Un modèle murin d'irréversible et réversible unilatérale obstruction urétérale

Résumé

The murine model of irreversible unilateral ureteric obstruction (UUO) is presented together with the model of reversible UUO in which the ureteric obstruction is relieved by anastomosis of the severed ureter into the bladder. These models enable the study of renal inflammation and scarring as well as tissue remodeling.

Résumé

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive nephropathy induced by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). In the irreversible UUO model, the ureter may be obstructed for variable periods of time in order to induce increasingly severe renal inflammation and interstitial fibrotic scarring. In the reversible R-UUO model the ureter is obstructed to induce hydronephrosis, tubular dilation and inflammation. After a suitable period of time the ureteric obstruction is then surgically reversed by anastomosis of the severed previously obstructed ureter to the bladder in order to allow complete decompression of the kidney and restoration of urinary flow to the bladder. The irreversible UUO model has been used to investigate various aspects of renal inflammation and scarring including the pathogenesis of disease and the testing of potential anti-inflammatory or anti-fibrotic therapies. The more challenging model of R-UUO has been used by some investigators and does offer significant research potential as it allows the study of inflammatory and immune processes and tissue remodeling in an injured and scarred kidney following the removal of the injurious stimulus. As a result, the R-UUO model offers investigators the opportunity to explore the resolution of kidney inflammation together with key aspects of tissue repair. These experimental models are of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract that requires decompression and are commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may lead to eventual end stage kidney failure.

Introduction

The overall aim of the experimental model described here is to induce obstructive nephropathy by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). A simple irreversible model of UUO is presented in which the left ureter is permanently obstructed by ligation with a suture or by the application of a ligating clip. This results in marked dilatation of the ureter together with reduced renal blood flow and glomerular filtration. Renal histology demonstrates tubular dilatation and increasingly severe interstitial renal inflammation and fibrosis. Irreversible UUO is a useful model and has been adopted by many researchers in the study of both renal inflammation and fibrosis.^1-4 Although the irreversible model of UUO requires some surgical expertise it is relatively straightforward and is often used to seek insights into the pathogenesis of interstitial renal injury and the ensuing fibrosis. Also presented is a less frequently used R-UUO model using a modification of the method originally described by Tapmeier et al.⁵ The R-UUO model has much future potential for the study of inflammatory and immune processes, cellular and tissue regeneration as well as the subsequent tissue remodeling following the removal of an injurious stimulus.

The more challenging R-UUO model has been used by a limited number of investigators with some groups employing a significantly different surgical technique to that described here^6,7 though with interesting results. In the R-UUO model presented, the ureter is ligated to induce complete ureteric obstruction for a period of time sufficient to induce the level of injury and fibrosis desired: 7 days of UUO was chosen in the method described here. The ureteric obstruction is reversed and the kidney is allowed to decompress for a period of time determined by the investigator before the mice are culled and the kidney removed for analysis: 7 days of decompression was chosen in the method described here though a longer period would be chosen if the resolution of inflammation and fibrosis was being studied. Although the method described here requires significant surgical expertise, it offers several advantages over other R-UUO models. The application of soft walled plastic tubing to the obstructed ureter prevents excessive ureteric dilation and this facilitates the subsequent manipulation and anastomosis of the ureter. Furthermore, in the described R-UUO model the ureter is divided thereby allowing the removal of any residual urinary sediment and debris. This confirms that the remaining ureter lumen is de-obstructed and patent prior to anastomosis to the bladder.

Experiments incorporating both the irreversible and reversible UUO models can provide researchers with a powerful insight into the molecular and cellular mechanisms of both injury and subsequent resolution and regeneration. Thus, the model of R-UUO described here would be highly relevant to researchers interested in post-inflammatory tissue remodeling and how this can be modulated.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Directives générales: expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements imposés par les animaux (Scientific Procedures) de Loi 1986. Ce protocole et le protocole de vidéo qui l'accompagne sont à la fois un UUO standard et un R-UUO, qui peut être effectuée sur plusieurs souches de souris. Dans la vidéo d'accompagnement, les deux procédures sont effectuées sur des souris C57BL / 6 mâles âgées de 8 semaines les souris. Les données présentées dans la section des résultats représentatifs ont été obtenus auprès de sexe masculin souris FVB / n.

NOTE: Ce protocole et accompagner détails de la vidéo comment effectuer une UUO standard et R-UUO utilisant l'uretère gauche, mais les mêmes techniques peuvent facilement être appliqués à l'uretère droit.

