Valutazione Ecografia base di coronaropatia Flow e flusso coronarico Reserve Utilizzando la pressione Sovraccarico modello nei topi

Riepilogo

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Abstract

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy.

During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS).

The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography.

The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Introduzione

Clinical stenosi aortica (AS) è ben noto per promuovere un progressivo aumento del ventricolo sinistro (LV) post-carico. Per compensare questo carico emodinamico cronicamente in aumento, ipertrofia ventricolare sinistra (IVS) ne consegue come ^1,2 risposta adattativa. Lo sviluppo di IVS è spesso associata ad anomalie nel microcircolo coronarico. Si pensa che la disfunzione microvascolare contribuisce a ischemia cronica in questi pazienti ^5. Oltre a flusso coronarico ^3,4, riserva di flusso coronarico (CFR) rappresenta modifica funzionale delle arterie coronarie ^1,3 ed è definito come il rapporto tra la velocità di flusso massima in iperemia alla velocità di flusso basale o di riposo flusso velocità ^4,6,7. CFR diminuisce durante LV rimodellamento ^1-3,5-9 ed è usato come indice del grado di severità funzionale della disfunzione coronarica ^1,10,17. E 'noto per essere compromessa in molte forme di cardiomiopatia dilatativa ¹⁰ e anche s coronarichetenosis ^6. CFR è anche un marker prognostico per i poveri risultati clinici ^12.

Rimodellamento LV nella cornice di una disfunzione cardiaca, come ischemia o LVH è accompagnato anche da una fibrosi, cambiamenti nel microcircolo coronarico e l'ispessimento delle arterie coronarie ^1,2. Come risultato di questi cambiamenti nella fisiologia coronarica, è probabile rimodellamento delle arterie coronarie. Questo aiuta a mitigare gli effetti della bassa diffusione di ossigeno e disfunzione diastolica ventricolare sinistra che potrebbe provocare suscettibilità alla miocardica ischemia ^1,2,13.

I topi geneticamente modificati sono ormai uno strumento di sperimentazione ampiamente prevalente per mimare patologie umane, come l'aterosclerosi coronarica ^{5,7,10,12,17.} Particolarmente il modello sovraccarico pressorio nei topi è stato ampiamente studiato ^14,17. Il modello di costrizione trans-aortica (TAC) ha dimostrato di essere associato con estesa fibrosi, e coronary stenosi conseguente, in parte, da ispessimento mediale delle arterie coronarie e con accompagnamento di cambiamenti nei modelli di flusso coronarico ^1,11,17,19 simile a ciò che si vede nel setting di IVS in esseri umani. Mentre è noto che il sovraccarico di pressione prolungata porta a insufficienza cardiaca scompensata in circa 4-8 settimane, gli effetti sulla dinamica del flusso coronarico e riserva di flusso in questi modelli, nelle prime fasi del processo di progressione della malattia, e nelle diverse fasi dopo banding, sono ancora essere chiaramente delineata.

Numerosi ceppi di topi sono attualmente disponibili per scopi di ricerca, tra cui ben caratterizzato LDLR - / - o ApoE - / - mice ^10-12, e questi hanno spinto lo sviluppo di tecniche sensibili per valutare la funzione cardiovascolare e la morfologia nei topi che vivono ^11-15. Tali tecniche includono MRI, PET, contrasto CT, ultrasuoni ad alta frequenza e fascio elettronico tomografia ^2,9,17,19, tutti che forniscono alternative promettenti invasivametodi come catheterizations cardiaco e angiografia coronarica ^12. Tuttavia, in topi con dimensioni molto piccole delle arterie coronarie e frequenza cardiaca elevata (HR), l'imaging di circolazione coronarica costituisce ancora una sfida tecnica per molte tecniche attualmente disponibili ^4,12. È interessante notare che c'è stato un aumento esponenziale progressi tecnici nel campo della transtoracica Doppler (TTDE), compreso lo sviluppo di teste di scansione gamma ad alta frequenza con frequenze centrali da 15 a 50 MHz permette risoluzioni assiali di circa 30-100 micron, a profondità di 8-40 mm, e frame rate superiore a 400 fotogrammi catturati / sec. A sua volta, tecniche basate TTDE-sono emersi come uno strumento potenzialmente potente per l'imaging grandi ² o ancora più piccoli vasi, come le arterie coronarie ^5,12.

