돌이킬 수 및 가역 일방적 Ureteric 폐색의 쥐 모델

요약

The murine model of irreversible unilateral ureteric obstruction (UUO) is presented together with the model of reversible UUO in which the ureteric obstruction is relieved by anastomosis of the severed ureter into the bladder. These models enable the study of renal inflammation and scarring as well as tissue remodeling.

초록

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive nephropathy induced by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). In the irreversible UUO model, the ureter may be obstructed for variable periods of time in order to induce increasingly severe renal inflammation and interstitial fibrotic scarring. In the reversible R-UUO model the ureter is obstructed to induce hydronephrosis, tubular dilation and inflammation. After a suitable period of time the ureteric obstruction is then surgically reversed by anastomosis of the severed previously obstructed ureter to the bladder in order to allow complete decompression of the kidney and restoration of urinary flow to the bladder. The irreversible UUO model has been used to investigate various aspects of renal inflammation and scarring including the pathogenesis of disease and the testing of potential anti-inflammatory or anti-fibrotic therapies. The more challenging model of R-UUO has been used by some investigators and does offer significant research potential as it allows the study of inflammatory and immune processes and tissue remodeling in an injured and scarred kidney following the removal of the injurious stimulus. As a result, the R-UUO model offers investigators the opportunity to explore the resolution of kidney inflammation together with key aspects of tissue repair. These experimental models are of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract that requires decompression and are commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may lead to eventual end stage kidney failure.

서문

The overall aim of the experimental model described here is to induce obstructive nephropathy by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). A simple irreversible model of UUO is presented in which the left ureter is permanently obstructed by ligation with a suture or by the application of a ligating clip. This results in marked dilatation of the ureter together with reduced renal blood flow and glomerular filtration. Renal histology demonstrates tubular dilatation and increasingly severe interstitial renal inflammation and fibrosis. Irreversible UUO is a useful model and has been adopted by many researchers in the study of both renal inflammation and fibrosis.^1-4 Although the irreversible model of UUO requires some surgical expertise it is relatively straightforward and is often used to seek insights into the pathogenesis of interstitial renal injury and the ensuing fibrosis. Also presented is a less frequently used R-UUO model using a modification of the method originally described by Tapmeier et al.⁵ The R-UUO model has much future potential for the study of inflammatory and immune processes, cellular and tissue regeneration as well as the subsequent tissue remodeling following the removal of an injurious stimulus.

The more challenging R-UUO model has been used by a limited number of investigators with some groups employing a significantly different surgical technique to that described here^6,7 though with interesting results. In the R-UUO model presented, the ureter is ligated to induce complete ureteric obstruction for a period of time sufficient to induce the level of injury and fibrosis desired: 7 days of UUO was chosen in the method described here. The ureteric obstruction is reversed and the kidney is allowed to decompress for a period of time determined by the investigator before the mice are culled and the kidney removed for analysis: 7 days of decompression was chosen in the method described here though a longer period would be chosen if the resolution of inflammation and fibrosis was being studied. Although the method described here requires significant surgical expertise, it offers several advantages over other R-UUO models. The application of soft walled plastic tubing to the obstructed ureter prevents excessive ureteric dilation and this facilitates the subsequent manipulation and anastomosis of the ureter. Furthermore, in the described R-UUO model the ureter is divided thereby allowing the removal of any residual urinary sediment and debris. This confirms that the remaining ureter lumen is de-obstructed and patent prior to anastomosis to the bladder.

Experiments incorporating both the irreversible and reversible UUO models can provide researchers with a powerful insight into the molecular and cellular mechanisms of both injury and subsequent resolution and regeneration. Thus, the model of R-UUO described here would be highly relevant to researchers interested in post-inflammatory tissue remodeling and how this can be modulated.

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프로토콜

일반 지침 : 동물 실험은 동물에 의해 부과 된 지침과 규정에 따라 (과학적 절차) 법 1986이 프로토콜 많은에서 수행 할 수있는 동반 비디오 프로토콜 표준 UUO 및 R-UUO 모두이며, 수행되었다 마우스 균주. 첨부 된 비디오에서 두 절차는 남성 C57BL / 6 마​​우스 세 팔주에서 수행됩니다. 대표적인 결과 섹션에 제시된 데이터는 남성 FVB / N 마우스로부터 얻었다.

