Мышиной модели необратимые и обратимые одностороннего мочеточника непроходимости

Резюме

The murine model of irreversible unilateral ureteric obstruction (UUO) is presented together with the model of reversible UUO in which the ureteric obstruction is relieved by anastomosis of the severed ureter into the bladder. These models enable the study of renal inflammation and scarring as well as tissue remodeling.

Аннотация

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive nephropathy induced by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). In the irreversible UUO model, the ureter may be obstructed for variable periods of time in order to induce increasingly severe renal inflammation and interstitial fibrotic scarring. In the reversible R-UUO model the ureter is obstructed to induce hydronephrosis, tubular dilation and inflammation. After a suitable period of time the ureteric obstruction is then surgically reversed by anastomosis of the severed previously obstructed ureter to the bladder in order to allow complete decompression of the kidney and restoration of urinary flow to the bladder. The irreversible UUO model has been used to investigate various aspects of renal inflammation and scarring including the pathogenesis of disease and the testing of potential anti-inflammatory or anti-fibrotic therapies. The more challenging model of R-UUO has been used by some investigators and does offer significant research potential as it allows the study of inflammatory and immune processes and tissue remodeling in an injured and scarred kidney following the removal of the injurious stimulus. As a result, the R-UUO model offers investigators the opportunity to explore the resolution of kidney inflammation together with key aspects of tissue repair. These experimental models are of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract that requires decompression and are commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may lead to eventual end stage kidney failure.

Введение

The overall aim of the experimental model described here is to induce obstructive nephropathy by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). A simple irreversible model of UUO is presented in which the left ureter is permanently obstructed by ligation with a suture or by the application of a ligating clip. This results in marked dilatation of the ureter together with reduced renal blood flow and glomerular filtration. Renal histology demonstrates tubular dilatation and increasingly severe interstitial renal inflammation and fibrosis. Irreversible UUO is a useful model and has been adopted by many researchers in the study of both renal inflammation and fibrosis.^1-4 Although the irreversible model of UUO requires some surgical expertise it is relatively straightforward and is often used to seek insights into the pathogenesis of interstitial renal injury and the ensuing fibrosis. Also presented is a less frequently used R-UUO model using a modification of the method originally described by Tapmeier et al.⁵ The R-UUO model has much future potential for the study of inflammatory and immune processes, cellular and tissue regeneration as well as the subsequent tissue remodeling following the removal of an injurious stimulus.

The more challenging R-UUO model has been used by a limited number of investigators with some groups employing a significantly different surgical technique to that described here^6,7 though with interesting results. In the R-UUO model presented, the ureter is ligated to induce complete ureteric obstruction for a period of time sufficient to induce the level of injury and fibrosis desired: 7 days of UUO was chosen in the method described here. The ureteric obstruction is reversed and the kidney is allowed to decompress for a period of time determined by the investigator before the mice are culled and the kidney removed for analysis: 7 days of decompression was chosen in the method described here though a longer period would be chosen if the resolution of inflammation and fibrosis was being studied. Although the method described here requires significant surgical expertise, it offers several advantages over other R-UUO models. The application of soft walled plastic tubing to the obstructed ureter prevents excessive ureteric dilation and this facilitates the subsequent manipulation and anastomosis of the ureter. Furthermore, in the described R-UUO model the ureter is divided thereby allowing the removal of any residual urinary sediment and debris. This confirms that the remaining ureter lumen is de-obstructed and patent prior to anastomosis to the bladder.

Experiments incorporating both the irreversible and reversible UUO models can provide researchers with a powerful insight into the molecular and cellular mechanisms of both injury and subsequent resolution and regeneration. Thus, the model of R-UUO described here would be highly relevant to researchers interested in post-inflammatory tissue remodeling and how this can be modulated.

протокол

Общее руководство: Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и нормами, установленными животных (научные процедуры) Закона 1986 года этот Протокол и сопровождающие видео на протоколе, как для стандартного ОМО и R-ОМО, которая может быть выполнена на многих линии мышей. В видеосюжета, обе процедуры выполняются на мужчин C57BL / 6 мышей в возрасте 8 недель. Данные, представленные в разделе репрезентативные результаты были получены из мужчин FVB / N мышах.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол и сопутствующие сведения о видеозаписи, как выполнять стандартную ОМО и R-UUO использования левого мочеточника, однако те же методы могут быть легко использованы в нужном мочеточника.

