הערכת אולטראסאונד מבוססת של עורקים הכליליים זרימה והזרימה כלילית ריזרב שימוש בדגם עומס יתר הלחץ בעכברים

Summary

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Abstract

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy.

During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS).

The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography.

The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Introduction

היצרות מסתם אאורטלי קליניים (AS) ידועות היטב לקידום עלייה הדרגתית בחדר שמאל afterload (LV). כדי לפצות על עומס hemodynamic כרונית עולה זה, היפרטרופיה LV (LVH) מתפתחת ^כ1,2 תגובה מסתגל. הפיתוח של LVH קשור לעתים קרובות עם הפרעות בזרימת דם כלילית. הוא חשב כי בעיות בתפקוד כלי דם, תורם לאיסכמיה כרונית בחולים אלו ^5. בנוסף לזרימה כלילית ^3,4, זרימת מילואים כליליים (CFR) מייצגים שינוי תפקודי של עורקים הכליליים ^1,3 ומוגדר כיחס בין מהירות זרימה מקסימלי בhyperemia לנקודת התחלת מהירות זרימה או ^4,6,7 מהירות זרימת מנוחה. CFR הוא ירד במהלך שיפוץ LV ^1-3,5-9 ומשמש כמדד לעומק של חומרה הפונקציונלית של הפרעה בתפקוד לב ^1,10,17. זה ידוע כי הוא פגום בצורות רבות של קרדיומיופתיה המורחבות ¹⁰ וגם של ליליtenosis ^6. CFR הוא גם לחזות את תוצאות קליניות ירודים ^12.

שיפוץ LV בהגדרה של הפרעה בתפקוד לב כגון איסכמיה או LVH מלווה גם סיסטיק הנרחב, שינויים בזרימת דם ועיבוי הכליליים של עורקים הכליליים ^1,2. כתוצאה משינויים אלה בפיזיולוגיה כלילית, יש סיכוי שיפוץ של העורקים הכליליים. זה עוזר למתן את ההשפעות של דיפוזיה חמצן הנמוכה והפרעה בתפקוד הדיאסטולי LV שעלול לגרום לרגישות ^ל1,2,13 איסכמיה לבבית.

עכברים מהונדסים גנטי הם כעת כלי מחקרי נפוץ נרחבת לחיקוי תנאי מחלות של בני אדם כגון טרשת עורקים כלילית ^{5,7,10,12,17.} במיוחד מודל עומס לחץ בעכברים נחקר באופן נרחב ^14,17. מודל התכווצות טרנס-אב העורקים (TAC) הוכח להיות מזוהה עם סיסטיק הנרחב, וcoronary היצרות וכתוצאה מכך, בחלקו, מעיבוי המדיאלי של עורקים הכליליים ועם ליווי שינויים בדפוסי זרימה כלילית ^1,11,17,19 דומים למה שראה בהגדרה של LVH בבני אדם. אמנם ידוע כי עומס יתר לחץ ממושך גורם לאי ספיקת לב מפוצית בכ 4-8 שבועות, ההשפעות על דינמיקה כלילית זרימה וזרימת מילואים במודלים אלה, בשלב מוקדם בתהליך של התקדמות מחלה, ובשלבים שונים לאחר הפסים, עדיין להיות ברור שהותווה.

