Farelerde Basınç Aşırı Modeli Koroner Arter Akış ve Koroner Akım Rezervi Ultrason Dayalı Değerlendirme

Özet

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Özet

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy.

During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS).

The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography.

The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Giriş

Klinik aort darlığı (AS), sol ventrikül (LV) afterload'ı ilerici artışı teşvik bilinmektedir. Bu kronik yükselen hemodinamik yük dengelemek için, LV hipertrofisi (SVH) adaptif cevap ^1,2 olarak gelişir. LVH gelişimi sıklıkla koroner mikrosirkülasyondaki anormallikler ile ilişkilidir. Bu mikrovasküler disfonksiyon bu hastalarda ⁵ kronik iskemi katkıda düşünülmektedir. Koroner akım ^3,4 ek olarak, koroner akım rezervi (CFR) koroner arterlerin ^1,3 fonksiyonel değişimi temsil eder ve temel akış hızı veya tükürük akış hızı ^4,6,7 için hiperemi maksimal akım hızı oranı olarak tanımlanır. CFR AG yeniden ^1-3,5-9 sırasında düşer, koroner disfonksiyon ^1,10,17 fonksiyonel şiddetinin ölçüde bir indeksi olarak kullanılmıştır. Bu genişlemiş kardiyomiyopati, ¹⁰ çeşitli biçimlerde ve ayrıca koroner s şekilde bozuk olduğu bilinentenosis ^6. CFR da kötü klinik sonuçlara ¹² için prognostik göstergedir.

Böyle iskemi veya LVH gibi kardiyak disfonksiyon ortamında LV remodeling da geniş fibrozis, koroner arterlerin ^1,2 koroner mikrosirkülasyondaki ve kalınlaşma değişiklikler eşlik eder. Koroner fizyolojisinde Bu değişikliklerin bir sonucu olarak, koroner arter olası yeniden şekillenme vardır. Bu düşük oksijen difüzyon ve miyokard iskemi ^1,2,13 yatkınlık neden olabilir LV diyastolik disfonksiyon etkilerini azaltmaya yardımcı olur.

Genetiği değiştirilmiş fareler gibi koroner ateroskleroz ^5,7,10,12,17 şimdi insan hastalık koşullarını taklit için yaygın olarak yaygın araştırma araçtır. Özellikle farelerde basınç aşırı modeli yaygın ^14,17 çalışılmıştır. Trans-aort daralma modeli (TAC) geniş fibroz ve olarak koroner ile ilişkili olduğu gösterilmiştirY darlığı koroner arterlerin medial kalınlaşma ve insanlarda LVH ayar görülene çok benzer koroner akım formları ^1,11,17,19 değişiklikleri eşlik eden, kısmen, elde edilen. Bu uzun süreli basınç aşırı yaklaşık 4-8 ​​hafta içinde dekompanse kalp yetmezliğine yol açtığı bilinmekle birlikte, bantlama sonra koroner akım dinamikleri ve erken hastalık ilerlemesi sürecinde bu modellerde akım rezervi, ve farklı aşamalarında etkileri, henüz açıkça tarif edilecek.

Farelerin çok sayıda suşları iyi karakterize LDLR dahil olmak üzere araştırma kullanımı, şu anda mevcuttur - / - veya ApoE - / - fareler ^10-12, ve bu canlı farelerde ^11-15 kardiyovasküler fonksiyonu ve morfolojisi değerlendirmede hassas tekniklerin geliştirilmesini teşvik etmiştir. Bu tür teknikler invaziv umut verici alternatifler sunmak hepsi MRG, PET, kontrast BT, yüksek frekanslı ultrason, ve elektron ışın tomografi ^2,9,17,19 dahilkardiyak kateterizasyon ve koroner anjiyografi ¹² gibi yöntemler. Ancak, koroner arterlerin çok küçük boyutu ve yüksek kalp hızı (KH) ile farelerde, koroner dolaşım görüntüleme hala birçok mevcut tekniklerin ^4,12 için bir teknik sorun oluşturmaktadır. İlginçtir, 15 yaklaşık 30-100 mikron eksenel kararlar sağlayan 50 MHz merkez frekansları yüksek frekanslı dizi tarama kafaları geliştirilmesi de dahil olmak üzere transtorasik Doppler ekokardiyografi (TTDE) alanında teknik ilerlemeler, bir üstel artış olmuştur, 8-40 mm derinliklerinde, ve kare hızlarında fazla 400 / sn kare ele geçirdi. Buna karşılık, TTDE-tabanlı teknikler koroner arterler ^5,12 olarak ² büyük veya daha küçük damarları görüntüleme için bir potansiyel olarak güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır.