1. Подготовка животных и Лапаротомию

1. Выполните все процедуры стерильными (автоклавного) Инструменты и расходные материалы.
2. Вводят кетамина гидрохлорид (70 мг / кг) и медетомидина гидрохлорид (1 мг / кг) внутрибрюшинно анестезиюмышь. Примечание: продолжительность результате анестезии плоскости 4 ч и не дополнительный анестезия не требуется.
3. Подтвердите глубины анестезии потерей рефлексов, например, регулировка развала крайнем случае.
4. Удалить все волосы вокруг области разреза и подготовить кожу с брюшка к операции с помощью применения разбавленным раствором хлоргексидина.
5. Наведите на хирургическом площадку с подогревом в лежачем положении и зафиксировать конечности на площадку с помощью низкой липкости клейкую ленту.
6. Во время процедуры, контролировать мышь на наличие признаков термических ожогов в результате хирургического площадку с подогревом. Если возможно использовать не электрический источник тепла.
7. Администрирование анальгетик с помощью подкожной инъекции гидрохлорида бупренорфина (0.06mg / кг) и применить глаз смазки, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
8. Сделайте срединной лапаротомии и разрез бессосудистой белой линии с использованием мягкой ткани, разделяющая ножницы, чтобы получить доступ в брюшную полость.
9. Накройте мышь и вставьте Colibriвтягивающее в разрез.

2. Одностороннее мочеточников Обструкция

1. Использование стерилизованные ватные палочки подвергайте левого мочеточника путем смещения кишечника к правой стороне брюшной полости и покрывают их с увлажненными шторы.
2. Использование угловые щипцы изолировать и поднять левого мочеточника.
3. Для создания мочеточника препятствий, лигирования левого мочеточника дважды 6 / вывода черный плетеный шелковой нити в любом месте между мочевым пузырем и почечной лоханки. Для долгосрочных экспериментов, использовать рассасывающиеся нити для всех брюшных операций. Кроме того, ролик лигирования могут быть применены к мочеточника.
4. Для выделения мочевой пузырь из мочеточника, разделить мочеточника между двумя швами.
5. Тщательно заменить кишечника в брюшную полость.
6. Следуйте инструкциям, приведенным в разделе 4 - послеоперационной реабилитации и уходу, чтобы закрыть разрез и обратить вспять анестезии.

3. Подготовка к Reversiblе Односторонний мочеточников Обструкция

1. Подготовьте мышь для хирургии и изолировать левого мочеточника, как описано в шагах от 1,1 до 2,2 выше.
2. Чтобы создать препятствие мочеточника, что может быть отменено, лигирования левого мочеточника дважды 6 / вывода черного плетеной шелковой нити близко к пузырь. Оставьте один конец верхней нити тех пор, пока это будет использоваться для закрепления мягкой стеной пластиковые трубы в месте вокруг мочеточника.
3. Сделать продольный разрез в 5 мм длины мягкой стеной пластиковых труб таким образом, что он может быть распущенной открыт, чтобы позволить ему быть применены к мочеточника. Любой мягкой стеной силикон пластиковые трубы, с внутренним диаметром 1 мм и наружным диаметром 2 мм, могут быть использованы.
4. Поместите мягкую стеной пластиковых труб мягко вокруг мочеточника. Убедитесь, что нить длиной выходит из центра щели в трубке, когда он закрыт вокруг мочеточника.
5. Поместите длину 6 / вывода черный плетеный шелковой нити вокруг мягкой стеной трубы ограждающих мочеточник и галстукодин раз. Теперь поместите длинный конец шовного материала, возникающих от центра щели в трубопроводе, в продольном направлении через трубопровод так, что он лежит на верхней части ранее связанного шва.
6. Свяжите шва, расположенных вокруг трубы в два раза, чтобы закрепить трубку и длинный конец шва в месте вокруг мочеточника.
   Примечание: Чтобы предотвратить образование спаек на мочеточник и мягкой стеной пластиковых труб, раствор снижение адгезии может быть применен к области вокруг трубы.
7. Тщательно заменить кишечника в брюшную полость.