זנים רבים של עכברים זמינים כעת לשימוש מחקר, כולל LDLR המאופיין היטב - / - או ApoE - / - עכברי ^10-12, ואלה תתבקשו פיתוח של טכניקות רגישות להערכת תפקוד לב וכלי דם ומורפולוגיה בעכברים חיים ^11-15. שיטות אלו כוללות MRI, PET, CT ניגוד, אולטרסאונד בתדר גבוה, וטומוגרפיה אלומת האלקטרונים ^2,9,17,19, שכולן לספק חלופות מבטיחות לפולשניתשיטות כגון צנתורי לב וצנתור לב ^12. עם זאת, בעכברים עם גודל קטן מאוד של העורקים הכליליים וקצב לב גבוה (HR), הדמיה של זרימת דם כלילי עדיין מהווה אתגר טכני לטכניקות זמינות כרגע רבות ^4,12. מעניין, חלה עלייה מעריכית בהתקדמות טכנית בתחום אקו דופלר transthoracic (TTDE), כוללים הפיתוח של ראשי סריקת מערך תדירות גבוהה עם תדרי מרכז 15-50 MHz המאפשר החלטות ציריות של כ 30-100 מיקרומטר, בעומקים של 8-40 מ"מ, ושיעורי מסגרת גדולים יותר מ -400 מסגרות-נתפסו / sec. בתורו, בטכניקות מבוססות TTDE צמחו ככלי פוטנציאלי רב עוצמה להדמית כלי גדול יותר ² או אפילו קטן יותר כגון עורקים הכליליים ^5,12.

אחר מראש קריטי שאפשר לחוקרים לבצע בדיקות הדמית אבחון של כלי הדם בקטניםnimals הוא השימוש מבוקר בקפידה של חומרי הרדמה השומרים על הלב וקצב נשימה של בעלי החיים במהלך ההדמיה ^11. תחזוקת הרדמה מבוקרת היא חשובה במיוחד ללימודים הקשורים להרחבת כלי דם בעכברים, ואת ההשפעה של הרדמה גם צריכה להיחקר נוסף בהקשר זה ^10,11. בבני אדם, לעומת זאת, מדידות CFR נגזרת TTDE הפכו נפוץ יותר כלי להערכה של עורקים הכליליים epicardial stenosed ואינם חסום, בעיקר בקדמית העורק הכלל השמאלי יורד ^5,16 (LAD). עם זאת, התפקיד פרוגנוסטיים של CFR וליליים זרימת שינויים בחולים או עכברים עם תפקוד סיסטולי LV השתמר במנוחה ללא תסמינים היה הרבה פחות חקר ^16. לכן, מטרת המחקר הייתה ראשון להקים פרוטוקול צעד-אחר-צעד ברור, כדי להעריך את השינויים בזרימה כלילית באמצעות TTDE במודל של עכברי עומס לחץ; שני, מחקר זה בחן את הסימן פרוגנוסטייםificance של CFR וליליים זרימת שינויים בתגובה ללחץ מתח עומס בעכברים אלו. חוקרים שערנו כי הערכה של CFR וזרימה כלילית מבוססת TTDE עשויה להיות שימושית באיתור המוקדם של הפרעות בתפקוד לב שעלול להקדים את תפקוד LV.

Protocol

הערה: כל הנהלים בוצעו בעכברים על פי האגודה האמריקנית לרפואת וטרינרית הנחיות (AVMA) ואושרו מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה (IACUC) פרוטוקולים.

עיצוב מחקר 1.