Araştırmacılar, küçük a vasculaturenin tanısal görüntüleme çalışmaları yürütmek için izin verdi bir başka kritik avansnimals ¹¹ görüntüleme sırasında kalp ve hayvanların solunum hızını korumak anestezik dikkatle kontrol kullanılmasıdır. Kontrollü anestezi bakım farelerde vazodilatasyon ile ilgili çalışmalar için özellikle önemlidir, ve anestezi etkisi daha da bu bağlamda ^10,11 keşfedilmeyi gerekmektedir. İnsanlarda, diğer taraftan, TTDE türetilmiş CFR ölçümleri esas olarak sol ön inen (LAD) koroner arter ^5,16 olarak, tıkalı olmayan engel epikardiyal koroner arterlerde değerlendirilmesi için daha yaygın olarak kullanılan bir araç haline gelmiştir. Ancak, CFR ve asemptomatik hastalarda veya istirahatte korunmuş sol ventrikül sistolik fonksiyonu farelerde koroner akım değişiklikleri prognostik rolü çok daha az olmuştur ¹⁶ araştırdı. Bu nedenle, çalışmanın amacı, ilk bir basınç aşırı fare modelinde TTDE kullanarak koroner akım değişiklikleri değerlendirmek için, net bir adım-adım protokolü kurmak oldu; İkinci, bu çalışma prognoz işareti incelenmiştirCFR ve tepki koroner akım değişiklikleri ificance bu farelerde aşırı stres baskı yapmak. Biz CFR ve koroner akım TTDE dayalı değerlendirme LV disfonksiyonu önce olabilir koroner fonksiyon bozukluğunun erken tanısında yararlı olabileceğini varsaydık.

Protokol

NOT: Tüm işlemler Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (AVMA) kurallarına uygun olarak farelerde yapılan ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) protokolleri onaylandı.

1. Çalışma Tasarımı

1. Çalışmaya 8-10 haftalık erkek C57BL / 6 fareleri (BW ~ 25 g) kullanın.
2. İki gruba fareler (n = 11), aort bantlama için seçilen çalışma grubu Rastgele (n = 8), ve kontrol grubu (n = 3) torakotomi yoluyla sahte ameliyat için.
3. Tıbbi sınıf olan tüy dökücü krem ​​kullanarak göğüs saç kaldırarak görüntüleme için hayvan hazırlayın.
4. (Roket ucu konisi üzerinden% 100 O ₂ ile karışık)% 1 ve% 2.5 izofluran bağlı anestezi aralığında, Gün -1 de temel parametrelerini belirlemek için aort bantlama 24 saat önce birinci ultrason (bölüm 2) yapın.
5. Tıbben onaylanmış anestezik ajan seçin (örneğin izofluran) ve indu anestezi (% 2-3 derecesini izlemekCE ve% 1.0 korumak için).
   NOT: Uygun anestezi normal fizyolojik oranları (yaklaşık 500 atım / dk) kalp atım bakım çok önemlidir.
6. Bir pedal çekilme refleksi tepki olarak hayvandan hareket kaybı anestezi derinliği onaylayın. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze paralube veteriner merhem kullanın.
7. Gün 0 ^20,21 de ameliyat.
8. Aort bantlama için, kemer üzerine yerleştirilen konik 26 G iğne etrafında 7-0 ipek sütür kullanılarak aort Arter.
   NOT: Cerrahi aort bantlama prosedürleri de dahil olmak üzere deneysel protokol, ilgili Detaylar, daha önce ^20,21 tarif edilmiştir.
9. Gün (ler) 2, 6 ve 13 yaşında ameliyat sonrası ultrason görüntüleme (bölüm 2) yapın.
10. Gün 14 fareler Euthanize ve histolojik değerlendirme için kalpleri hasat. Kalp gibi hayati bir organ uzaklaştırılarak elde edilmiş aşırı dozda pentobarbital kullanılarak hayvanlar öldürülür. Diasto kalpleri Arrestle ve formalin ile sabitleyin. Daha önce ²² tarif edilmiştir kalp hasat yordamı kullanın.
11. Tamponlu% 10 formalin solüsyonu ile tüm kalp dokuları Fix. Trichrome boyama için, kesit önce parafin dokuların embed. Daha önce de ^14,23 gösterilmiş olan trichrome boyama ayrıntılarını kullanın.
12. Çevrimdışı yazılım (bölüm 3) kullanarak verileri analiz.

