不可逆とリバーシブル片側尿管閉塞のマウスモデル

要約

The murine model of irreversible unilateral ureteric obstruction (UUO) is presented together with the model of reversible UUO in which the ureteric obstruction is relieved by anastomosis of the severed ureter into the bladder. These models enable the study of renal inflammation and scarring as well as tissue remodeling.

要約

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive nephropathy induced by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). In the irreversible UUO model, the ureter may be obstructed for variable periods of time in order to induce increasingly severe renal inflammation and interstitial fibrotic scarring. In the reversible R-UUO model the ureter is obstructed to induce hydronephrosis, tubular dilation and inflammation. After a suitable period of time the ureteric obstruction is then surgically reversed by anastomosis of the severed previously obstructed ureter to the bladder in order to allow complete decompression of the kidney and restoration of urinary flow to the bladder. The irreversible UUO model has been used to investigate various aspects of renal inflammation and scarring including the pathogenesis of disease and the testing of potential anti-inflammatory or anti-fibrotic therapies. The more challenging model of R-UUO has been used by some investigators and does offer significant research potential as it allows the study of inflammatory and immune processes and tissue remodeling in an injured and scarred kidney following the removal of the injurious stimulus. As a result, the R-UUO model offers investigators the opportunity to explore the resolution of kidney inflammation together with key aspects of tissue repair. These experimental models are of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract that requires decompression and are commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may lead to eventual end stage kidney failure.

概要

The overall aim of the experimental model described here is to induce obstructive nephropathy by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). A simple irreversible model of UUO is presented in which the left ureter is permanently obstructed by ligation with a suture or by the application of a ligating clip. This results in marked dilatation of the ureter together with reduced renal blood flow and glomerular filtration. Renal histology demonstrates tubular dilatation and increasingly severe interstitial renal inflammation and fibrosis. Irreversible UUO is a useful model and has been adopted by many researchers in the study of both renal inflammation and fibrosis.^1-4 Although the irreversible model of UUO requires some surgical expertise it is relatively straightforward and is often used to seek insights into the pathogenesis of interstitial renal injury and the ensuing fibrosis. Also presented is a less frequently used R-UUO model using a modification of the method originally described by Tapmeier et al.⁵ The R-UUO model has much future potential for the study of inflammatory and immune processes, cellular and tissue regeneration as well as the subsequent tissue remodeling following the removal of an injurious stimulus.

The more challenging R-UUO model has been used by a limited number of investigators with some groups employing a significantly different surgical technique to that described here^6,7 though with interesting results. In the R-UUO model presented, the ureter is ligated to induce complete ureteric obstruction for a period of time sufficient to induce the level of injury and fibrosis desired: 7 days of UUO was chosen in the method described here. The ureteric obstruction is reversed and the kidney is allowed to decompress for a period of time determined by the investigator before the mice are culled and the kidney removed for analysis: 7 days of decompression was chosen in the method described here though a longer period would be chosen if the resolution of inflammation and fibrosis was being studied. Although the method described here requires significant surgical expertise, it offers several advantages over other R-UUO models. The application of soft walled plastic tubing to the obstructed ureter prevents excessive ureteric dilation and this facilitates the subsequent manipulation and anastomosis of the ureter. Furthermore, in the described R-UUO model the ureter is divided thereby allowing the removal of any residual urinary sediment and debris. This confirms that the remaining ureter lumen is de-obstructed and patent prior to anastomosis to the bladder.

Experiments incorporating both the irreversible and reversible UUO models can provide researchers with a powerful insight into the molecular and cellular mechanisms of both injury and subsequent resolution and regeneration. Thus, the model of R-UUO described here would be highly relevant to researchers interested in post-inflammatory tissue remodeling and how this can be modulated.