4. послеоперационной реабилитации и уход

1. Закрыть брюшины с одеялом стежка с помощью 5 / вывода черный плетеный шелковый шов и приблизить кожу с помощью металлических зажимов кожи.
2. Чтобы свести к минимуму риск послеоперационной инфекции, применяются антисептические, такие как йод / спиртовом растворе в кожу живота.
3. Переменная обратной анестезия с Атипамезол гидрохлорида (2 мг / кг) подкожно.
4. Администрирование жидкости с помощью подкожной инъекции 1 мл физиологического раствора нагревают.
5. Монитор мыши, пока он не пришел в сознание.
6. Разрешить мыши для восстановления в нагретом поле выдерживают при 29 ° С в течение 24 ч. Увлажненный пища также может быть предусмотрено, чтобы стимулировать жидкости и питания потребление.
7. Оставьте мышь, чтобы восстановить, чтобы вызвать желаемый уровень обструкции, обычно на 7 дней.
8. Для долгосрочных экспериментов по восстановлению, обеспечить текущие анальгетики. Если мышь, чтобы восстановить дольше, чем 7 дней, снимите зажимы кожным 7 дней после операции.
9. После того, как желаемый уровень обструкции был вызван, либо в обратном ОМО, как описано ниже, или усыпить мышь смещением шейных позвонков и собирать почки для анализа патоморфологическую.

5. Реверсивный Односторонний мочеточников Обструкция

1. Для выполнения R-UUO подготовить мышь, которая претерпела подготовку к R-ОМО, для хирургии, как описано в шагах 10,1 до 1,7.
2. Если присутствует, удалить зажимы кожи и разделить или удалить швы в брюшине, чтобы получить доступ к брюшной полости. Примечание: Если мочеточник был затруднен в течение длительного эксперимента кожи клипов, должен быть удален 7 дней после применения.
3. Подготовьте мышь и изолировать левого мочеточника, как описано в шагах от 1,8 до 2,2.
4. Использование угловых щипцов, освободить мягкую стеной пластиковых труб из любого гранулематозного ткани, которая может быть сформирована.
5. Отрежьте нить проведении пластиковой трубки вокруг обструкцией мочеточника с помощью скальпеля и удалить трубку.
6. Подтверждение успешного ОМО путем оценки на наличие гидронефроз в левой почке, почки должны также появляются бледно.
7. Разделите мочеточника между швами.
8. Поместите оставшуюся длину мочеточника, прикрепленный к почке, на маленьком кусочке стерильной марлей. Эта информация будет использоваться для сбора осадка мочи и отмершие клетки, которая будет вытекать из мочеточника ай почечной лоханки раз шва удаляется.
9. Разделите выше мочеточника, но рядом, шовный и позволяют почек для слива на марлю. Оставьте нижний шов, ближе к мочевому пузырю, без изменений. Это делается для того, чтобы моча не будет течь из мочевого пузыря и в брюшную полость.
10. После того, как мочеточник и почечной лоханки были осушены, применить длинный 6 / вывода черного плетеный шелковый шов до конца оставшегося длины мочеточника. Это будет использоваться, чтобы помочь в мочеточник анастомоза мочевого пузыря, осуществляемом позже.
11. Следуйте инструкциям ниже, чтобы анастомозируют оставшуюся длину мочеточника в мочевой пузырь:
    1. Включите мочеточник таким образом, что она лежит впереди в исходное положение и лежит над почек.
    2. Поместите одной 9 / вывода полиамида мононити TACKING швом 2 мм от конца мочеточника таким образом, что она выходит в направлении мочевого пузыря. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что шва остается в мышечной оболочки и не входит в мочеточник просвет. Лавировать шов Вильл быть использованы для закрепления мочеточник в мочевой пузырь.
    3. Чтобы создать канал через мочевой пузырь, пройти 21g иглу диагонали через мочевой пузырь таким образом, что он выходит в сторону передней (вентральной) стенки мочевого пузыря.
    4. Отдых в глазами иглу в скоса иглы 21G. Используйте 21G иглу, чтобы вести глазами иглу через мочевой пузырь. Глазами иглы будет использоваться, чтобы взять мочеточник через мочевой пузырь.
    5. Пропустите прихватки шва 9 / вывода, применяется мочеточника в шаге 5.11.2, через первый разрез в мочевом пузыре и выходит через стенку мочевого пузыря, примыкающей к точке входа. После того, как мочеточник проходит через мочевой пузырь, это будет связано с якорь мочеточник в мочевой пузырь.
    6. Поместите длинный 6 / вывода черного плетеный шелковый шов, приложенное к концу мочеточника на этапе 5,10 глазами через иглу.
    7. Осторожно снять глазами иглу из мочевого пузыря в то время гарантируя, что мочеточник и протягивают через мочевой пузырь.
    8. После того, как мочеточник выходит из гое мочевого пузыря удалить иглу глазами и применить зажим с длинной нити в конце мочеточника, чтобы предотвратить отвод назад в мочевой пузырь.
    9. Для привязки мочеточника в месте в мочевом пузыре, связать 9 / вывода полиамида мононити липкости шва, нанесенный на стадии 5.11.5.
    10. Применить дополнительные односпальные 9 / вывода полиамидные мононити галстук швов, как описано в шагах 5.11.2 и 5.11.5 в двух местах вокруг точки входа, чтобы твердо закрепить мочеточника в мочевом пузыре.
    11. Используя спину открытых ножниц, нажмите стенки мочевого пузыря немного назад, чтобы выставить больше, выходящего мочеточника.
    12. Разделить выше длинного шва, расположенного на конце мочеточника мочеточника. Мочеточника следует убрать в теле мочевого пузыря. Это обычно наблюдается мочи течет из отверстия в мочевом пузыре, подтверждающие открытые просвет мочеточника.
    13. Закройте выходное отверстие в мочевом пузыре с 9 / вывода полиамид мононити шва.
12. Осторожно вставьте кишечника вбрюшной полости.
13. Послеоперационного ухода, как описано в шагах от 4,1 до 4,8.
14. Разрешить мыши, чтобы оправиться, пока почки не распакованы, как правило, 7 дней.
15. В экспериментальной конечной точки, усыпить мышь смещением шейных позвонков и собирать почки для гистопатологического анализа.