1. השתמש זכר 8-10 בן שבוע עכברי C57BL / 6 (BW ~ 25 גרם) במחקר.
2. אקראי העכברים (n = 11) לשתי קבוצות, קבוצת המחקר שנבחרה לפסים של אב העורקים (n = 8), וקבוצת הביקורת (n = 3) לעבור ניתוחי דמה באמצעות פתיחת בית החזה.
3. הכן את בעלי החיים להדמיה על ידי הסרת שיער מהחזה באמצעות שהוא כיתה רפואית קרם מקריח.
4. לבצע אולטרסאונד ראשון (סעיף 2) 24 שעות לפני פסי אב העורקים כדי לקבוע פרמטרים בסיסיים ביום -1, בין טווח של 1% ו -2.5% isoflurane (מעורבב עם 100% O ₂ דרך nosecone) הרדמה מושרה.
5. בחר סוכן הרדמה אושר רפואי (כלומר isoflurane) ולפקח על התואר של הרדמה (2-3% לinduce, ו1.0% כדי לשמור).
   הערה: הרדמה נכונה היא חיונית בשמירה על קצב לב בשיעורים רגילים פיסיולוגיים (כ -500 פעימות / min).
6. אשר את עומק ההרדמה על ידי אובדן של תנועה מבעלי החיים בתגובה לרפלקס דוושה-נסיגה. השתמש במשחת וטרינר paralube על העיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
7. לבצע ניתוח ביום 0 ^20,21.
8. לפסים של אב העורקים, ולקשור את אב העורקים באמצעות תפר 7-0 משי סביב מחט G מחודדת 26 הונחה על הקשת.
   הערה: פרטים לגבי פרוטוקול הניסוי, לרבות הליכי פסי אב העורקים כירורגית, תוארו בעבר ^20,21.
9. לבצע הדמיה לאחר ניתוח אולטרסאונד (סעיף 2) ביום (s) 2, 6 ו -13.
10. להרדים את העכברים ביום 14 ולאסוף את הלבבות להערכה היסטולוגית. להרדים את בעלי החיים באמצעות מנת יתר של pentobarbital ואחריו הסרת איברים חיוניים כמו הלב. לעצור את לבם בdiastole ולתקן עם פורמלין. השתמש בהליך של קצירת הלב שתואר בעבר ^22.
11. לתקן את כל רקמות הלב עם פתרון פורמלין 10% שנאגרו. לTrichrome צביעה, להטביע רקמות פרפין לפני חתך. השתמש בפרטים של Trichrome מכתים שכבר מודגם היטב בעבר ^14,23.
12. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנה מקוונת (סעיף 3).

2. הדמיה פרוטוקול

1. תמונות ציר ארוכות וקצרות של עורקים הכליליים במחיצה (SCA) (B- מצב)
   1. באמצעות הבדיקה MS550D עם תדר המרכזי של 40 MHz מחובר לפעיל-הנמל, נקבע מראש בקשה ל" הדמיית לב ".
   2. עם בעלי החיים שכיבה על הפלטפורמה המחוממת, ותחת ההרדמה נשלטה באמצעות חרטומו, למקם את הבדיקה באמצעות מערכת הרכבות כדי לקבל את ההשקפה ליד העצם הארוכה ציר (PSLAX) (איור 1 א). תמיד להבטיח כי בעל החיים הוא כל הזמן חם על platfor prewarmedמ 'וטמפרטורת גוף נשמר ברמות פיזיולוגיות.
   3. סובב את הבדיקה (עם החריץ מצביע caudally) בכיוון השעון, כך שזווית הבדיקה היא 15 מעלות לקו השמאל ליד העצם (ארוך ציר נוף) (איור 1).
   4. כוון את זווית הבדיקה על ידי הטיית מעט לאורך ציר y של החללית כדי להשיג תצוגת אורך באורך מלא של SCA במרכז המסך (איור 1).
   5. ברגע שציוני הדרך הנכונה (שסתום אב העורקים ועורק ריאה) נתפסים, חנות cine התמונה באמצעות מסגרת השיעור הגבוה ביותר אפשרי.
   6. על ידי שימוש ב" XY "גרזני מיקרו-מניפולטורים (1D איור), להתאים את מיקום הבדיקה כדי לקבל התמונה הברורה של SCA.
   7. סובב את הבדיקה 90 מעלות (עם חריץ מצביע caudally) בכיוון השעון כך שקצה המחורץ של החללית הוא בצד השמאל של קו האמצע (קצר-ציר) (איור 1 ג).
2. תמונות ציר ארוכות וקצרות של SCA (הצבע-דופלר Modה)
   1. ברגע שתמונת מצב B הוא נתפס או מאוחסן cine-, לחץ על מקש דופלר הצבע במקלדת כדי להפעיל חלון אקוסטי דופלר הצבע (איור 2).
      הערה: זה עוזר לבודד את העורקים הכליליים (חץ לבן מציין SCA) או ב( איור 2 א) או הארוכים בציר הקצר (איור 2 ג). צבע אדום נתפס כבזמן אמת ומעיד על כיוון הזרימה (במרחק של שסתום אב העורקים).
   2. ודא שעומק המיקוד (המסומן בחץ צהוב בצד ימין של מסך התמונה), נמצא במרכזה של עורקים הכליליים.
   3. יש לוודא שהנתונים נרשם, באמצעות מקש cine-החנות, במסגרת השיעור הגבוה ביותר האפשרי (> 100 מסגרות / sec).
3. PW דופלר הדמיה של SCA (פעמו-Wave או PW מצב)
   1. בעוד שבמצב הצבע-דופלר, לחץ על מקש PW כדי להעלות את קו צהוב-מחוון בעורקים הכליליים (איור 2, מוצגים באדום).
   2. הנח את הצהובקו PW באמצע העורק הכלל בתצוגה, בזווית שמקבילה כליווניות של הזרימה. שים לב כי מדידות מהירות תלויות מאוד בזווית של רכישת תמונה.
   3. כוון את הזווית של זרימה (מפתח זווית PW) ונפח דגימה (מפתח SV) כך שמפתח זווית PW הוא 60 מעלות או פחות ונפח דגימה לוכד לזרום ממש במרכז של SCA.
   4. השתמש בחנות cine כדי ללכוד את צורות גל המציינות את המהירות של הזרימה כלילית בהתכווצות שיא (S) וירוויח (איורים 3 א ו 3 ב) (ד), באמצעות 1% ו -2.5% isoflurane.