2. Görüntüleme Protokolü

1. Septal koroner arter Uzun ve kısa eksen görüntüleri (SCA) (B- Modu)
   1. Aktif-porta bağlı 40 MHz merkez frekansı ile MS550D prob kullanarak, "kardiyak görüntüleme" uygulama ön ayarı ayarlayın.
   2. Isıtmalı platformda, ve burun konisi ile kontrol anestezi altında hayvan sırtüstü ile, parasternal uzun eksen görünümü (PSLAX) (Şekil 1A) elde etmek raylı sistemi kullanarak probu yerleştirin. Her zaman hayvan prewarmed platfor sıcak tutulmasını sağlamakm ve vücut sıcaklığı, fizyolojik düzeyde muhafaza edilmektedir.
   3. (Çentik kaudal bakacak şekilde) prob saat yönünde çevirin böyle prob açısı sol parasternal hat (uzun eksen görünümü) (Şekil 1B) 15 ° olduğunu.
   4. Ekran (Şekil 1B) merkezinde, SCA, tam uzunlukta uzunlamasına bir görünüm elde etmek için prob y ekseni boyunca hafifçe eğerek sistemi açısını ayarlayın.
   5. Uygun görülecek (aort kapağı ve pulmoner arter), sine dükkanını mümkün olan en yüksek kare hızı-kullanarak görüntüyü inceledi kez.
   6. "Xy" kullanarak mikro-manipülatörler (Şekil 1D) eksenlerinde, SCA net görüntüsünü elde etmek için prob konumunu ayarlamak.
   7. Prob çentikli ucu orta hat (kısa eksen) sol olacak şekilde saat yönünde (Şekil 1C) (çentik kaudal bakacak şekilde) prob 90 ° döndürün.
2. SCA uzun ve kısa eksen görüntüleri (Renkli Doppler Mode)
   1. B Modu görüntü yakalanır veya sine-saklanır sonra, renkli Doppler akustik pencerede (Şekil 2) açmak için klavyedeki renkli Doppler anahtarını tıklatın.
      NOT: Bu (beyaz ok SCA gösterir) ya uzun (Şekil 2A) ya da kısa eksen (Şekil 2C) koroner arter izole etmek için yardımcı olur. Kırmızı renk gerçek zamanlı olarak görülen ve (uzak aort kapak itibaren) akış yönüne göstergesidir edilir.
   2. (Görüntü ekranının sağ sarı ok ile gösterilen) odak derinliği, koroner arter merkezinde yatıyor emin olun.
   3. Veri mümkün olan en yüksek kare hızı (> 100 kare / sn) ile, sine-mağaza tuşunu kullanarak, kaydedilen emin olun.
3. SCA PW Doppler Görüntüleme (Darbeli-Dalga veya PW Modu)
   1. Renkli Doppler modunda iken, (kırmızı ile gösterilen Şekil 2) koroner arter üzerinde sarı-gösterge hattı getirmek için PW tuşuna tıklayın.
   2. Sarı yerleştirinAkış yönünü paralel bir açı görünümü koroner arter orta PW hattı. Bu hız ölçümleri görüntü elde açısı son derece bağlı olduğunu unutmayın.
   3. 60 ° veya daha az ve örnek hacmi SCA merkezine doğru akış yakalar akış açısını (PW açı anahtarı) ve PW açı anahtarı olacak şekilde numune hacmi (SV tuşu) ayarlayın.
   4. % 1 ve% 2.5 izofluran kullanılarak, zirve sistol, (S) ve sistol (D) (Şekil 3A ve 3B), koroner akış hızını göstermektedir dalga formları yakalamak için sine deposu kullanın.

3. Veri Hesaplama ve Analizi

1. Hız zamanı Şekil 3A ve 3B gösterilen resimlerden zirve sistolik ve diyastolik hızları elde etmek için ayrılmaz (VTI) aracını seçin.
2. Hiperemik (% 2.5 izofluran) zirve diyastolik f oranı olarak koroner akım rezervi indeksi (CFR) hesaplayınbaşlangıca düşük hız (% 1 izofluran) zirve diyastolik akım hızı.
3. Zirve sistolik koroner akım hızı / pik diyastolik koroner akım hızı olarak S / D oranı hesaplayın. Başlangıçta oranı (% 1 izofluran) ve hiperemi de (% 2.5 izofluran) belirleyin.
4. Böyle FS, FAC, LVM gibi standart kardiyak fonksiyon parametreleri için özel bir yazılım kullanarak veri analizi gerçekleştirmek veya Cheng vallahi kağıdı ² başvurmak için üreticiden kılavuzlarına bakın.

Sonuçlar

Bir kaç zaman noktasında tek bir gözlemci tarafından incelenmiştir (bantlı, n = 8 ve taklit, n = 3), uygun ve tekrar görüntü elde edilmiş olan 11 Fareler: başlangıçta (D-1), D2, D6 ve D13 . Ayrıca, sıkıştırıcı yerinde akış hızı cerrahi (p <0,05) bir gün sonra plasebo farelerin 277,5 ± 10.51 mm / s ile karşılaştırıldığında 110.9 mm / s ± 2.225 olarak ölçülmüştür. hız artışı basıncı aşırı modelinin başarılı kurulması doğrulama oldu. Ayrıca CF hız, CFR, ve S / D o...

Tartışmalar

Bu ultrason tabanlı çalışmada, koroner akım non-invaziv bir değerlendirme tekrarlanabilir canlı deneysel farelerde, gün boyunca, gerçek zamanlı olarak yapıldı; ayrıca, protokol erken bir aşamada bulunan ve miyokard perfüzyon yetersizliği ile ilişkili koroner arter disfonksiyonu tespit potansiyeli gösterdi. Bu yöntem sonuçta kardiyovasküler risk belirlenmesi ve / veya terapötik müdahaleye değerlendirilmesi yanıt klinik bir araç olarak kaldıraçlı olabilir.

İlk ola...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Depilatory cream	Miltex, Inc.	Surgi-Prep	Apply 24 hours prior to imaging
Isoflurane	Baxter International Inc.	NDC 10019-773-40	2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute
	Table of equipments
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
High-frequency Mechanical Transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS250, MS550D, MS400