마우스의 압력 과부하 모델을 사용하여 관상 동맥 흐름 및 관상 동맥 흐름 준비 제도 이사회의 초음파를 바탕으로 평가

요약

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

초록

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy.

During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS).

The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography.

The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

서문

임상 대동맥 협착 (AS)가 잘 좌심실 후 부하의 점진적 증가를 촉진하는 것으로 알려져있다. 이 만성적으로 상승 혈역학 적 부하를 보상하기 위해, 좌심실 비대 (LVH)는 적응 응답 ^1,2로 계속된다. LVH의 개발은 종종 관상 미세 순환에 이상과 연관된다. 그것은 미세 혈관 기능 장애 환자 ⁵ 만성 허혈에 기여하는 것으로 생각된다. 관상 동맥 유량 ^3,4- 외에도 혈류 보호구 (CFR)는 관상 동맥 ^1,3 기능적 변화를 나타내고, 기준 유속 또는 휴식 유속 ^4,6,7에 충혈에서 최대 유동 속도의 비율로 정의된다. CFR은 LV 리모델링 ^1-3,5-9 동안 감소 관상 ^1,10,17의 기능적 장애 심각성의 정도의 지표로서 사용된다. 이는 팽창 된 심근증 ^(10)의 다양한 형태 및 관상 (S)에 손상되는 것으로 알려진tenosis ^6. CFR은 가난한 임상 결과 ¹² 예후 마커입니다.

이러한 허혈 또는 ​​좌심실 비대로 심장 기능 장애의 설정에서 LV 리모델링은 광범위한 섬유화, 관상 동맥 ^1,2의 관상 동맥 미세와 농축의 변화를 동반한다. 관상 생리학 이러한 변화의 결과로서, 관상 동맥의 리모델링 가능성이있다. 이것은 낮은 산소 확산 및 심근 허혈 ^1,2,13 감수성이 발생할 수 좌심실 이완기 기능 장애의 영향을 완화하는 데 도움이됩니다.

유전자 변형 마우스는 관상 동맥 경화 ^{5,7,10,12,17로} 지금 인간의 질병 상태를 모방하는 데 널리 널리 임상 도구입니다. 특히, 마우스에서의 압력 과부하 ^{모델을 14,17} 널리 연구되고있다. 트랜스 대동맥 협착 모델 (TAC)는 광범위한 섬유증 및 coronar과 연관된 것으로 밝혀졌다Y 협착 관상 동맥의 내측 두껍게에서 인간의 좌심실 비대의 설정에서 본 것과 유사한 관상 동맥 흐름 패턴 ^{1,11,17,19의} 변화를 동반, 부분적으로, 결과. 이 장시간 압력 과부하 4-8 주간 부전 심부전에 이르게하는 것이 알려져 있지만, 밴딩 후 혈류 역학 및 조기 질병 진행 과정에서 이러한 모델 플로우 보호구에 그리고 다른 단계에서 효과가 아직 명확하게 묘사한다.

마우스의 수많은 변종이 잘 특성화 LDLR을 포함하여 연구 사용하기 위해 현재 사용할 수있는 - / - 또는 아포 - / - 마우스 ^10-12, 이들은 살아있는 쥐 ^11-15 심혈관 기능과 형태를 평가하기위한 중요한 기술의 개발을하라는 메시지가있다. 이러한 기술은 침습적 유망한 대안을 제공 모두 MRI, PET, 콘트라스트 CT, 초음파, 고주파, 전자빔 단층 ^{2,9,17,19 포함}이러한 심장 catheterizations 및 관상 동맥 조영술 ⁽¹²⁾ 등의 방법. 그러나, 관상 동맥의 매우 작은 크기와 높은 심박수 (HR)와 쥐, 관상 동맥 순환의 이미지는 여전히 많은 현재 기술 ^4,12에 대한 기술적 인 도전을 구성한다. 흥미롭게도, 15에서 약 30 ~ 100 μm의 축 방향 해상도를 허용하는 50 MHz의 중심 주파수와 높은 주파수 배열 스캔 헤드의 개발을 포함한 흉부 심 초음파 (TTDE) 분야의 기술 발전, 기하 급수적으로 증가되고있다, 8-40mm의 깊이 및 프레임 속도보다 큰 400 / 초 프레임 - 캡처. 차례로, TTDE 기반 기술은 관상 동맥 ^{5,12-으로이} 더 크거나 더 작은 혈관을 영상화 잠재적으로 강력한 도구로 등장했다.