Результаты

Появление изменений в почках заметно после мочеточника препятствий, и она становится бледнее и напряженной при пальпации времени (рис 1). Существует увеличение дилатация мочеточника проксимальнее обструкции и почечной лоханки. Почек становится все более атрофический, как пр?...

Обсуждение

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. The R-UUO model is of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract secondary to prostatic hypertrophy, posterior urethral valves etc. that requires decompression with patients commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may eventually lead to end stage kidney disease.^8,9 The models detailed here enable ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14072-10
Spring Scissors – straight	Fine Science Tools	15000-10
Toothed forceps	Fine Science Tools	11021-12
Angled forceps x 2	Fine Science Tools	00649-11
Straight forceps	Fine Science Tools	00632-11
Colibri 3 cm wire retractor	Fine Science Tools	17000-03
Castroviejo needle holder with lock	Fine Science Tools	12565-14
Wound clip applicator	Fine Science Tools	12031-07
7 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-07
Castroviejo micro needle holder with lock	Fine Science Tools	12060-01
OPMI pico microscope	Carl Zeiss	S100
Heat electronic pad	Cozee Comfort	n/a
6/O silk braided suture	Harvard Apparatus	72-3287
9/O Dafilon (polyamide) suture	B-Braun	G1111434
5/O braided silk suture	Harvard Apparatus	51-7680
Regular bevel needle, 1 inch, 21G	Becton, Dickinson and Company	305175
1 ml syringe slip tip	Becton, Dickinson and Company	300184
Wypall paper swabs	Kimberley-Clark	L40	Sterilised (Autoclave)
Cotton wool buds	Johnson and Johnson	n/a	Sterilised (Autoclave)
Plain drapes	Guardian	CB03	Sterilised (Autoclave)
Soft wall silicone rubber tubing			Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml solution
(Domitor) Medetomidine hydrochloride	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0.3mg/ml
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml
(Adept) 4% Icodextrin	Baxter		Adhesion reduction solution
NaCl 0.9%	Baxter	FKE1323