주 :이 프로토콜 및 표준 방법을 수행 UUO R-UUO 왼쪽 요관을 이용하여 비디오 정보를 수반하지만 동일한 기술을 쉽게 오른쪽 요관에 적용될 수있다.

1. 동물 준비 및 개복술

1. 살균 (멸균) 장비 및 소모품 모든 절차를 수행합니다.
2. 마취 복강 케타민 염산염 (70 ㎎ / kg) 및 medetomidine 염산염 (1 ㎎ / kg)을 주사마우스. 참고 : 결과 마취 평면의 지속 시간은 4 시간이며, 더 추가 마취가 필요하지 않습니다.
3. 반사 예를 들어, 발가락 핀치의 손실에 의한 마취의 깊이를 확인합니다.
4. 절개 주변 지역 모든 머리를 제거하고 희석 클로르헥시딘 솔루션의 응용 프로그램을 통해 수술을 위해 복부 피부를 준비합니다.
5. 앙와위에서 가열 수술 패드에 마우스를 놓고 낮은 압정 접착 테이프를 사용하여 패드에 사지를 고정합니다.
6. 절차 동안 가열 패드 수술의 결과로서 열 화상 흔적 마우스를 모니터링. 가능하면 비 전기 열원을 사용한다.
7. 부 프레 노르 핀 염산염 (내지 0.06 ㎎ / kg)의 피하 주사에 의해 진통을 관리하고 각막 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 적용합니다.
8. 정중선 개복 및 복강에 접근하기 위해 조직 분리 가위를 사용하여 무 혈관의 백선 알바의 절개를.
9. 마우스를 올려 놓와 콜리 브리를 삽입절개에 트랙터.

2. 일방적 Ureteric의 방해

1. 멸균 면봉을 사용하여 복강의 오른쪽으로 장을 변위에 의해 왼쪽 요관을 노출하고 젖은 커튼로 커버.
2. 각도 집게 격리하고 왼쪽 요관을 들어 올려 사용.
3. ureteric 방해를 만들려면 아무 곳이나 방광 및 신장 골반 사이의 6 / O 검은 꼰 실크 봉합사로 두 번 왼쪽 요관을 결찰. 장기 실험을 위해, 모든 복부 수술에 대한 흡수성 봉합사를 사용합니다. 대안 적으로, 결찰 클립 요관에 적용될 수있다.
4. 방광 요관으로부터 격리하기 위해 두 요관 봉합 사이를 나눈다.
5. 조심스럽게 복강에 장을 교체합니다.
6. 4 절에 나와있는 단계를 수행 - 수술 후 회복 및 관리는 절개를 닫고 마취를 반전 할 수 있습니다.

Reversibl 3. 준비전자 일방적 Ureteric의 방해

1. 수술 마우스를 준비하고 단계 위의 1.1-2.2에서 설명하는대로 왼쪽 요관을 격리 할 것.
2. 반전 될 수있는 ureteric 방해를 만들려면, 방광에 가까운 6 / O 검은 꼰 실크 봉합사로 두 번 왼쪽 요관을 결찰. 이는 요관 주위 장소에 부드러운 벽 플라스틱 튜브를 고정하는 데 사용되는만큼 상부 봉합사의 한쪽 끝을 남겨주세요.
3. 그것은 그것이 요관에인가 될 수 있도록 오픈 스플레이 될 수 있도록 부드러운 벽의 플라스틱 튜브의 길이 5mm의 길이 방향 슬릿을 확인. 1mm와 2mm의 외경 내경 상관 벽으로 부드러운 실리콘 플라스틱 튜브가 사용될 수있다.
4. 요관 주위에 부드럽게 부드러운 벽 플라스틱 튜브를 놓습니다. 이 요관 주위를 닫으면 긴 봉합 튜브의 슬릿의 중심에서 나온다 있는지 확인합니다.
5. 요관을 둘러싸는 부드러운 벽으로 둘러싸인 튜브 주위에 6 / O 검은 꼰 실크 봉합사의 길이를 놓고 넥타이한 번. 이제 길이 방향으로는 이전에 묶여 봉합 위에 놓여 있도록 튜브를 통해, 튜브의 슬릿의 중심에서 신흥, 봉합의 긴 끝을 배치합니다.
6. 튜브 및 요관 주위 장소에 긴 봉합 끝을 고정 두 번 튜브 주위에있는 봉합사를 묶어.
   주 : 요관 및 연질 플라스틱 배관 벽에 유착 형성을 방지하기 위해 접착 환원 액 배관 주변에 적용될 수있다.
7. 조심스럽게 복강에 장을 교체합니다.