חישוב נתונים 3. וניתוח

1. בחר את זמן מהירות כלי (VTI) נפרד כדי לקבל את הסיסטולי השיא ומהירויות הדיאסטולי מהתמונות המוצגות באיורי 3 א ו 3 ב.
2. לחשב את מדד זרימת מילואים כליליים (CFR) כיחס שבין (2.5% isoflurane) f hyperemic הדיאסטולי שיאמהירות נמוכה לנקודת התחלה (isoflurane 1%) שיא מהירות זרימה הדיאסטולי.
3. לחשב את יחס S / D כהסיסטולי זרימה כלילית מהירות / מהירות זרימה כלילית הדיאסטולי שיא השיא. לקבוע את היחס בתחילת המחקר (isoflurane 1%) ובhyperemia (isoflurane 2.5%).
4. לפרמטרים סטנדרטיים לב פונקציה כגון FS, FAC, LVM, עיין במדריכים מהיצרן לבצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת קניינית או להפנות ליופיטר הנייר של Cheng ^2.

תוצאות

של העכברים 11 שלמדו (התאגדו, n = 8 והעמדת פן, n = 3), תמונות הולמות ושחזור התקבלו על ידי משקיף יחיד בכמה נקודות זמן: בתחילת המחקר (D-1), D2, D6 וD13 . כמו כן, מהירות הזרימה באתר constrictive נמדדה כ2,225 ± 110.9 מ"מ / s, לעומת 277.5 מ"מ ± 10.51 / s בעכברי הדמה ביום לאחר הניתוח (p <0.05). העלייה במהירות ה...

Discussion

במחקר זה מבוסס אולטרסאונד, הערכה לא פולשנית של זרימה כלילית בוצעה reproducibly בזמן אמת, על פני ימים, בעכברי ניסוי חיים; יתר על כן, הפרוטוקול הפגין הפוטנציאל לזהות בעיות בתפקוד לב כלילית שהיו נוכח בשלב מוקדם והיה קשור למחסור בזלוף שריר לב. שיטה זו סופו של דבר ניתן תהיה למנף כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Depilatory cream	Miltex, Inc.	Surgi-Prep	Apply 24 hours prior to imaging
Isoflurane	Baxter International Inc.	NDC 10019-773-40	2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute
	Table of equipments
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
High-frequency Mechanical Transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS250, MS550D, MS400