연구자들은 작은에서 혈관의 진단 영상 연구를 수행 할 수 또 다른 중요한 사전nimals ¹¹ 이미징 동안 마음과 동물의 호흡 속도를 유지 마취제의주의 깊게 제어를 사용하는 것이다. 제어 마취 유지 마우스에서 혈관 확장에 관련된 연구에 특히 중요하며, 마취 효과도 더욱 이러한 맥락 ^10,11 탐구 할 필요가있다. 인간에서, 반면에, TTDE 유래 CFR 측정은 주로 좌전 하행 (LAD) 관상 동맥 ^5,16에서 협착 및 비 - 방해 외막 관상 동맥의 평가보다 일반적으로 사용되는 도구가되었다. 그러나, CFR 무증상 환자 또는 휴식 보존 좌심실 수축기 기능과 마우스에서 관상 동맥 흐름 변화의 예후 역할은 훨씬 덜되어 ^(16)을 탐험했다. 따라서, 연구의 목적은 첫 ​​번째 압력 과부하 마우스 모델을 이용 TTDE 관류 량의 변화를 평가하기 위해, 명확한 단계별 프로토콜을 확립되었다; 둘째,이 연구는 예후 기호를 조사CFR 및 응답에서 관상 동맥 흐름의 변화 ificance이 마우스에 과부하 스트레스를 압박한다. 우리는 CFR 및 관상 동맥 흐름의 TTDE 기반 평가는 좌심실 기능 장애에 선행 할 수있다 관상 동맥 장애의 조기 발견에 유용 할 수 있다는 가설을 세웠다.

프로토콜

참고 : 모든 절차는 미국 수의학 협회 (AVMA) 지침에 따라 마우스의 수행 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜을 승인했다.

1. 연구 설계

1. 연구 8-10 주 오래 된 남성 C57BL / 6 마​​우스 (BW ~ 25g)를 사용합니다.
2. 두 그룹으로 마우스 (N = 11), 대동맥 밴딩 선정 연구 군을 랜덤 (N = 8)과 대조군 (n = 3) 개흉술을 통해 모의 동작을 받도록.
3. 의료 학년 제모 크림을 사용하여 가슴에서 머리를 제거하여 영상의 동물을 준비합니다.
4. (노즈콘을 통해 100 % O _2와 혼합) 1 %와 2.5 % 이소 플루 란 유도 마취의 범위 사이 일 -1 기본 매개 변수를 결정하기 위해 대동맥 밴딩에 24 시간 이전에 먼저 초음파 (2 절)을 수행합니다.
5. 의학적으로 승인 된 마취제를 선택 (즉, 이소 플루 란)과 전일비에 마취 (2-3 %를 정도를 모니터링CE, 1.0 % 유지).
   참고 : 적절한 마취는 생리 학적으로 정상 요금 (약 500 비트 / 분)에서 심장 박동의 유지에 매우 중요하다.
6. 페달 움츠림 반사에 응답하여 상기 동물에서의 움직임의 손실에 의해 마취 깊이를 확인한다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 paralube 수의사 연고를 사용합니다.
7. 0 일 ^{(20, 21)에서} 수술을 수행합니다.
8. 대동맥 밴딩, 아치에 배치 테이퍼 26 G 바늘 주위 7-0 실크 봉합사를 이용하여 대동맥을 결찰.
   주 : 대동맥 수술 절차를 포함 밴딩 실험 프로토콜에 관한 세부 사항은, 이전에 기재되어있다 ^{(20, 21).}
9. 주 (S) 2, 6, 13에서 수술 후 초음파 영상 (2 절)을​​ 수행합니다.
10. 14 일째에 마우스를 안락사 및 조직 학적 평가를위한 마음을 수확. 같은 마음과 같은 중요한 장기 제거하여 펜 토바 비탈의 과다 복용을 이용하여 동물을 안락사. diasto의 마음을 체포제작 및 포르말린으로 고정한다. 이전 ²² 설명 된 마음 수확의 절차를 사용합니다.
11. 버퍼링 10 % 포르말린 용액으로 모든 심장 조직을 수정합니다. 트리 크롬 염색의 경우, 단면 전에 파라핀 조직을 포함합니다. 물론 이전에 ^14,23 설명 된 트리 크롬 염색의 세부 사항을 사용합니다.
12. 오프라인 소프트웨어 (3 부)를 사용하여 데이터를 분석한다.