1. Préparation des animaux et la laparotomie

1. Effectuer toutes les procédures avec les instruments et consommables stériles (autoclave).
2. Injecter chlorhydrate de kétamine (70 mg / kg) et du chlorhydrate de médétomidine (1 mg / kg) par voie intraperitoneale à anesthésierla souris. Remarque: La durée de l'anesthésie plan résultant est de 4 heures et pas d'anesthésie supplémentaire ne est nécessaire.
3. Confirmer la profondeur de l'anesthésie par la perte des réflexes, par exemple pincement de l'orteil.
4. Retirez tous les cheveux entourant la zone d'incision et de préparer la peau pour la chirurgie abdominale via l'application d'une solution diluée de chlorhexidine.
5. Placez la souris sur un bloc chirurgical chauffé dans une position couchée et fixer les membres à l'aide de ruban adhésif pad à faible adhérence.
6. Durant la procédure, surveiller la souris les signes de brûlures thermiques en raison du tampon chirurgical chauffé. Si possible, utilisez une source de chaleur non-électrique.
7. Administrer un analgésique par injection sous-cutanée de chlorhydrate de buprénorphine (0,06 mg / kg) et appliquer du lubrifiant oculaire pour éviter un dessèchement de la cornée.
8. Faire une laparotomie médiane et une incision de la linea alba avasculaire l'aide de ciseaux de tissu de séparation pour accéder à la cavité péritonéale.
9. Drapé de la souris et insérer un colibrirétracteur dans l'incision.

2. unilatérale obstruction urétérale

1. Utilisation de bourgeons de coton stérilisés exposer l'uretère gauche en déplaçant les intestins vers le côté droit de la cavité abdominale et les couvrir avec des rideaux humides.
2. En utilisant des pinces angulaires isoler et soulever l'uretère gauche.
3. Pour créer une obstruction urétérale, ligaturer l'uretère gauche deux fois avec 6 / O noir tressé de soie suture ne importe où entre la vessie et du bassinet du rein. Pour les expériences à long terme, utiliser suture absorbable pour toutes les chirurgies abdominales. En variante, une pince de ligature peut être appliquée à l'uretère.
4. Pour isoler la vessie de l'uretère, diviser l'uretère entre les deux points de suture.
5. Replacez soigneusement les intestins dans la cavité péritonéale.
6. Suivez les étapes énumérées à la section 4 - récupération post-opératoire et des Soins de fermer l'incision et d'inverser l'anesthésie.

3. Préparation pour Reversible unilatérale obstruction urétérale

1. Préparer une souris pour la chirurgie et d'isoler l'uretère gauche comme indiqué dans les étapes 1.1 à 2.2 ci-dessus.
2. Pour créer une obstruction urétérale qui peut être inversée, ligaturer l'uretère gauche deux fois avec 6 / O noir tressé de soie suture près de la vessie. Laissez une extrémité de la suture supérieure tant que ce sera utilisé pour ancrer le tube en plastique à paroi souple en place autour de l'uretère.
3. Faire une fente longitudinale sur une longueur de 5 mm de tube en plastique à paroi souple de manière à pouvoir être évasée ouverte pour lui permettre d'être appliqué à l'uretère. De préférence un tube en plastique à paroi souple en silicone, avec un diamètre interne de 1 mm et un diamètre externe de 2 mm, peut être utilisé.
4. Placez le tube en plastique à paroi souple doucement autour de l'uretère. Se assurer que le fil de suture longue émerge du centre de la fente dans le tube une fois qu'il est fermé autour de l'uretère.
5. Placez une longueur de 6 / O noire tressée suture de soie autour du tube à paroi souple enfermant l'uretère et cravateune fois. Maintenant, placer l'extrémité longue du fil de suture, émergeant du centre de la fente dans le tube, longitudinalement à travers le tube de telle sorte qu'il se trouve au-dessus de la suture attachée précédemment.
6. Attacher le fil de suture autour du tube situé à deux reprises pour ancrer le tube et l'extrémité de fil de suture longue en place autour de l'uretère.
   Remarque: Pour éviter la formation d'adhérences sur l'uretère et le tube en plastique à paroi souple, d'une solution de réduction de l'adhérence peut être appliqué à la zone autour du tube.
7. Replacez soigneusement les intestins dans la cavité péritonéale.