プロトコル

一般的なガイダンス：動物実験は、動物によって課せられたガイドラインおよび規則に従って（科学的処置）法1986このプロトコルと多くの上で実行することができます付属のビデオプロトコル標準UUOとR-UUO両方のためのもの、で行ったマウス系統。添付のビデオでは、両方の手順は、8週齢のオスのC57BL / 6マウスで実行されます。代表的な結果のセクションで提示されたデータは、オスのFVB / Nマウスから得た。

注：このプロトコルは、左尿管を利用して、標準的なUUO及びR-UUOを実行する方法ビデオの詳細を伴うが、しかし、同じ技術を容易に右尿管にも適用することができる。

1.動物の準備および開腹

1. 無菌（オートクレーブ処理）楽器や消耗品を持つすべての手順を実行します。
2. 麻酔腹腔内に塩酸ケタミン（70mgの/ kg）及びメデトミジン塩酸塩（1mgの/ kg）を注入マウス。注意：結果の麻酔薬平面の持続時間は4時間で、全く補足麻酔は必要ありません。
3. 反射神経例えば、つま先のピンチの損失によって麻酔の深さを確認してください。
4. 切開領域周辺の毛を削除し、希薄クロルヘキシジン溶液の適用を介して手術のために腹部の皮膚を準備します。
5. 仰臥位で加熱された外科パッドの上にマウスを置き、低粘着性接着テープを使用してパッドに手足を固定する。
6. 手順の間に、加熱された手術用パッドの結果として、熱傷の兆候がないマウスを監視します。可能であれば、非電気的熱源を使用しています。
7. 塩酸ブプレノルフィン（0.06mg / kg）を皮下注射によって鎮痛を投与し、角膜の乾燥を防ぐために、眼の潤滑剤を適用する。
8. 正中開腹と腹腔へのアクセスを得るために組織分離ハサミを使って無血管白線の切開を行います。
9. マウスをドレープコリブリを挿入切開に開創。

2.片側尿管閉塞

1. 滅菌綿棒を使用すると、腹腔の右側に向かって腸を移動させることによって、左尿管を露出し、湿らせたドレープでそれらをカバーしています。
2. 角度付き鉗子を使用すると、隔離し、左尿管を持ち上げます。
3. 尿管閉塞を作成するには、どこにでも膀胱と腎盂の間に6 / O黒編組絹縫合糸で二回、左尿管を結紮。長期実験のために、すべての腹部の手術のために吸収性縫合糸を使用しています。あるいは、結紮クリップは、尿管にも適用することができる。
4. 尿管から膀胱を単離するために、2本の縫合糸の間に尿管を分割。
5. 慎重に腹腔内に腸を交換してください。
6. 第4節に記載されている手順に従ってください - 術後の回復とケア切開を閉じ、麻酔を逆にする。

Reversibl 3.準備E片側尿管閉塞

1. 手術のためにマウスを準備し、上記の手順1.1から2.2で詳述するように、左尿管を隔離する。
2. 逆にすることができる尿管閉塞を作成するには、膀胱に近い6 / O黒編組絹縫合糸で二回、左尿管を結紮。これは尿管の周りの場所に柔らかい壁のプラスチックチューブを固定するために使用されるように、長いアッパー縫合糸の一端を残します。
3. それは尿管に適用されるように開放スプレイすることができるように柔らかい肉プ​​ラスチック管5mmの長さの縦方向のスリットを作る。 1ミリメートルと2ミリメートルの外径の内径を有する任意の柔らかい壁シリコーンプラスチック管を使用することができる。
4. 尿管の周りに優しく柔らかい壁のプラスチックチューブを置きます。それは尿管の周りに閉鎖された後、長い縫合糸は、チューブのスリットの中心から出ていることを確認してください。
5. 尿管を囲む柔らかい肉の管の周りに6 / O黒編み絹縫合糸の長さを置き、ネクタイ一回。今、縦方向にそれが以前に結ばれた縫合糸の上に位置するように、管全体に、チューブのスリットの中央から出てくる、縫合糸の長い方の端を置く。
6. チューブおよび尿管の周りの場所で長い縫合糸端を固定する二回のチューブの周囲に位置する縫合糸を結ぶ。
   注：尿管およびソフト薄肉プラスチックチューブ上の癒着形成を防止するために、接着還元溶液は、チューブの周りの領域に適用することができる。
7. 慎重に腹腔内に腸を交換してください。

