofilament 9 / O פוליאמיד, הוחל בשלב 5.11.5.
    10. החל תפרי יחיד נוספים 9 פוליאמיד / O עניבת monofilament כמתואר בשלבים 5.11.2 ו5.11.5 בשני מקומות סביב נקודת הכניסה לעגן את השופכן בשלפוחית ​​השתן בתקיפות.
    11. שימוש בחלק האחורי של מספריים נפתחו, לדחוף את קיר שלפוחית ​​השתן מעט לאחור כדי לחשוף יותר של השופכן המתהווה.
    12. מחלקים את השופכן מעל התפר הארוך ממוקם בקצה של השופכן. שופכן צריכה לחזור לגוף של שלפוחית ​​השתן. זה רגיל להתבונן שתן זורם מתוך הפתח בשלפוחית ​​השתן, המאשר את לומן הפתוח של השופכן.
    13. סגור את פצע היציאה בשלפוחית ​​השתן עם תפר monofilament פוליאמיד 9 / O.
12. בזהירות להחליף את המעיים לחלל הצפק.
13. לספק טיפול שלאחר ניתוח, כמפורט בצעדים 4.1-4.8.
14. אפשר העכבר כדי להתאושש עד הכליה ביטול דחיסת, בדרך כלל 7 ימים.
15. בנקודת סיום הניסוי, להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ולאסוף את הכליות לניתוח histopathological.

תוצאות

המראה של השינויים בכליות במידה ניכר בעקבות חסימת ureteric והוא הופך להיות חיוור ומתוח למישוש עם זמן (איור 1). יש הרחבה הולכת וגדל של הפרוקסימלי שופכן לחסימה ואגן הכליה. הכליות הופכת יותר ויותר מכולה כמשך עליות נפרופתיה חסימתית עם חסימה ממושכת וכתוצאה מכך דילול נ?...

Discussion

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. The R-UUO model is of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract secondary to prostatic hypertrophy, posterior urethral valves etc. that requires decompression with patients commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may eventually lead to end stage kidney disease.^8,9 The models detailed here enable ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14072-10
Spring Scissors – straight	Fine Science Tools	15000-10
Toothed forceps	Fine Science Tools	11021-12
Angled forceps x 2	Fine Science Tools	00649-11
Straight forceps	Fine Science Tools	00632-11
Colibri 3 cm wire retractor	Fine Science Tools	17000-03
Castroviejo needle holder with lock	Fine Science Tools	12565-14
Wound clip applicator	Fine Science Tools	12031-07
7 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-07
Castroviejo micro needle holder with lock	Fine Science Tools	12060-01
OPMI pico microscope	Carl Zeiss	S100
Heat electronic pad	Cozee Comfort	n/a
6/O silk braided suture	Harvard Apparatus	72-3287
9/O Dafilon (polyamide) suture	B-Braun	G1111434
5/O braided silk suture	Harvard Apparatus	51-7680
Regular bevel needle, 1 inch, 21G	Becton, Dickinson and Company	305175
1 ml syringe slip tip	Becton, Dickinson and Company	300184
Wypall paper swabs	Kimberley-Clark	L40	Sterilised (Autoclave)
Cotton wool buds	Johnson and Johnson	n/a	Sterilised (Autoclave)
Plain drapes	Guardian	CB03	Sterilised (Autoclave)
Soft wall silicone rubber tubing			Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml solution
(Domitor) Medetomidine hydrochloride	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0.3mg/ml
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml
(Adept) 4% Icodextrin	Baxter		Adhesion reduction solution
NaCl 0.9%	Baxter	FKE1323