Un altro progresso fondamentale che ha permesso ai ricercatori di condurre studi di diagnostica per immagini del sistema vascolare in piccolo unnimals è l'uso attentamente controllata di anestetici che mantengono il cuore e la frequenza respiratoria degli animali durante l'imaging ^11. Manutenzione dell'anestesia controllata è particolarmente importante per gli studi relativi alla vasodilatazione nei topi, e l'effetto dell'anestesia deve inoltre essere ulteriormente esplorato in questo contesto ^10,11. Nell'uomo, invece, misurazioni CFR TTDE-derivati ​​sono diventati uno strumento più comunemente usato per la valutazione delle arterie coronarie epicardiche stenotiche e non ostacolato, prevalentemente discendente anteriore sinistra (LAD) arteria coronaria ^5,16. Tuttavia, il ruolo prognostico di CFR e cambiamenti flusso coronarico nei pazienti asintomatici o topi con preservata funzione sistolica LV a riposo è stato molto meno esplorato ^16. Pertanto, lo scopo dello studio era quello di stabilire prima un protocollo chiaro passo-passo, per valutare le variazioni di flusso coronarico utilizzando TTDE in un modello di topo di pressione di sovraccarico; secondo, questo studio ha esaminato il segno prognosticoificance di CFR e cambiamenti del flusso coronarico in risposta alla pressione di stress da sovraccarico in questi topi. Abbiamo ipotizzato che la valutazione in base TTDE di CFR e del flusso coronarico può essere utile per la diagnosi precoce di disfunzione coronarica che può precedere disfunzione ventricolare sinistra.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in topi in accordo con American Veterinary Medical Association (AVMA) le linee guida e approvati Istituzionale cura degli animali e Usa Comitati (IACUC) protocolli.

1. Disegno dello studio

1. Utilizzare 8-10 settimana vecchio maschio C57BL / 6 topi (BW ~ 25 g) nello studio.
2. Randomizzare topi (n = 11) in due gruppi, il gruppo di studio selezionato per bande aortico (n = 8), e il gruppo di controllo (n = 3) sottoporsi operazione sham via toracotomia.
3. Preparare l'animale per l'imaging dalla depilazione petto con crema depilatoria che è di grado medico.
4. Eseguire una prima ultrasuoni (sezione 2) 24 ore prima bendaggio aortico per determinare i parametri di base al giorno -1, tra una gamma di 1% e 2,5% isoflurano (miscelato con 100% O ₂ tramite nosecone) anestesia indotta.
5. Scegli un anestetico medicalmente approvato (cioè isoflurano) e monitorare il grado di anestesia (2-3% a induce, e 1,0% per mantenere).
   NOTA: anestesia corretta è fondamentale per il mantenimento della battito cardiaco a tassi fisiologici normali (circa 500 battiti / min).
6. Conferma la profondità di anestesia da perdita di movimento dall'animale in risposta ad un riflesso pedale recesso. Utilizzare paralube pomata veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
7. Eseguire l'intervento chirurgico al Giorno 0 ^20,21.
8. Per banding aortico, legare l'aorta con una sutura 7-0 seta intorno ad un rastremato 26 G ago inserito sull'arco.
   NOTA: I dettagli riguardanti il protocollo sperimentale, comprese le procedure chirurgiche bendaggio aortiche, sono stati descritti in precedenza ^20,21.
9. Eseguire post-chirurgia ad ultrasuoni di imaging (sezione 2) a Day (s) 2, 6 e 13.
10. Eutanasia i topi al giorno 14 e raccogliere i cuori per la valutazione istologica. Euthanize gli animali con una overdose di pentobarbital seguita dalla rimozione di un organo vitale come il cuore. Arrestate i cuori in diastole e fissare con formalina. Utilizzare la procedura di raccolta del cuore che è stato descritto in precedenza ^22.
11. Fissare tutti i tessuti del cuore con tamponata formalina al 10%. Per la colorazione tricromica, incorporare tessuti in paraffina prima sezionamento. Utilizzare i dettagli di colorazione tricromica che sono stati ben illustrato in precedenza ^14,23.
12. Analizzare i dati utilizzando il software offline (sezione 3).