4.術後の回復とケア

1. 5 / O黒編み絹縫合糸を使用したブランケットステッチで腹膜を閉じて、金属製の皮膚クリップを使用して皮膚に近似している。
2. 術後感染のリスクを最小限にするために、そのような腹部の皮膚にヨウ素/アルコール溶液のような防腐剤を加える。
3. 部分的に皮下アチパメゾール塩酸塩（2mgの/ kg）で麻酔を逆転。
4. 1mlを皮下注射することにより、流体を投与は、生理食塩水を温めた。
5. それが意識を回復するまでマウスを監視します。
6. マウスは24時間29℃に保たれ、加熱ボックスに回復することを許可します。湿らせた食品は、流体および栄養摂取を促進するために提供することができる。
7. 通常は7日、障害物の所望のレベルを誘導するために回復するマウスのままにしておきます。
8. 長期的な回復実験のために、継続的な鎮痛を提供する。マウスよりも長い7日間回復される場合、皮膚クリップを手術後7日を削除します。
9. 閉塞の所望のレベルが誘発された後、いずれかの以下に説明するように、UUOを逆転、または頸椎脱臼によってマウスを安楽死させると組織病理学分析のために腎臓を収集する。

5.リバーシブル片側尿管閉塞

1. R-UUOを実行するには、手順で説明するように手術のために、R-UUOのための準備が行われたマウスを、準備10.1から1.7。
2. 存在する場合、皮膚クリップを削除して、腹腔へのアクセスを得るために腹膜に縫合糸を分割または削除。注：尿管は、長期実験皮膚クリップの妨げされている場合は、アプリケーション以下の7日間を除去されている必要があります。
3. マウスを準備し、ステップ1.8から2.2で説明したように、左尿管を隔離する。
4. 角度付き鉗子を使用して、形成された可能性の肉芽腫組織から柔らかい壁のプラスチックチューブを解放する。
5. メスで閉塞尿管の周りにプラスチックチューブを保持している縫合糸を切り、チューブを外す。
6. 左の腎臓における水腎症の存在を評価することによって成功したUUOを確認し、腎臓にも淡い表示されます。
7. 縫合糸の間に尿管を分割します。
8. 滅菌ガーゼの小片に、腎臓に付着し、尿管の残りの長さを置きます。これは尿管aから排出されます尿沈渣と死細胞を収集するために使用されますND腎盂縫合糸が除去されると。
9. 上記の尿管を分割したが、近くに、縫合糸と腎臓は、ガーゼの上に排出させる。膀胱に最も近い、そのまま、下縫合のままにしておきます。これは、尿が膀胱から腹腔に漏れないことを確実にすることである。
10. 尿管と腎盂が排出されると、尿管の残りの長さの最後に長い6 / O黒編組絹縫合糸を適用する。これは、後の膀胱尿管吻合部を補助するために使用される。
11. 膀胱に尿管の残りの長さを吻合するには、以下の手順に従ってください。
    1. それは元の位置の前方に位置し、腎臓の上に位置するように尿管を回します。
    2. それは膀胱の方向に出てくるような尿管の端から縫合糸2ミリメートルをタッキングシングル9 / Oポリアミドモノフィラメントを置きます。縫合糸が筋層に残り、尿管の内腔に入らないように注意してください。タッキング縫合糸ウィルlは、膀胱内の尿管を固定するために使用すること。
    3. 膀胱を通してチャネルを作成するには、それが膀胱の正面（腹側）壁の方に出るように、膀胱を通して斜めに21G針を渡す。
    4. 21G針のベベルで目の針を休ま。膀胱を通して目の針を導くために21G針を使用してください。目の針は、膀胱を通って尿管を取るために使用される。
    5. 9 / Oタッキング縫合糸を渡し、膀胱内と外のエントリポイントに隣接した膀胱壁を介して第切開部を介して、ステップ5.11.2で尿管に適用される。尿管、膀胱を通過したらこれは、膀胱に尿管を固定するために結ばれます。
    6. 目の針を介してステップ5.10で尿管の一端に印加長い6 / O黒編組絹縫合糸を配置します。
    7. 慎重に尿管が膀胱を通って引っ張られることを確実にしながら、膀胱の外に目を針を撤回。
    8. 尿管が目から出たらEの膀胱は、目の針を削除し、バック膀胱へ後退を防止するために、尿管の終わりに長い縫合糸にクランプを適用する。
    9. 膀胱内に場所内の尿管を固定するには、手順5.11.5で適用9 / Oポリアミドモノフィラメントタック縫合糸を、ネクタイ。
    10. しっかりと膀胱内の尿管を固定するエントリポイントの周りの2箇所に段階5.11.2と5.11.5で説明したように、追加のシングル9 / Oポリアミドモノフィラメントタイ縫合糸を適用します。
    11. 開いたハサミの裏を使用して、緊急尿管のより多くを露出するために戻って少し膀胱壁を押してください。
    12. 尿管の端部に位置する長い縫合上記の尿管を分割します。尿管、膀胱の体内に後退する必要があります。これは、尿管の開放管腔を確認し、膀胱内の開口部から流れ出る尿を観察することが通常である。
    13. 9 / Oポリアミドモノフィラメント縫合糸で膀胱の出口傷を閉じます。
12. 慎重に腸を交換腹腔。
13. ステップ4.1から4.8に詳述術後ケアを提供。
14. 腎臓は通常、7日、圧縮解除されるまで、マウスが回復することを許可します。
15. 実験の終了時点で、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させると組織病理学的分析のために腎臓を収集します。