4. 수술 후 복구 및 관리

1. 5 / O 검은 꼰 실크 봉합사를 사용하여 블랭킷 스티치와 복막을 닫고 금속 피부 클립을 사용하여 피부에 근접.
2. 수술 후 감염의 위험을 최소화하기 위해, 복부 피부에 요오드 / 알코올 용액으로서 방부제 등을 적용한다.
3. 피하 atipamezole 염산염 (2 ㎎ / kg)와 부분적으로 반대 마취.
4. 1 ml의 피하 주사에 의해 유체를 관리 식염수를 따뜻하게.
5. 이 의식을 회복 할 때까지 마우스를 모니터링합니다.
6. 마우스가 24 시간 동안 29 ° C로 유지 가열 상자에 복구 할 수 있습니다. 적신 음식은 유체 및 영양 섭취를 장려하기 위해 제공 될 수있다.
7. 장애물이 원하는 수준의, 일반적으로 7 일 유도하기 위해 복구하기 위해 마우스를 둡니다.
8. 장기적 회복 실험에 지속적인 진통제를 제공한다. 마우스를 7 일 이상을 위해 회수 될 경우, 피부 클립을 수술 후 7 일 제거.
9. 폐색 원하는 레벨이 유도되면, 하나 후술하는 바와 같이, 역방향 UUO, 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사 조직 병리학 분석 신장을 모은다.

5 가역 일방적 Ureteric의 방해

1. 단계에 설명 된대로 R-UUO가 수술을 위해, R-UUO을위한 준비를 마쳤습니다 마우스를 준비 수행하려면 10.1-1.7.
2. 존재하는 경우, 피부 클립을 제거하고 분할 또는 복강에 접근하기 복막에 봉합사를 제거한다. 주 :이 요관 장기 실험 피부 클립 방해 되었다면 응용 다음 7 일 제거 된 것이다.
3. 마우스를 준비 단계 1.8-2.2에서 설명한 바와 같이 왼쪽 요관을 격리.
4. 각도 집게를 사용하여 형성 할 수있는 모든 육아 종성 조직에서 부드러운 벽 플라스틱 튜브를 무료.
5. 메스 차단 된 요관 주위의 플라스틱 튜브를 들고 봉합을 잘라 튜브를 제거합니다.
6. 왼쪽 신장에 수신증의 존재를 평가하여 성공적인 UUO을 확인, 신장은 창백 나타납니다.
7. 봉합 사이의 요관을 나눈다.
8. 멸균 거즈의 작은 조각에 부착 신장 수뇨관의 나머지 길이를 놓는다. 이것은 수뇨관에서 소모 시키게 뇨 침전물과 사균을 수집하는 데 사용할차 봉합 한 번 신우가 제거됩니다.
9. 위의 요관을 분할하지만, 근처, 봉합사와는 신장이 거즈에 배출 할 수 있습니다. 방광에 가장 가까운 그대로, 낮은 봉합을 남겨주세요. 이은 소변이 방광과 복강으로 누출 없다는 것을 확인하는 것입니다.
10. 요관과 신우가 배출되고 나면, 요관의 남은 길이의 끝에 긴 6 / O 검은 꼰 실크 봉합사를 적용합니다. 이것은 나중에 수행 방광 문합에 요관을 돕기 위해 사용됩니다.
11. 방광 요관의 나머지 길이를 문합 아래 단계에 따라 :
    1. 그것의 원래 위치로 전방을 거짓말과 신장을 통해 거짓말을하도록 요관 돌립니다.
    2. 그것이 방광의 방향으로 나온다되도록 요관의 단부로부터 하나의 8 / O 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사를 점착 2mm를 놓는다. 봉합사는 근육 코트에 남아 있고 요관 루멘를 입력하지 않도록주의하십시오. 시침 봉합 줘야L은 방광 요관을 고정하기 위해 사용될 수.
    3. 방광을 통해 채널을 생성하기 위해서는 방광의 정면 (복부) 벽쪽으로 종료하도록 방광을 통해 대각선으로 21G 바늘을 전달합니다.
    4. 21G 바늘의 경사에 눈 바늘을 휴식. 방광을 통해 눈의 바늘을 안내하는 21G 바늘을 사용합니다. 눈 바늘은 방광을 통해 요관을 위해 사용됩니다.
    5. 9 / O 시침 봉합사를 통과, 방광에서 밖으로 엔트리 포인트에 인접한 방광 벽을 통해 첫 절개를 통해, 단계 5.11.2에서 요관에 적용. 방광 요관이 통과되면 이는 방광 요관 앵커에 연결된다.
    6. 눈 바늘을 통해 단계 5.10에서 요관의 끝 부분에 적용되는 긴 6 / O 검은 꼰 실크 봉합사를 놓습니다.
    7. 조심스럽게 요관도 방광을 당겨을 보장하는 동안 방광 밖으로 눈 바늘을 철회.
    8. 요관은 일에서 나온다되면전자 블래 눈동자 바늘을 제거하고 다시 방광 수축을 방지 요관의 끝에 긴 봉합 클램프를 적용.
    9. 방광의 장소에서 요관을 고정하려면 단계 5.11.5에 적용되는 9 / O 폴리 아미드 모노 필라멘트 압정 봉합을, 넥타이.
    10. 단단히 방광 내 요관을 고정하기 위해 진입 점을 중심으로 두 위치에서 단계 5.11.2 및 5.11.5에 설명 된대로 추가 한 9 / O 폴리 아미드 모노 필라멘트 타이 봉합을 적용합니다.
    11. 열이 위의 뒷면을 사용하여 응급 요관의 더 많은 노출을 뒤로 살짝 방광 벽에 ​​밀어 넣습니다.
    12. 요관의 끝에있는 긴 봉합 위의 요관을 나눈다. 요관 방광의 몸으로 철회해야한다. 이 요관의 오픈 루멘을 확인, 방광의 구멍에서 흐르는 소변을 관찰하는 것이 일반적이다.
    13. 9 / O 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사 방광에 상처 출구를 닫습니다.
12. 조심스럽게에 장을 교체복강.
13. 단계 4.1-4.8에서 설명하는대로 수술 후 치료를 제공합니다.
14. 신장이 칠일 일반적으로 압축이 해제 될 때까지 마우스를 복구 할 수 있습니다.
15. 실험 종료 시점에서, 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사 및 조직 병리학 적 분석을 위해 신장을 모은다.