4. récupération post-opératoire et des Soins

1. Fermez le péritoine avec point de feston utilisant 5 / O noire tressée suture de soie et de se rapprocher de la peau à l'aide des clips métalliques de la peau.
2. Pour minimiser le risque d'infection post-opératoire, appliquez un antiseptique comme solution d'iode / alcool pour la peau abdominale.
3. Partiellement anesthésie inverse avec le chlorhydrate d'atipamézole (2 mg / kg) sous-cutanée.
4. Administrer des fluides par une injection sous-cutanée de 1 ml de solution saline chauffée.
5. Surveiller la souris jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance.
6. Laisser la souris pour récupérer dans une boîte chauffée maintenue à 29 ° C pendant 24 heures. Nourriture humide peut également être fournie pour encourager l'apport hydrique et de la nutrition.
7. Laissez la souris pour récupérer pour induire un niveau souhaité de l'obstruction, généralement sept jours.
8. Pour les expériences de reconstitution à long terme, fournir des analgésiques en cours. Si la souris est à récupérer pendant plus de sept jours, retirez les clips de la peau 7 jours après la chirurgie.
9. Une fois le niveau de l'obstruction désiré a été induite, soit inverser la UUO, comme décrit ci-dessous, ou euthanasier la souris par dislocation cervicale et de recueillir les reins pour l'analyse de l'histopathologie.

5. réversible unilatérale obstruction urétérale

1. Pour effectuer une R-UUO préparer une souris, qui a subi une préparation pour le R-UUO, pour une chirurgie tel que décrit dans les étapes 1De 0,1 à 1,7.
2. Se il est présent, retirez les clips de la peau et de diviser ou de retirer les points de suture dans le péritoine pour accéder à la cavité abdominale. Remarque: Si l'uretère a été obstrué pendant long terme clips de la peau de l'expérience aurait dû être retiré sept jours suivant l'application.
3. Préparer la souris et isoler l'uretère gauche de la manière décrite dans les étapes 1,8 à 2,2.
4. En utilisant des pinces angulaires, libérer le tube en plastique à paroi souple de tout tissu de granulation qui peuvent avoir formé.
5. Couper le fil de suture en tenant le tuyau plastique autour de l'uretère obstrué avec un scalpel et retirer le tube.
6. Confirmez succès UUO en évaluant la présence d'hydronéphrose dans le rein gauche, le rein devrait également apparaître pâle.
7. Diviser l'uretère entre les sutures.
8. Passer la longueur restante de l'uretère, le rein attaché à, sur un petit morceau de gaze stérile. Il sera utilisé pour recueillir le sédiment urinaire et les cellules mortes qui se écouler de l'uretère unee bassinet une fois la suture sont enlevés.
9. Diviser l'uretère ci-dessus, mais à proximité, la suture et permettre le rein se écouler sur la gaze. Laissez la suture inférieure, plus proche de la vessie, intacte. Il se agit de se assurer qu'aucune fuite urine provenant de la vessie et dans la cavité peritoneale.
10. Une fois l'uretère et bassinet du rein ont été drainés, appliquez une longue 6 / O noire tressée suture de soie à la fin de la durée restante de l'uretère. Il sera utilisé pour aider l'uretère anastomose de la vessie réalisée plus tard.
11. Suivez les étapes ci-dessous pour anastomoser la longueur restante de l'uretère dans la vessie:
    1. Mettre l'uretère tel qu'il se trouve en avant de sa position d'origine et se trouve sur le rein.
    2. Placer un unique 9 / O polyamide monofilament pointage suture 2 mm de l'extrémité de l'uretère de telle sorte qu'il émerge dans la direction de la vessie. Veillez à ce que la suture reste dans la couche musculaire et ne entre pas dans la lumière de l'uretère. Le wil pointage de suturel être utilisé pour ancrer l'uretère dans la vessie.
    3. Pour créer un canal à travers la vessie, passer une aiguille de 21G en diagonale à travers la vessie de telle sorte que sa sortie vers l'avant (ventrale) paroi de la vessie.
    4. Reste une aiguille à chas dans le biseau de l'aiguille 21G. Utilisez l'aiguille de 21G pour guider l'aiguille yeux à travers la vessie. L'aiguille à chas sera utilisé pour prendre l'uretère à travers la vessie.
    5. Faire passer le fil de suture 9 adhésivité / O, appliqué à l'uretère à l'étape 5.11.2, à travers la première incision dans la vessie et à travers la paroi de la vessie adjacente au point d'entrée. Une fois l'uretère est passé à travers la vessie ce sera liée à ancrer l'uretère à la vessie.
    6. Placer la longue 6 / O noire tressée suture de soie appliqué à la fin de l'uretère à l'étape 5.10 borgne à travers l'aiguille.
    7. Retirer délicatement l'aiguille yeux hors de la vessie tout en garantissant que l'uretère est également tiré à travers la vessie.
    8. Une fois l'uretère se dégage de the vessie retirer l'aiguille yeux et appliquer une pince à suture long à la fin de l'uretère pour empêcher la rétraction en arrière dans la vessie.
    9. Pour ancrer au sein de l'uretère dans la vessie, attacher le 9 / O polyamide monofilament amure suture, appliquée à l'étape 5.11.5.
    10. Appliquer sutures monofilament de liaison supplémentaires simples 9 / O de polyamide comme décrit dans les étapes 5.11.2 et 5.11.5 à deux endroits à travers le point d'entrée pour ancrer fermement l'uretère dans la vessie.
    11. Avec le dos de ciseaux ouverts, pousser la paroi de la vessie légèrement en arrière pour exposer davantage de l'uretère émergente.
    12. Diviser l'uretère-dessus de la longue suture située à l'extrémité de l'uretère. L'uretère doit se rétracter dans le corps de la vessie. Il est habituel d'observer l'urine se écoulant hors de l'ouverture dans la vessie, ce qui confirme la lumière de l'uretère ouverts.
    13. Fermez la sortie des plaies dans la vessie avec un polyamide suture monofilament 9 / O.
12. Replacez soigneusement les intestins enla cavité péritonéale.
13. Fournir des soins post-opératoire comme indiqué dans les étapes 4.1 à 4.8.
14. Laisser la souris pour récupérer jusqu'à ce que le rein est décompressé, généralement sept jours.
15. Au point de fin expérimentale, euthanasier la souris par dislocation cervicale et de recueillir les reins pour l'analyse histopathologique.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