2. 이미징 프로토콜

1. 중격 관상 동맥의 길고 짧은 축 이미지 (SCA) (B- 모드)
   1. 액티브 포트에 연결된 40 MHz의 중심 주파수로 MS550D 프로브를 사용하여, "심장 이미징"에 애플리케이션 설정을 설정.
   2. 가열 된 플랫폼 및 노즈콘을 통해 제어 마취하에 동물 부정사으로 흉골 장축 뷰 (PSLAX) (도 1A)를 획득하기 위해 레일 시스템을 사용하여 프로브를 위치. 항상 동물이 데워진 플랫폼, 따뜻한 유지되어 있는지 확인m 및 체온은 생리적 수준에서 유지된다.
   3. (노치는 꼬리 쪽을 가리키는) 프로브를 시계 방향으로 회전 이러한 프로브 각도가 왼쪽 흉골 라인 (긴 축보기) (그림 1B)에 15 °이다.
   4. 화면 (도 1b)의 중심에 SCA의 전체 길이와 세로보기를 얻기 위해 프로브의 Y 축 방향으로 약간 기울여 프로브 각도를 조정한다.
   5. 적절한 랜드 마크 (대동맥 판막과 폐동맥이), 시네 저장소에게 가장 높은 프레임 속도를 사용하여 이미지를 볼 수 있습니다되면.
   6. "XY"를 사용하여 마이크로 매니퓰레이터 (그림 1D)를 축, SCA의 선명한 이미지를 얻을 수있는 프로브 위치를 조정합니다.
   7. 프로브의 홈 부분을이 중간 선 (짧은 축)의 왼쪽에되도록 시계 방향으로 (그림 1C)을 (노치는 꼬리 쪽을 가리키는) 프로브 90 ° 회전합니다.
2. SCA의 길고 짧은 축 이미지 (컬러 도플러 모전자)
   1. B 모드 이미지를 캡처 또는 시네가 저장된되면, 색 도플러 음향 창 (그림 2)를 켜 키보드의 색 도플러 키를 누릅니다.
      참고 :이 (흰색 화살표가 SCA를 표시 포함)는 긴 (그림 2A) 또는 짧은 축 (그림 2C) 관상 동맥을 분리하는 데 도움이됩니다. 빨간색은 실시간으로 볼 수 있으며 (거리 대동맥판)에서 흐름 방향을 나타낸다된다.
   2. (이미지 화면의 오른쪽에 노란색 화살표로 표시) 초점 심도가, 관상 동맥의 중심에 놓여 있는지 확인합니다.
   3. 데이터가 가장 높은 프레임 속도 (> 100 프레임 / 초)에서, 시네 매장 키를 사용하여 기록되어 있는지 확인합니다.
3. SCA의 PW 도플러 이미징 (펄스 웨이브 또는 PW 모드)
   1. 컬러 도플러 모드에있는 동안, (빨간색으로 표시 그림 2) 관상 동맥에 노란색 표시 줄을 가지고 PW 키를 누릅니다.
   2. 노란색 배치흐름의 방향성을 평행 각도로보기 관상 동맥의 중간 PW 라인. 그 속도 측정은 이미지 수집의 각도에 크게 의존합니다.
   3. 60 ° 이하이며, 샘플 량은 SCA의 중앙에 바로 유동 포착 유동 각도 (PW 앵글 키) 및 PW 각 키가되도록 샘플 볼륨 (SV 키)를 조정한다.
   4. 1 % 및 2.5 %의 이소 플루 란을 이용하여, 피크 수축기 (S) 및 심장 확장 (D) (도 3a 및 3b)에서 혈류의 속도를 나타내는 파형 형태를 캡처 시네 저장소를 사용한다.

3. 데이터 계산 및 분석

1. 속도 타임도 3a 및도 3b에 도시 된 이미지에서 피크 수축기 및 확장기 속도를 얻기 위해 적분 (VTI) 도구를 선택.
2. 충혈 (2.5 % 이소 플루 란) 피크 이완기 (F)의 비율로 관상 동맥 흐름 예비 지수 (CFR)을 계산기준에 낮은 속도 (1 % 이소 플루 란) 피크 이완기 혈류 속도.
3. 최고 수축기 혈류 속도 / 최대 이완기 혈류 속도 등의 S / D 비율을 계산합니다. 베이스 라인에서의 비율 (1 % 이소 플루 란)과 충혈에서 (2.5 % 이소 플루 란)을 결정합니다.
4. 이러한 FS, FAC, LVM 등의 표준 심장 기능의 매개 변수에 대한 독점 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하거나 쳉의 조브 용지 ² 참조하기 위해 제조업체의 설명서를 참조하십시오.

결과

몇 시간에 단일 지점에서 관찰자에 의해 연구 (줄무늬, N = 8, 가짜, N = 3), 및 적절한 재현 화상을 얻었다 된 마우스의 11 : 기준선 (D-1), D2, D6 및 D13 . 또한, 협착 부위 유속 수술 (p <0.05) 후 당일 가짜 마우스 277.5 ± 10.51 mm / s와 비교하여 110.9 mm / s ± 2,225으로 측정 하였다. 속도의 증가는 압력 과부하 모델의 성공적인 수립 검증했다. 또한 CF 속도, CFR 및 S / D 비율로 여기서 말하는 SCA 유속은 성공적 기?...

토론

이 초음파 기초 연구에서, 관상 동맥 유량의 비 침습적 평가는 라이브 재현성 실험 쥐에서, 일 동안 실시간으로 수행 하였다; 또한, 프로토콜은 초기에 존재하고 심근 관류 결핍 연관되었다 관상 동맥 장애를 검출 할 가능성을 보여 주었다. 이 방법은 궁극적으로 심혈관 질환의 위험 계층화 및 / 또는 치료 적 개입에 대한 평가 대응을위한 임상 도구로 활용 될 수있다.

먼저, ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Depilatory cream	Miltex, Inc.	Surgi-Prep	Apply 24 hours prior to imaging
Isoflurane	Baxter International Inc.	NDC 10019-773-40	2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute
	Table of equipments
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
High-frequency Mechanical Transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS250, MS550D, MS400