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결과

신장의 모양이 변경 현저 ureteric 폐쇄를 다음과는 창백한와 시간 촉진에 시제 (그림 1)가된다. 장애물과 신우 요관의 근위부의 증가 팽창이있다. 신장은 신장 피질과 수질의 현저한 얇아 결과 연장 방해 폐쇄성 신증 증가의 지속 시간으로 점점 위축된다. ureteric 폐색의 반전에 따라, 신장의 색 혈류 증가 및 조직 부종 해소 할 어두워진다. 그들은 연장 팽만의 기간 (그림 1)의 결과로 약?...

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토론

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. The R-UUO model is of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract secondary to prostatic hypertrophy, posterior urethral valves etc. that requires decompression with patients commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may eventually lead to end stage kidney disease.^8,9 The models detailed here enable ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14072-10
Spring Scissors – straight	Fine Science Tools	15000-10
Toothed forceps	Fine Science Tools	11021-12
Angled forceps x 2	Fine Science Tools	00649-11
Straight forceps	Fine Science Tools	00632-11
Colibri 3 cm wire retractor	Fine Science Tools	17000-03
Castroviejo needle holder with lock	Fine Science Tools	12565-14
Wound clip applicator	Fine Science Tools	12031-07
7 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-07
Castroviejo micro needle holder with lock	Fine Science Tools	12060-01
OPMI pico microscope	Carl Zeiss	S100
Heat electronic pad	Cozee Comfort	n/a
6/O silk braided suture	Harvard Apparatus	72-3287
9/O Dafilon (polyamide) suture	B-Braun	G1111434
5/O braided silk suture	Harvard Apparatus	51-7680
Regular bevel needle, 1 inch, 21G	Becton, Dickinson and Company	305175
1 ml syringe slip tip	Becton, Dickinson and Company	300184
Wypall paper swabs	Kimberley-Clark	L40	Sterilised (Autoclave)
Cotton wool buds	Johnson and Johnson	n/a	Sterilised (Autoclave)
Plain drapes	Guardian	CB03	Sterilised (Autoclave)
Soft wall silicone rubber tubing			Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml solution
(Domitor) Medetomidine hydrochloride	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0.3mg/ml
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml
(Adept) 4% Icodextrin	Baxter		Adhesion reduction solution
NaCl 0.9%	Baxter	FKE1323