結果

腎臓の変化の外観が著しく尿管閉塞に続く、それはより薄いと時間との触診に緊張した（ 図1）となる。障害物に尿管の近位および腎盂の増加拡張があります。腎臓は腎皮質と髄質の著しい間伐結果として長期の閉塞閉塞性腎症の増加期間としてますます萎縮になる。尿管閉塞の逆転後、腎臓の色が血流が増加し、組織浮腫が解消するように暗くなる。彼らは長期の膨満の期間（...

ディスカッション

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. The R-UUO model is of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract secondary to prostatic hypertrophy, posterior urethral valves etc. that requires decompression with patients commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may eventually lead to end stage kidney disease.^8,9 The models detailed here enable ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14072-10
Spring Scissors – straight	Fine Science Tools	15000-10
Toothed forceps	Fine Science Tools	11021-12
Angled forceps x 2	Fine Science Tools	00649-11
Straight forceps	Fine Science Tools	00632-11
Colibri 3 cm wire retractor	Fine Science Tools	17000-03
Castroviejo needle holder with lock	Fine Science Tools	12565-14
Wound clip applicator	Fine Science Tools	12031-07
7 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-07
Castroviejo micro needle holder with lock	Fine Science Tools	12060-01
OPMI pico microscope	Carl Zeiss	S100
Heat electronic pad	Cozee Comfort	n/a
6/O silk braided suture	Harvard Apparatus	72-3287
9/O Dafilon (polyamide) suture	B-Braun	G1111434
5/O braided silk suture	Harvard Apparatus	51-7680
Regular bevel needle, 1 inch, 21G	Becton, Dickinson and Company	305175
1 ml syringe slip tip	Becton, Dickinson and Company	300184
Wypall paper swabs	Kimberley-Clark	L40	Sterilised (Autoclave)
Cotton wool buds	Johnson and Johnson	n/a	Sterilised (Autoclave)
Plain drapes	Guardian	CB03	Sterilised (Autoclave)
Soft wall silicone rubber tubing			Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml solution
(Domitor) Medetomidine hydrochloride	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0.3mg/ml
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml
(Adept) 4% Icodextrin	Baxter		Adhesion reduction solution
NaCl 0.9%	Baxter	FKE1323