L'apparition des modifications rénales nettement suivante obstruction urétérale et il devient plus pâle et tendu à la palpation avec le temps (Figure 1). Il est de plus en plus la dilatation de l'urètre proximal à l'obstruction et le bassinet du rein. Le rein devient de plus en plus atrophique que la durée de néphropathie obstructive augmente avec obstruction prolongée entraîne un amincissement notable de la moelle et le cortex rénal. Après le renversement de l'obstruction d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. The R-UUO model is of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract secondary to prostatic hypertrophy, posterior urethral valves etc. that requires decompression with patients commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may eventually lead to end stage kidney disease.^8,9 The models detailed here enable ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14072-10
Spring Scissors – straight	Fine Science Tools	15000-10
Toothed forceps	Fine Science Tools	11021-12
Angled forceps x 2	Fine Science Tools	00649-11
Straight forceps	Fine Science Tools	00632-11
Colibri 3 cm wire retractor	Fine Science Tools	17000-03
Castroviejo needle holder with lock	Fine Science Tools	12565-14
Wound clip applicator	Fine Science Tools	12031-07
7 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-07
Castroviejo micro needle holder with lock	Fine Science Tools	12060-01
OPMI pico microscope	Carl Zeiss	S100
Heat electronic pad	Cozee Comfort	n/a
6/O silk braided suture	Harvard Apparatus	72-3287
9/O Dafilon (polyamide) suture	B-Braun	G1111434
5/O braided silk suture	Harvard Apparatus	51-7680
Regular bevel needle, 1 inch, 21G	Becton, Dickinson and Company	305175
1 ml syringe slip tip	Becton, Dickinson and Company	300184
Wypall paper swabs	Kimberley-Clark	L40	Sterilised (Autoclave)
Cotton wool buds	Johnson and Johnson	n/a	Sterilised (Autoclave)
Plain drapes	Guardian	CB03	Sterilised (Autoclave)
Soft wall silicone rubber tubing			Silicone tubing - internal diameter 1.0 mm; external diameter 2.0 mm; wall thickness 0.6 mm
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml solution
(Domitor) Medetomidine hydrochloride	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0.3mg/ml
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml
(Adept) 4% Icodextrin	Baxter		Adhesion reduction solution
NaCl 0.9%	Baxter	FKE1323