2. Imaging Protocol

1. Immagini lunghe e corte degli assi del setto coronarica (SCA) (Modalità B-)
   1. Utilizzando la sonda MS550D con frequenza centrale di 40 MHz collegati alla porta attiva, impostare il preset applicazione di "imaging cardiaco".
   2. Con la supina animale sulla piattaforma riscaldata, sotto anestesia e controllato tramite cono, posizionare la sonda con il sistema ferroviario avere la vista parasternale asse lungo (PSLAX) (Figura 1A). Verificare sempre che l'animale è tenuto caldo sul platfor preriscaldatam e la temperatura corporea è mantenuta a livelli fisiologici.
   3. Ruotare la sonda (con tacca rivolta caudalmente) in senso orario in modo che l'angolo della sonda è di 15 ° rispetto alla linea di sinistra parasternale (lungo l'asse view) (Figura 1B).
   4. Regolare l'angolo della sonda inclinando leggermente lungo l'asse y della sonda per ottenere un full-length vista longitudinale della SCA al centro dello schermo (Figura 1B).
   5. Una volta che i punti di riferimento adeguati (valvola aortica e l'arteria polmonare) sono visti, negozio cine l'immagine utilizzando il più alto frame-rate possibile.
   6. Usando il "xy" assi micro-manipolatori (Figura 1D), regolare la posizione della sonda per ottenere l'immagine più chiara della SCA.
   7. Ruotare la sonda di 90 ° (con tacca rivolta caudalmente) in senso orario in modo che estremità del modulo sonda è a sinistra della linea mediana (asse corto) (Figura 1C).
2. Immagini lunghe e corte assi di SCA (Color-Doppler Mode)
   1. Una volta che l'immagine modalità B viene catturata o memorizzato cine-fare clic sul tasto di colore Doppler sulla tastiera per attivare il color Doppler finestra acustica (Figura 2).
      NOTA: Questo aiuta ad isolare coronarica (freccia bianca indica SCA) sia a lungo (Figura 2A) o in asse corto (Figura 2C). Colore rosso è come visto in tempo reale ed è indicativo della direzione del flusso (lontano dalla valvola aortica).
   2. Assicurarsi che il centro di profondità (indicato da una freccia gialla sulla destra dello schermo dell'immagine), si trova nel centro di arteria coronaria.
   3. Assicurarsi che i dati vengono registrati, con il tasto cine-store, al più alto frame rate possibile (> 100 fotogrammi / sec).
3. PW Doppler Imaging di SCA (Pulsed-Wave o modalità PW)
   1. In modalità color-Doppler, clicca sul tasto PW per aprire una linea gialla-indicatore coronaria (Figura 2, mostrato in rosso).
   2. Posizionare il gialloLinea PW nel mezzo dell'arteria coronaria in vista, ad un angolo che porta alla direzionalità del flusso. Si noti che le misure di velocità sono altamente dipendente dall'angolo di acquisizione dell'immagine.
   3. Regolare l'angolo di flusso (Rif angolo PW) e il volume del campione (Rif SV) tale che l'angolo di chiave PW è di 60 ° o meno ed il volume del campione cattura fluire nel centro della SCA.
   4. Utilizzare deposito cine per catturare le forme d'onda che indicano la velocità del flusso coronarico al picco sistole (S) e diastole (D) (Figure 3A e 3B), usando 1% e 2,5% isoflurano.

3. Calcolo dei dati e analisi

1. Selezionare il tempo di velocità integrale (VTI) strumento per ottenere la sistolica di picco e velocità diastolica rispetto alle immagini riportate nelle Figure 3A e 3B.
2. Calcolare l'indice di riserva di flusso coronarico (CFR) come il rapporto di iperemia (2,5% isoflurano) di picco diastolico fbassa velocità di linea di base (1% isoflurano) velocità di flusso diastolica di picco.
3. Calcolare il rapporto S / D, come la velocità di picco di velocità di flusso coronarico sistolica / diastolica picco flusso coronarico. Determinare il rapporto al basale (1% isoflurano) e iperemia (2,5% isoflurano).
4. Per i parametri standard cardiaci funzionali quali FS, FAC, LVM, consultare i manuali del costruttore per eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software proprietario o fare riferimento a Giove carta di Cheng ^2.

Risultati

Delle 11 topi che sono stati studiati (hanno legato, n = 8 e fittizie, n = 3), sono stati ottenuti immagini adeguate e riproducibili da un singolo osservatore in diversi punti temporali: al basale (D-1), D2, D6 e D13 . Inoltre, la velocità di flusso nel sito costrittiva è stata misurata come 2225 ± 110,9 millimetri / s, rispetto a 277,5 ± 10,51 millimetri / s nei topi sham il giorno dopo l'intervento (p <0.05). L'aumento della velocità è la verifica dello stabilimento successo del modello sovraccarico d...

Discussione

In questo studio basato ultrasuoni, la valutazione non invasiva del flusso coronarico è riproducibile eseguita in tempo reale, per giorni, nei topi sperimentali vivi; Inoltre, il protocollo ha dimostrato la capacità di rilevare la disfunzione coronarica arteria che era presente in una fase iniziale ed è stata associata a deficit di perfusione miocardica. Questo metodo potrebbe in definitiva essere sfruttato come strumento clinico per la stratificazione del rischio cardiovascolare e / o la risposta a valutare un inter...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Depilatory cream	Miltex, Inc.	Surgi-Prep	Apply 24 hours prior to imaging
Isoflurane	Baxter International Inc.	NDC 10019-773-40	2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute
	Table of equipments
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
High-frequency Mechanical Transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS250, MS550D, MS400